Expressão Mammalian Cell eficiente e de uma etapa de purificação extracelular glicoproteínas para a cristalização

Resumo

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Resumo

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

Introdução

Compreender a estrutura da proteína em nível atômico é a chave para desvendar a base molecular das vias biológicas e as doenças. Cristalografia de raios X da proteína é o método mais amplamente utilizado / aplicável para a determinação de estruturas macromoleculares. O principal desafio deste método é a obtenção de quantidades suficientes de devidamente dobradas, proteína pura. Isto torna-se um problema particular quando se trabalha com as proteínas secretadas de mamíferos, que sofrem modificações pós-tradução específicos.

Proteínas expressas em bactérias, são a fonte primária das proteínas cristalizadas depositadas no Protein Data Bank ^1. Os sistemas de expressão bacterianos são largamente preferidos porque são rápidos, baratos e geralmente produzem rendimentos elevados de proteína. No entanto, os domínios extracelulares de proteínas de mamífero expressas em bactérias muitas vezes não são correctamente dobrado, em que são necessárias caso de redobragem e purificação extensa passos para a obtenção de forma homogénea folded proteína. Além disso, muitas proteínas de mamíferos necessitam de glicosilação pós-tradução para atingir a dobragem correcta ^2. Embora a expressão e a glicosilação em células de levedura ou de insecto pode ultrapassar o problema de dobragem, modificações pós-traducionais, incluindo a glicosilação, são significativamente diferentes das células de mamífero de ^3, obtendo-se as proteínas com alterações incorrectos ou não-homogéneas.

As células de mamífero expressam toda a maquinaria molecular necessário para assegurar modificações pós-traducionais apropriadas e dobragem; No entanto, esses sistemas de expressão não são tipicamente preferido pela maioria dos laboratórios, devido a rendimentos limitados e os elevados custos de reagentes e materiais de consumo. A polietilenoimina (PEI), um reagente de transfecção padrão é relativamente barato, mas impõe citotoxicidade considerável e baixa eficiência de transfecção, o que resulta em aumento de custos em meio celular, ADN, e equipamentos de cultura. Muitas alternativas para PEI são proibitivamente caras. Abordamosestes problemas, descrevendo uma combinação de melhoria das ferramentas de cultura de células e quimicamente modificados de PEI para o método rápido e relativamente barato para a expressão de proteínas de mamífero secretada, seguido por purificação de um só passo. Este método dá rendimentos robusta suficientes para estudos funcionais e bioquímicos ^4, e, em alguns casos, resulta em proteína passível de cristalização sem purificação adicional.

Este protocolo descreve várias técnicas para maximizar a expressão e para produzir as proteínas segregadas em mamíferos humano de rim embrionário (HEK 293F) células crescidas em suspensão. Eficiência de transfecção (e custo), a produção e purificação de proteínas são todos bastante reforçada, seguindo este protocolo. PEI modificada pela adição de carbamatos por meio de uma reacção de abertura do anel de um único passo (PEI-TMC-25, síntese e propriedades descritas em detalhe na ref ⁵⁾ melhora a eficiência da transfecção, reduz a citotoxicidade de catiónicoda ruptura da membrana e, consequentemente, reduz os custos da experiência. Além disso, a viabilidade das células e expressão de proteínas são grandemente melhorada com a adição de suplementos de cultura para fornecimento de glucose e vitaminas. É importante para a produção de proteínas glicosiladas, o tratamento com kifunensine, um inibidor químico não-tóxico de manosidase I, produz proteínas com definidas, glicanos imaturos, que podem ser removidos pelo EndoHf endoglicosidase para produzir proteínas com um único N-acetilglucosamina em lugar de um de comprimento completo ⁶ glicano N-ligado. Finalmente, a secreção de proteínas em, num meio quimicamente definido isento de soro permite a purificação rápida e fácil para estudos estruturais e bioquímicos. Um único passo de níquel-ácido nitriloacético (Ni-NTA) purificação resina remove a maioria das espécies contaminantes no sobrenadante e, em alguns casos, pode originar proteínas com uma pureza suficiente para a cristalização.

Protocolo

1. Produção de miligramas As quantidades de DNA de plasmídeo para a transfecção transitória em grande escala

1. Clone da proteína de interesse em um número elevado de cópias de mamífero vector de expressão de clonagem utilizando local de restrição, ou outra técnica adequada.
   1. Para melhores resultados, use pHLsec ⁷ vetor, que tem um built-in 6His-tag C-terminal, uma seqüência Kozak promotor forte e um sinal de secreção otimizado.
2. Transformar o plasmídeo para células competentes.
   1. Adicionar 20 ul de células competentes de E. coli em 1 ug de ADN plasmídeo e incubar em gelo durante 30 min.
   2. Células de choque térmico a 42 ° C durante 35 seg, depois incubar em gelo durante 2 min.
   3. Adicionar 300 ul de meio de crescimento microbiano (SOC) e incubar a 37 ° C durante 45 min, agitando a 220 rpm.
   4. Células da placa na placa de agar com selecção antibiótico apropriado.
      1. Use 100 ug / ml de carbenicilina se o plasmídeo é no vector pHLsec.
3. Colónias da cultura em 250 ml de Caldo de Luria (LB) suplementado com meios 100 ug / ml de antibiótico (carbenicilina) O / N a 37 ° C, agitação a 220 rpm.
4. Purificar o DNA de cultura utilizando Kit Hi-Speed ​​Plasmid Maxi acordo com o protocolo do fabricante.
   1. Elui-se o ADN em tampão de EB (Tris 10 mM-Cl, pH 8,5), em vez de tampão TE.
   2. Alíquota do plasmídeo purificado a quantidade necessária para a transfecção e armazenar a -20 ° C.

2. grande escala Cultura e Transient transfecção de células 293F

1. Suplemento de meio 1 L 293F com 10 ml de glutamina e 5 mL de Pen / Strep (ambos 100x). Armazenar a 4 ° C. 5 mL de Pen / Strep é uma força suficiente em condições isentas de soro e a concentração de antibiótico reduzida melhora a viabilidade das células durante a transfecção, o que melhora o rendimento de proteína.
2. Cultura células 293F em 300 ml de mídia em 1 L de policarbonato perplexo Erlenmeyers com tampa ventiladas a 37 ° C com _8% de CO2, enquanto agitação num incubador de cultura de tecido padrão.
3. Dilui-se as células a 5 x 10 ⁵ / ml de densidade um dia antes da transfecção.
4. No dia da transfecção, suplemento de meio de cultura, adicionando 10% de volume de 2% w / v de impulso celular em meios 293F.
   1. Medir a concentração de glicose utilizando um monitor de glucose de acordo com as instruções do fabricante e suplementos uso como necessário para alcançar uma concentração de glucose de 500 mg / dL.
5. Adicionar kifunensine (1 ug / ml de concentração final) nesta etapa de controlar a glicosilação de proteínas.
6. Calcular o volume de ADN necessária para 1 ug de plasmídeo por 1 x 10 ⁶ células. Sob condições estéreis, dilui-se ADN em meio isento de soro de 5 ml.
7. Calcular o volume de reagente de transfecção necessária para 1 ug de plasmídeo por 2 mL de reagente de transfecção. Sob condições estéreis, dilui-se o reagente de transfecção (PEI-TMC-25) em meio isento de soro de 5 ml.
8. Adicionaro reagente de transfecção de ADN em solução em incrementos de 1 ml, misturando suavemente. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente para os complexos ADN-reagente para formar. Em seguida, adicione a solução sobre as células de um modo gota a gota.
9. Permitir que as células transfectadas para expressar a proteína de 72-96 horas. Suplemento com ~ 10% de aumento do volume celular de mídia diariamente, ou como necessário para manter a glicose lendo 400-600 mg / dl.

3. Purificação

1. Decantar a cultura para um frasco de centrífuga, centrífuga durante 20 min a 1300 xg para sedimentar as células e em seguida, recolher o sobrenadante. Se necessário, girar uma segunda vez e / ou usar filtro de 0,22 um para clarificar o sobrenadante.
2. Adicionar 10% de tampão de ligação 10 x o volume de Ni-NTA (1,5 M de NaCl, 0,5 MK ₂ HPO _4, 0,1 M de Tris pH 8,5, imidazole 50 mM).
3. Prepara-se uma coluna de gravidade através da adição de 2 ml de suspensão de Ni-NTA de uma coluna e equilibrando com 10 volumes de coluna (CV) de tampão de ligação 1x. Se possível, fazer todos os passos de coluna em uma sala de 4 ° C. Alternatively, proteína frio e todos os buffers em gelo antes do passo da coluna e manter a proteína e recolhidos flow-through em gelo.
   Nota: suspensão de Ni-NTA é resina de 50% em volume e capacidade de ligação do dito fabrico é de 50 mg / ml. Pérolas de Ni-NTA pode ser re-carregada para usos múltiplos
4. Fluir o sobrenadante sobre a resina e recolher flow-through. Repita este passo.
5. Lava-se com 10 VC de tampão de lavagem (300 mM NaCl, 50 mM de K ₂ HPO _4, 20 mM de imidazol, pH 8).
6. Eluir a proteína em 5 VC de tampão de eluição (NaCl 300 mM, 50 mM de K ₂ HPO _4, imidazole 250 mM, pH 8).
7. Se deglycosylation é necessário:
   1. Para um volume final de 0,5 ml, concentrado eluato para 0,43 ml, utilizando um concentrador de centrifugao. Se se formam precipitados, sedimentar quaisquer detritos por centrifugação a 16.000 xg e 4 ° C.
   2. Adicionar 50 ul de 500 mM de Na-citrato, pH 5,5.
   3. Adicionar 20 ul de EndoHf (1 x 10 ⁶ U / mL). Incubar à temperatura ambiente durante 2 h.
      NãoE: A enzima funciona optimamente a 37 ° C, o que pode fazer com que a proteína concentrada para se agregar. Estender a incubação à temperatura ambiente, se desglicosilação, avaliada por SDS-PAGE ou imunotransferência, é incompleta. A enzima não tem actividade a 4 ° C.
   4. Para remover EndoHf: Lavar 3x resina de amilose em tampão fosfato salino (PBS), ou tampão de armazenamento final. Incubar proteína com a resina durante 1 hora a 4 ° C. Gire 5 min a 1000 xg para sedimentar pérolas e recolher o sobrenadante.
   5. Concentrado de proteína utilizando filtro molecular apropriado centrifugação corte de peso e troca de tampão para tampão de armazenamento (150 mM de NaCl e 20 mM de HEPES pH 7,5).

Resultados

Aqui a seguir os resultados deste sistema de expressão aplicada a um domínio segregado 13 kDa imunoglobulina (Ig) a partir da proteína do receptor humano provocando expresso em células mielóides (2 hTREM2, resíduos 19-132). Trem2 é uma proteína transmembranar do tipo I contendo um único domínio Ig extracelular que tem duas ligações de dissulfureto e dois locais de glicosilação N-ligados. Ao contrário de muitas outras proteínas de domínio Ig ^8, trem2 não era passível de redobramento de corpo...

Discussão

Células HEK 293F oferecer a produção de proteínas que requerem robusta modificações pós-traducionais. Este sistema permite a expressão rápida e escalável de proteínas nativamente dobradas contendo persulfuretos, glicosilação e fosforilação que seriam ausente usando mais ferramentas de expressão de rotina. Além disso, este sistema pode ser usado para a expressão e purificação de complexos de multi-proteínas simplesmente por co-transfecção de plasmídeos múltiplos. Além trem2, este sistema tem sid...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture Flasks	GeneMate	F-5909B
293 Freestyle Media	Gibco/Life Technologies	12338-018
GlutaMAX	Gibco/Life Technologies	35050-061	Use in place of Glutamine
Hype 5 transfection reagent	Oz Biosciences	HY01500
293fectin transfection reagent	Life Technologies	12347019
PEI transfection reagent	Sigma-Aldrich	408727
Maxiprep Kit	Qiagen	12162
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Endo Hf	NEB	P0703L
Amylose Resin	NEB	E8021S
Cell Boost R05.2	HyClone	SH30584.02	Cell Culture Supplement
GlucCell	CESCO Bioengineering	DG2032	Glucose Monitoring System
Opti-MEM	Life Technologies	519850.91	Serum Free Medium for DNA transfection
Luria Broth (LB Media)	Life Technologies	10855-001
GC10 Competent Cells	Sigma-Aldrich	G2919