Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

Resumo

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Resumo

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.

To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.

Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

Introdução

Engenharia de tecido cardíaco avançou muito na última década, com vários grupos editoriais resultados de tecidos totalmente funcionais, batendo feitos a partir de ambos os cardiomiócitos murinos ^1-6 e, mais recentemente, derivadas de células-tronco miócitos cardíacos humanos ^7-12. O campo de engenharia de tecido cardíaco é impulsionado por dois objetivos primários e essencialmente independentes: 1) para desenvolver enxertos exógenos que podem ser transplantados para não corações para melhorar a função ^4-6; e 2) para desenvolver modelos in vitro para estudo da fisiologia e da doença, ou como ferramentas de rastreio para o desenvolvimento terapêutico ^2,7.

Tridimensional de cultura de células (3-D) é considerado essencial para o desenvolvimento de ferramentas de rastreio da próxima geração, como a matriz 3-D reflecte um microambiente cardíaca mais natural do que a cultura de células em monocamada de 2-D tradicional; na verdade, alguns aspectos da biologia celular são fundamentalmente diferentes em 2-D culturas vs. 3-D ^13,14 . Além disso, os tecidos cardíacos modificadas são construídas a partir de componentes completamente definidas: uma matriz extracelular, e uma população de células. Para tecidos cardíacos humanos modificados tradicionais, enquanto a composição da matriz extracelular (geralmente fibrina ⁹ ou colagénio ^7,8,10) é rigorosamente controlada, a composição celular de entrada é menos bem definido, com toda a mistura de células a partir de uma diferenciação cardíaca dirigido de qualquer das as células estaminais embrionárias (ESC ^7,9) ou células estaminais pluripotentes induzidas (iPSC ^10,12) sendo adicionado aos tecidos. Dependendo da linha celular específica e a eficiência da diferenciação protocolo usado, a percentagem de cardiomiócitos resultante pode variar de menos do que 25% a mais de 90%, o fenótipo de cardiomiócitos específica (isto é, ventricular-, atrial-, ou pacemaker-like) também pode variar, mesmo a fracção não cardiomiócitos pode ser altamente heterogénea ^15,16 e alterar a maturidade do diferenciada m cardíacayocytes ^17.

Trabalhos recentes em engenharia de tecidos cardíaco tem tentado controlar a população de células de entrada, quer com uma superfície repórter cardíaca linha de células estaminais embrionárias humanas, ou células ⁸ marcadores de ¹⁸ a ser usado para isolar o componente miócitos cardíacos da diferenciação. Embora inicialmente um tecido composto por apenas miócitos cardíacos parece ser o ideal, este não é de facto o caso; hects compostas unicamente de miócitos cardíacos deixar de compactar em tecidos funcionais, com alguns grupos encontrar uma proporção de 3: 1 de miócitos cardíacos: fibroblastos que produzem a maior força de contração ^8. Usando vários métodos de seleção de células, incluindo marcadores de superfície para triagem de células vivas, é possível criar hects com populações de células definidas. Enquanto que os marcadores de células estromais não cardíacas têm estado disponíveis durante algum tempo, tal como o marcador de fibroblastos putativo CD90 ^19,20, marcadores de superfície de miócitos cardíacos foram mais difícilpara identificar. SIRPα foi um dos primeiros marcadores de superfície cardíacas identificados para os miócitos cardíacos humanos ¹⁸ e foi mostrado ser altamente selectiva para a linhagem cardíaca. Recentemente, descobrimos que double-ordenação para SIRPα ⁺ e CD90 ^- células produz cardiomiócitos quase puros, com o CD90 ⁺ população exibindo um fenótipo de fibroblastos-like (Josowitz, observações não publicadas). Com base nestes resultados coletados, aqui nós descrevem a criação hects usando um 3: Combinação 1 de SIRPα ⁺ / CD90 ^- cardiomiócitos e CD90 ⁺ fibroblastos.

A capacidade de projetar um tecido cardíaco humano completamente definida é essencial não só para a criação de ferramentas de rastreio robustas, mas também para o desenvolvimento de sistemas de modelo para investigar cell- emergentes e terapias cardíacas baseadas em genes. Em particular, as numerosas terapias celulares para a insuficiência cardíaca, utilizando tipos de células, incluindo células-tronco mesenquimais (MSC) ²¹ , as células estaminais e células cardíacas ²² mononucleares de medula óssea ^23-25, foram testados em ensaios clínicos. Embora muitos dos resultados iniciais têm sido promissores ^21,23,25, o benefício inicial, muitas vezes diminui ao longo do tempo ^26-29. Uma tendência semelhante foi relatado em murino engenharia tecidos cardíacos, que apresentam um benefício funcional significativa, devido à suplementação MSC, mas o benefício não é sustentada durante a cultura de longo prazo ^1. Subjacente ao desempenho abaixo do ideal é o nosso conhecimento limitado dos mecanismos que regem as terapias celulares. Uma compreensão mais profunda de como as células terapêutica exercer a sua influência benéfica, bem como potenciais consequências negativas das interações miócitos-nonmyocyte, permitiria o desenvolvimento de terapias melhoradas produzindo benefícios clinicamente significativa e sustentada, com efeitos colaterais mínimos, para pacientes com insuficiência cardíaca.

Aqui, descrevemos o uso de hects definidos para interrogComeram mecanismos da terapia à base de células. A composição do tecido controlada é essencial para identificar os fatores específicos que afetam o desempenho dos cardiomiócitos. Diretamente completando hects com o tipo de célula terapêutica de interesse (por exemplo, MSCs), pode revelar os efeitos sobre o desempenho dos miócitos cardíacos, como já demonstrado em ECTs de ratos ^1.

O seguinte protocolo multi-passo começa com a diferenciação de células estaminais cardíaca dirigida, seguida de fabricação do bioreactor multi-tecido, e concluindo com uma descrição da construção do tecido e análise funcional. Nossos experimentos são realizados utilizando a linha de células estaminais embrionárias humanas NIH-aprovado H7 (hESC). No entanto, os protocolos seguintes também foram testados utilizando uma linha de células estaminais embrionárias humanas adicionais e três linhas de células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSC) com resultados semelhantes. Verificou-se que a eficiência na diferenciação de cardiomiócitos e sucesso no HECT fabricação pode ser dependente de células de linha, especialmente folinhas r hiPSC derivadas de pacientes individuais. Seguindo este protocolo, os dois pratos de 6 poços foram semeadas com um total de 1,68 milhões de hESCs (140.000 células por poço), que produz cerca de 2,5 milhões de miócitos depois diferenciar durante 20 dias e separação, o suficiente para fazer seis tecidos definidos.

Protocolo

Nota: executar todas as manipulações de células em condições assépticas, usando uma câmara de segurança biológica filtrado HEPA-classe II e esterilizar todas as soluções, filtrando-os através de um filtro de 0,2 um. Realizar a construção de tecido e teste de função quer nas mesmas condições assépticas ou uma câmara de fluxo laminar.

1. Plantio de H7 hESCs em Preparação para Diferenciação Cardíaca

1. (Dia 1) Preparação da membrana basal Matrix
   1. Descongelar 150 uL de aliquota da matriz da membrana basal qualificada células estaminais embrionárias humanas em gelo durante a noite a 4 ° C.
2. (Dia 0-4) chapeamento de hESCs em placas revestidas
   1. Dilui-se a matriz descongelada em 12 ml de gelo-frio DMEM / F12 e misturar bem.
   2. Transferir 1 ml da solução / F12 de DMEM-matriz em cada poço de um de 6 poços de cultura de tecidos tratados prato. Cada alíquota de matriz pode revestir duas placas de 6 poços.
   3. Incubar as placas revestidas à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h.
      Nota: Nonossa experiência, placas revestidas seladas com parafina pode ser armazenado em solução de matriz, a 4 ° C durante até 10 dias antes da utilização.
   4. Em aproximadamente 75% de confluência, dissociar o H7 hESCs do prato de 10 centímetros utilizando 6 ml de reagente de dissociação não enzimática. Depois de 5 minutos, suavemente raspar as células a partir da superfície da cultura usando um raspador de células descartável e transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 mL estéril.
   5. Remover 0,5 mL da solução de dissociação com as células a partir do tubo de 15 ml e de transferência para uma nova estéril 15 ml de tubo (deixando 5,5 ml do reagente de dissociação para dissociar ainda mais o hESCs) para a propagação de linha de células estaminais.
   6. Agregar as 0,5 ml de células a 300 xg durante 5 min a 20 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente em 8 ml de meio de células estaminais pluripotentes contendo uma penicilina-estreptomicina%, em seguida, transferir para um novo, revestido, de 10 cm de cultura de tecidos e manter a 37 ° C e 5% de CO ₂ para manter a linha de células estaminais.
      Nota: Mantenha a mídia de células-tronco pluripotentes em gelo durante as mudanças de mídia.
   7. Enquanto isso, adicionar 5,5 mL de 10 mM de inibidor ROCHA Y-27632 para a dissociação de 5,5 ml de solução restante e continuar a incubar à temperatura ambiente durante mais 5-10 minutos. Misturar suavemente as células com uma pipeta de 5 ml serológico. Continue a incubar até obter uma suspensão de célula única é conseguido, em seguida, sedimentar as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
   8. Ressuspender as células em 5 ml de meio de células estaminais pluripotentes e executar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro.
   9. Semente de cada poço da placa de 6 poços a uma densidade de 140.000 células por poço. Semente duas placas de 6 poços para criar um total de seis tecidos definidos. Dispor de quaisquer células remanescentes após o plaqueamento.
   10. Encha as bem para 1 ml com meio de células estaminais pluripotentes e incubar a 37 ° C, 5% de CO _2. Vinte e quatro horas depois, remova a mídia e adicionar 2 ml de meio de células-tronco pluripotentes fresco a cada poço (Figura 1A ).
   11. Verifique a confluência das placas de cada dia e iniciar a diferenciação Uma vez que as células atingirem aproximadamente 75% de confluência (Figura 1B - D).

2. (dia 4-24) diferenciação de células estaminais embrionárias humanas para Cardiomyocytes ^30,31

1. (Dia 4-7, Diferenciação Dia 0-3) Mesoderma Indução
   1. Prepare meios RPMI diferenciação I (Tabela 1) por combinação de 500 mL de RPMI 1640 com suplemento de 10 ml de B27 (sem insulina) e 5 ml de solução de reserva de penicilina-estreptomicina (10000 UI / ml de penicilina, 10.000 ug / ml de estreptomicina). Aliquota, em gelo, em tubos de 50 ml e armazenar a 4 ° C.
   2. (Dia 4, Diferenciação Dia 0) Prepare a mídia de indução mesoderme, adicionando 2,4 ul da CHIR99021 pequena molécula inibidor de GSK3 (estoque 10 mM, 6 mM de concentração final) a 12 ml de meios de diferenciação RPMI I. Remova a mídia de células-tronco pluripotentes de cada poço umaND substitua com 2 ml de meio de indução da mesoderme por poço. Retornar a placa para a incubadora.
      Nota: a morte celular significativa, tipicamente, com a adição de CHIR99021 (Figura 1E). A monocamada irá recuperar, mas é importante para lavar as células mortas de distância com a lavagem de DMEM / F12.
   3. (Dia 5, Dia Diferenciação 1) Preparar meio de indução mesoderme frescos como descrito acima. Remover os meios de idade a partir de cada cavidade e lavar uma vez com 1 ml de DMEM / F12 por poço. Adicionar 2 ml de meio de indução mesoderme fresco a cada poço.
      Nota: Lavar a cada dia desde o dia 0-10 aumenta consideravelmente o rendimento ea pureza dos miócitos cardíacos.
   4. (Dia 6, Diferenciação Dia 2) Remova a mídia de indução cardíacos e lave uma vez com 1 ml de DMEM / F12 por poço. Substituir a lavagem com 2 ml RPMI media diferenciação I (há pequenas moléculas adicionado mas ainda com o B27 (sem insulina) suplemento) e retornar à incubadora.
2. (Dia 13/07, Diferenciação Day 3-10) Cardiac Mesoderma Indução
   1. (Dia 7, Dia Diferenciação 3) Prepare meios de indução mesoderme cardíaca através da adição de 6 ul do inibidor de molécula pequena de Wnt IWR-1 (10 mM, 5? M final) a 12 ml de meio RPMI diferenciação I.
   2. Remova a mídia de cada poço, lavar uma vez com 1 ml de DMEM / F12 por poço e substituir com 2 ml de meio de indução mesoderme cardíaca por poço.
   3. (Dia 8, Dia Diferenciação 4) Preparar um adicional de 12 ml de meio de indução mesoderme cardíaca, tal como descrito acima. Remova o material adicionado no dia anterior, lavar uma vez com 1 ml de DMEM / F12 por poço e substituir com 2 ml de meio fresco diferenciação mesoderme cardíaca por poço e voltar para a incubadora.
   4. (Dia 10/09, Diferenciação Dia 5-6) Em ambos os dias, remova a mídia de indução mesoderme cardíacos e lavar cada poço com 1 ml de DMEM / F12.
   5. Adicionar 2 ml de meio fresco diferenciação RPMI I (há pequenas moléculas adicionado mas ainda com o B27 (sem insulina) suplemento)a cada poço e a placa de regresso para a incubadora.
3. (Dia 11-24, Diferenciação Dia 7-20) HES-derivado Cardiac Organização miócitos / Maturação
   1. Prepara-se o meio RPMI diferenciação II (Tabela 1) por combinação de 500 mL de RPMI 1640 com suplemento de 10 ml de B27 (com insulina) e 5 ml de solução de reserva de penicilina-estreptomicina. Aliquota, em gelo, em tubos de 50 ml e armazenar a 4 ° C.
   2. (Dia 11, Dia Diferenciação 7) Remover RPMI meios de diferenciação (sem insulina) a partir de cada cavidade e lavar com 1 ml de DMEM / F12. Substituir com 2 ml de meio RPMI a nova diferenciação II (com a insulina) a cada poço e voltar para a incubadora.
      Nota: o batimento espontâneo deve primeiro ser observado entre os dias 7 e 10. Se bater não é observado durante este tempo, ele geralmente indica baixa eficiência diferenciação. O protocolo pode ser continuada até ao dia 15, em um esforço para observar surra, mas se nenhuma batida é observado por dia 15 é melhor starte uma nova diferenciação.
   3. (Dia 12-24, Diferenciação Dia 8-20) Todos os dias, retire a velha mídia de diferenciação e substituir com 2 ml de RPMI fresco media diferenciação II por poço para permitir a maturação celular e organização da monocamada batida (Figura 1F, Vídeo Figura 1 ).
      Nota: Dependendo da morte celular residual, pode ser necessário lavar com 1 ml de DMEM / F12 até ao dia 10 de diferenciação.

3. (Dia 24, Dia 20 Diferenciação) Isolamento de cardíacos miócitos e células semelhantes a fibroblastos

1. Separar as Células da monocamada
   1. Remova a mídia de diferenciação e lave uma vez com 1 ml PBS.
   2. Dissociar as monocamadas com 1 ml da solução de dissociação enzimática (0,04% de tripsina / 0,03% de EDTA) a cada poço.
   3. Mover placa na incubadora durante 10 min. Enquanto isso, adicionar 12 ul de inibidor ROCHA a 6 ml de solução de tripsina neutralização.
   4. gentlY adicionar 1 ml da solução de tripsina de neutralização que contém o inibidor ROCHA a cada poço da placa para neutralizar a solução de tripsina.
   5. Usando uma pipeta de transferência estéril, misture delicadamente cada poço para quebrar os aglomerados de células.
   6. Transferir todos os 12 ml a partir da placa de 6 poços para um tubo de centrífuga de 15 ml.
      Nota: Uma vez que duas placas de 6 poços são usados ​​neste protocolo, serão necessários dois tubos de 15 ml.
   7. Transferência de 3 ml de PBS a um poço da placa, e, em seguida, transferir sequencialmente os mesmos 3 ml a cada poço subsequente para recolher quaisquer células residuais sobre o prato. Transferir os restantes 3 ml a partir da última bem no mesmo tubo de centrífuga de 15 ml contendo as células.
   8. Pelete a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
2. Prepare células de triagem de células vivas por FACS
   1. Preparar o tampão de coloração através da adição de 5 ml de Soro Fetal de Bovino a 45 ml de PBS em gelo com 50 ul de inibidor de ROCK.
   2. Retirar o sobrenadante do PEL céluladeixar (em 3.1.8) e ressuspender em 1,2 ml de tampão de coloração.
   3. Transferir 200 ul da suspensão de células a um, pré-arrefecido, 50 ml de tubo de centrífuga de novo em gelo. Este será o controle de coloração negativa.
   4. Transferir o restante 1 ml de suspensão de células a um, pré-arrefecido, 50 ml novo tubo de centrífuga em gelo e adiciona-se 2 ul SIRPα-PE / Cy7 (diluição 1: 500) e 4 uL de CD90-FITC (diluição 1: 250) . Misturar suavemente a suspensão de células com uma pipeta de transferência e retornar para o gelo.
   5. Incubar tanto o controlo negativo e a amostra, num agitador basculante, sobre gelo, a 4 ° C durante 1 h.
   6. Prepare tubos de coleta de amostra por adição de 3 ml de meio RPMI (com insulina) para dois tubos de 15 ml de centrífuga. Adicione 3 ul de inibidor ROCHA a cada tubo e armazenar no gelo.
   7. Agregar as células coradas a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e lavar duas vezes com, pelo menos, 10 ml de PBS gelado por enxaguamento.
   8. Adicionar 1 mL de DAPI (1 ug / ml) a 5 ml de tampão de coloração. Suavementeressuspender o sedimento da amostra com 1-3 ml de tampão de coloração contendo DAPI utilizando uma pipeta de transferência.
   9. Adicionar 500 ul de tampão de coloração (sem DAPI adicionado) para o controlo negativo.
   10. Gentilmente filtrar tanto o controle negativo e amostras através de um filtro de 40 um celular para remover aglomerados de células e transferir para o poliestireno tubos de FACS em gelo. Imediatamente trazer amostras para o classificador de células.
   11. Semelhantes a células vivas estabeleceu os métodos de triagem ^18, utilize o controlo negativo para definir as portas, selecione as células vivas (DAPI negativo) e recolher tanto o FITC ⁺ (ie, CD90 ⁺ fibroblastos) e PE / Cy7 ⁺ (ou seja, cardiomiócitos SIRPα ⁺ ) populações de forma independente a 20 psi (Figura 2).
       Nota: Depois de definir as portas, o controlo negativo pode ser fixado em 4% PFA para determinar a eficiência de diferenciação através da coloração de troponina-T.
       Nota: Alguns pesquisadores preferem usar umde controlo de isotipo, em vez de controlo não coradas para definir as portas, a fim de compensar a ligação não específica de anticorpos. Um controle chamado de fluorescência menos um (FMO) é outra possibilidade. Devido à distribuição bimodal clara do FITC, DAPI e sinais PE-Cy7, que fechado a partir da população positiva, conservadoramente visando longe no portão positivo, o que exclui, possivelmente, alguns verdadeiros positivos, mas ajuda a minimizar quaisquer falsos positivos.
3. Reagregação celular em Preparação para Engenharia de Tecidos
   1. Após o tipo de células, a pelota ambos os tubos de recolha e ressuspender em 1 ml de DMEM contendo 10% de Soro Bovino neonatal, uma penicilina-estreptomicina% e 0,2% de anfotericina B ( "meios NBS").
   2. Recombinar os SIRPα ⁺ e CD90 ⁺ células na proporção de 3: 1 e a chapa células combinadas numa cultura de tecido não-tratada placa de Petri a uma densidade de 2 milhões de células por 60 centímetros ² (placa de 10 cm). Adicionar 10 ml de meio NBS e 101; L de inibidor ROCHA Y-27632.
   3. Coloque suspensão de células no incubador de cultura de tecido durante 48 horas para permitir a reagregação de células em pequenos grupos.

4. Cardiac Human Tissue Engineering

1. Fabricar o bioreactor multi-tecidos
   Nota: Para complementar as ilustrações na Figura 3A, arquivos CAD com esquemas de design detalhado de biorreatores estão disponíveis mediante solicitação dos autores.
   1. Máquina do mestre molde PDMS através da perfuração de seis furos igualmente espaçados de 0,5 mm de diâmetro em um cubóide 9 x 33 x 3,25 milímetros de politetrafluoretileno.
   2. Usando uma fresa de topo, máquina de um quadro de polysulfone medindo 25 x 35 x 11 ^mm3. O objectivo da armação é a realização de postos de PDMS (construídas a partir do molde feito acima) em alinhamento com as cavidades na placa de base.
   3. Usando uma fresa de topo de 1 mm, máquina de 6 poços (6 x 1 x 1 mm ^3), 4 mm de distância em um pedaço de poli preto de 20 x 40 x 5 mm ³tetrafluoroetileno para formar a placa de base.
   4. Misture a base de elastômeros e agente de cura para polidimetilsiloxano (PDMS) em um 10: 1 w / w proporção e adicionar ao molde politetrafluoretileno personalizado (passo 4.1.1) para criar duas fileiras de seis postos de força-sensing, e incubar durante a noite e sob vácuo a 80 ° C. Após a cura, remover suavemente as PDMS do molde mestre e marcar cuidadosamente os topos de cada post com um marcador permanente preto para melhor contraste e acompanhamento pós deflexão automatizada em tempo real.
      Nota: politetrafluoretileno é bastante suave e podem ser facilmente danificados. Tenha cuidado ao limpar o molde mestre antes de PDMS lançando para garantir a longevidade do sistema e de geometria consistente PDMS post. Um fio de 0,5 milímetros pode ser usado para limpar os furos para as mensagens depois de cada utilização, mas tomar cuidado para não raspar o interior dos furos.
      Nota: Uma alternativa é o PDMS para desgaseificar sob vácuo durante várias horas à temperatura ambiente, em seguida, deixar a mistura de cura à pressão ambiente.Isto pode levar a menos bolhas de gás residual que se formam em PDMS durante o processo de cura.
   5. Esterilizar todos os componentes em uma autoclave a vapor.
      Nota: O molde PDMS mestre (passo 4.1.1) e quadro polysulfone (passo 4.1.2) são ambos reutilizável. Os postos de PDMS criados a partir do elenco (passo 4.1.4) também é reutilizável, mas apenas para cerca de 10 utilizações. No entanto, mais postos de PDMS podem ser criados conforme necessário usando o molde mestre.
2. Coletar células cardíacas avaliação reagregada
   1. Remover as células avaliação reagregada da incubadora e transferir todos os 10 ml da mídia reagregação para um tubo de centrífuga de 50 ml.
   2. Lavar a placa com 3 ml de PBS e transferir a lavagem para o mesmo tubo de centrífuga de 50 ml contendo meios de comunicação reagregação.
   3. Adicionar 3 ml de 0,04% de tripsina / 0,03% de EDTA para a placa de 10 cm e de regresso para a incubadora durante 5 min.
   4. Após 5 min, examinar a placa com um microscópio invertido composto em 10X de ampliação para assegurar dissocia célula completação a partir do prato. Se alguns clusters residuais ainda estão ligados, agitar suavemente a placa para separar os aglomerados. Se os clusters permanecem ligados, retornar para a incubadora por mais 2-3 minutos. Não incubar mais de dez minutos ou morte celular significativa pode ocorrer.
   5. Uma vez que todas as células são separadas, adicionar 3 ml de solução de tripsina de neutralização. Misture suavemente a solução de neutralização com a solução de células-tripsina e transferência para o tubo de centrífuga de 50 ml que contém a mídia reagregação e lave uma vez com PBS.
   6. Lavar todo o prato com 5 ml de PBS e transferir para o mesmo tubo de 50 ml contendo as células.
   7. Agregar as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
   8. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de NBS, em seguida, transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   9. Pelete a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante. As células cardíacas (células CD90 ⁺ estromais e SIRPα ⁺ miocagora ytes) estão prontos para a construção de tecidos.
3. (Opcional) coletar células Complementares de interesse
   Nota: Em adição aos tecidos definidas contendo apenas SIRPα ⁺ cardiomiócitos e células CD90 ⁺ de tipo fibroblasto, é possível adicionar as células adicionais de interesse para interrogar o seu efeito sobre a função do tecido. Por exemplo MSCs de rato foram mostrados para melhorar a função de rato engenharia tecidos cardíacos ^1. O seguinte passo opcional descreve a coleção de células suplementares para o sistema definido.
   1. Recolhe-se o tipo de célula suplementar de interesse (por exemplo, as células estaminais mesenquimais) usando 0,25% de tripsina / EDTA a 0,1%.
   2. Agregar as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente e em seguida ressuspender em 5 ml de meio de cultura de células apropriado para o tipo celular de interesse. Por exemplo, para as MSCs, utilizar DMEM suplementado com 20% de soro fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina e 0,2% de anfotericina-B para a cultura cells.
   3. Executar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro, em seguida, sedimentar as células mais uma vez a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
   4. Remover o sobrenadante, ressuspender em 1 ml de meio de cultura de células e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   5. Agregar as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
   6. Remover o sobrenadante. As células suplementares estão agora prontos para a construção de tecidos.
      Nota: se as células suplementares são adicionados a uma concentração de 10% do número total de células no tecido, em seguida, para os tecidos definidas, isto exigirá 50.000 células suplementares por tecido uma vez que cada tecido contém 500.000 células cardíacas (ambas as células estromais CD90 ⁺ e SIRPα miócitos ^+).
4. Criar as Engineered cardíacas Tecidos Humanos
   Nota: Armazenar todas as soluções em gelo e as células à temperatura ambiente. Todos os volumes abaixo indicados são por tecido. Tipicamente, cerca de seis tecidos pode ser construído a partir de duas-seis bem PLates de diferenciações cardíacas.
   1. Dilui-se 60,0 ul de estoque a 5 mg de colagénio / ml a 3,125 mg / mL com 1,5 mL de NaOH 1 M, 9,6 ul de PBS 10X e 24,9 ul de água ultrapura desionizada estéril.
      passo crítico: evitar a introdução de bolhas de ar para cada solução durante a preparação, como as bolhas de ar vai perturbar a formação de tecido adequado.
   2. Adicionar 12.0 ul de MEM tanto 10x e 0,2 N de HEPES pH 9 para a mistura de colagénio diluído para criar a mistura de colagénio. Adicionar as duas soluções para baixo o lado do tubo de centrifugação de 15 ml, a fim de evitar a introdução de bolhas de ar na mistura de colagénio.
   3. Adicionar a matriz da membrana basal para uma concentração final de 0,9 mg / mL à mistura de colagénio e armazenar em gelo para criar a mistura final em tecido. A concentração final de colagénio deve ser de 2 mg / ml.
   4. Adicionar 500.000 das células avaliação reagregada à mistura de tecido (miócito + concentração é de 20 milhões de fibroblastos / ml) e enche-se a um volume final de 25 ul portecido, quer com meios isentos de células NBS ou 50.000 células do tipo de células de interesse suplementar (por exemplo, as hMSCs) e misturar bem para formar uma suspensão de células regular.
      Nota: O número de células suplementadas irá variar de para diferentes aplicações. Aqui suplementação de 10% é usado.
   5. Com cuidado, pipeta de 25 uL da suspensão celular em cada um dos seis poços na placa de base do biorreactor, sem a introdução de bolhas de ar para dentro do poço.
   6. Empurrar as duas filas de sensores de força PDMS em ambos os lados da armação de polissulfona, formando 6 pares de postes opostos, em seguida, invertido a estrutura na parte superior da placa de base de modo a que um par de postes entra em cada uma das cavidades contendo a suspensão de células.
      Nota: O quadro polysulfone inclui guias para auxiliar no alinhamento dos PDMS.
   7. Com cuidado, coloque o biorreator, placa de base para baixo, em um prato de 60 mm, em seguida, coloque o prato sem sua capa interior de uma placa de 10 cm, coloque a tampa 10 centímetros no topo, e mover todo o conjunto biorreator empara a incubadora de cultura de tecidos, à espera de duas horas para o tecido a gel.
   8. Após 2 horas, retire o biorreator da incubadora e adicione 14 ml de meio NBS para todo o conjunto, o suficiente para cobrir a placa de base. Voltar para a incubadora e alterar a metade dos meios de comunicação todos os dias.
   9. Quarenta e oito horas mais tarde, remova cuidadosamente a placa de base, movendo delicadamente cada lado da placa de base para fora do chassis de alguns milímetros em um momento, alterar os meios de comunicação, em seguida, retornar o biorreator, tecidos voltados para baixo, para a mídia.
   10. Continuar a alterar a metade do meio de cultura todos os dias NBS.
       Nota: as contracções espontâneas do tecido podem ser observadas tão cedo quanto três dias após a construção do tecido, a geração de forças de contração mensuráveis ​​tão cedo como o dia 5-7.

Resultados

Para obter miócitos cardíacos, uma versão ligeiramente modificada dos métodos de diferenciação Boheler e Lian é usado ^30,31. É imperativo que a diferenciação começa durante a fase log-do crescimento das células, mas também que a população inicial é suficientemente confluentes para obter um número de células utilizável, após separação (cerca de 75% é óptimo). Tipicamente, para H7 hESCs, plaqueamento a uma densidade de 140.000 hESCs por poço de um prato de 6 poços no essencial 8 media ...

Discussão

Construção de tecidos humanos definidos engenharia cardíacas (Hect) pode fornecer um modelo mais consistente e confiável da função dos miócitos cardíacos humano. Fundamentalmente, todos os componentes celulares e extracelulares no sistema são conhecidos e podem ser manipuladas como desejado, removendo assim a confusão influência de outros tipos celulares desconhecidos resultantes do processo de diferenciação. Para equilibrar o crescimento celular rápido e elevado rendimento, é preferível que a diferencia...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2411	Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin	Life Technologies	17505055
B27 without Insulin	Life Technologies	A1895601
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media	Life Technologies	A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells	WiCell	WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel	Corning	354277	Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1	Sigma-Aldrich	I0161	Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum	Life Technologies	16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor)	Stemgent	04-0012	Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting	Company	Catalog Number	Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)	Life Technologies	D1306
CD90-FITC	BioLegend	328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)	PromoCell	C-41200
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologics	S11250
SIRPα-PE/Cy7	BioLegend	323807
Tissue Construction	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA	Fisher Scientific	25-053-CI	Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM	Sigma-Aldrich	M0275-100ML
10x PBS Packets	Sigma-Aldrich	P3813
Collagen, Bovine Type I	Life Technologies	A10644-01	Keep on ice
DMEM/F12	Life Technologies	11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Sodium HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Materials	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Corning	352235	With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate	Corning	353046
Cell Scraper, Disposable	Biologix	70-2180
Polysulfone	McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon)	McMaster-Carr
Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Olympus	SZ-61	Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System	Astro-Med, Inc	Grass S88X Stimulator
High Speed Camera	Pixelink	PL-B741U	Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control			Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials	Company	Catalog Number	Comments
LabView Post-tracking Program			available upon request from the authors