Preparação Facile da Internamente auto-montados Lipid partículas estabilizada por nanotubos de carbono

Resumo

We report on a smart application of carbon nanotubes for kinetic stabilization of lipid particles that contain self-assembled nanostructures in their cores. The preparation of lipid particles requires rather low concentrations of carbon nanotubes permitting their use in biomedical applications such as drug delivery.

Resumo

Nós apresentamos um método fácil de preparar partículas lipídicas nanoestruturados estabilizados por meio de nanotubos de carbono (CNT). De parede única (primitivo) e com paredes múltiplas (funcionalizados) nanotubos de carbono são usados ​​como estabilizadores para produzir emulsões de tipo óleo Pickering-em-água (O / W). Os lípidos ou seja, Dimodan L e Phytantriol são utilizados como emulsionantes, que em excesso de água auto-montar em fase cúbica bi continua Pn3m. Esta fase altamente viscoso é fragmentada em partículas menores, utilizando uma sonda ultrasonicator na presença de estabilizadores surfactantes convencionais ou nanotubos de carbono como feito aqui. Inicialmente, os nanotubos de carbono (pó) são dispersos em água seguido de mais ultra-sons, com o lípido fundido para formar a emulsão final. Durante este processo, os nanotubos de carbono se revestido com moléculas de lípidos, as quais, por sua vez, se suponha que rodeiam as gotículas de gordura para formar uma emulsão de partículas que é estável durante meses. O tamanho médio das partículas lipídicas nanoestruturados CNT-estabilizado é no submicrónica range, o que compara bem com as partículas estabilizadas utilizando surfactantes convencionais. Dados de Raios X de ângulo pequeno espalhamento confirma a retenção da fase cúbica inicial Pn3m nas dispersões de lípidos CNT-estabilizados em relação à fase lipídica pura (estado a granel). deslocamento para o azul e abaixamento das intensidades de bandas característico e L de nanotubos de carbono observados em espectroscopia Raman G 'caracterizar a interacção entre moléculas de superfície e de lípidos CNT. Estes resultados sugerem que as interacções entre os nanotubos de carbono e lípidos são responsáveis ​​pela sua estabilização mútua em soluções aquosas. À medida que as concentrações de nanotubos de carbono empregues para a estabilização são muito baixos e as moléculas de lípidos são capazes de funcionalizar os nanotubos de carbono, é esperado que a toxicidade de nanotubos de carbono a ser insignificante, enquanto a sua biocompatibilidade é grandemente aumentada. Por conseguinte, a presente abordagem encontra um grande potencial em várias aplicações biomédicas, por exemplo, para o desenvolvimento de sistemas de nanocarrier híbridos para a entrega de multiple moléculas funcionais como em terapia de combinação ou politerapia.

Introdução

Ao longo das últimas décadas, a nanotecnologia emergiu como uma ferramenta poderosa especialmente na área de desenvolvimento pré-clínico de medicamentos para combater doenças tais como cancro notórios ^1. Neste contexto, as estruturas em nano-escala com um tamanho <1000 nm são amplamente explorados como veículo de entrega de várias biomoléculas activas tais como drogas, proteínas, ácidos nucleicos, genes e agentes de diagnóstico por imagem ^1-4. Estas biomoléculas ou são encapsulados dentro das nanopartículas ou conjugado sobre a superfície das nanopartículas e são libertados no sítio da acção por disparadores tais como pH ^5,6 ou temperatura. Embora extremamente pequeno em tamanho, a grande área de superfície destas nanopartículas prova ser muito vantajosa para a entrega direccionada de biomoléculas activas. O controlo sobre o tamanho de partícula e biocompatibilidade é de extrema importância, a fim de optimizar a eficácia terapêutica e, por conseguinte, a aplicabilidade de nanopartículas ^7,8.Lipídios ^9-13, polímeros, metais ^{14,15 16,17} e nanotubos de carbono ^18,19 têm sido comumente empregada como nanocarriers para várias aplicações biomédicas e farmacêuticas.

Além disso, as aplicações nanocarrier baseados em nanoestruturas auto-organizadas de lipídios têm uma grande importância em muitas outras disciplinas, incluindo alimentos e indústrias de cosméticos ^20,21. Por exemplo, eles são utilizados na cristalização de proteínas ^{22, 23} de separação de biomoléculas, como por exemplo estabilizadores alimentares, em sobremesas ^24, e na entrega de moléculas activas, tais como nutrientes, aromatizantes e perfumes ^25-31. Nanoestruturas de lípidos auto-montadas não só têm a capacidade de libertar moléculas bioactivas, de forma controlada e direccionada ^32-38, mas que também são capazes de proteger as moléculas funcionais de degradação química e enzimática ^39,40. Embora bicamada fluido planar é a mais Commna nanoestrutura formada por moléculas de lípidos anfifílicos em presença de água, outras estruturas tais como a hexagonal e cúbica são também frequentemente observadas ^20,41,42. O tipo de nanoestrutura formado dependerá estrutura forma molecular dos lípidos, a composição lipídica em água, bem como sobre as condições físico-químicas empregues, tais como a temperatura e pressão ^43. A aplicabilidade de nanoestruturas de lípidos não planares que especialmente de fases cúbicas, é restrito devido à sua elevada viscosidade e consistência domínio não-homogênea. Estes problemas são ultrapassados ​​por dispersão dos nanoestruturas lipídicas em grande quantidade de água para formar emulsões que contêm micron ou submicron partículas lipídicas dimensionada de óleo-em-água (O / W). Desta maneira, um produto adequado de baixa viscosidade podem ser preparados mantendo a estrutura auto-montada lipídica original para dentro das partículas dispersas. A formação destas partículas auto-montadas internamente (abreviado como ⁴⁴ ISAsomes Por exemplo, cubosomes de fases cúbicas e hexagonais hexosomes de fases) normalmente requer uma combinação de um passo de entrada de alta energia e a adição de estabilizadores, tais como agentes tensioactivos ou polímeros. Uma pesquisa recente neste sentido demonstra a aplicação de várias partículas sólidas ^45, incluindo nanopartículas de sílica ^46, argila ^47-49 e nanotubos de carbono ^{50 para} a estabilização de emulsões acima mencionados, adequadamente denominado como Pickering ^{51 ou} emulsões Ramsden-Pickering ^52.

Nos últimos anos, o carbono nanoestruturas como nanotubos de parede única de carbono (SWCNTs) com base, os nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNTs) e fulerenos ter recebido uma grande atenção como novos biomateriais ^53,54. As principais preocupações são a sua toxicidade ^55-58, insolubilidade em água ⁵⁹ e, portanto, sua biocompatibilidade ^56. Uma maneira eficiente de resolver estas questões é a função de superfíciezação por meio de moléculas não-tóxicos e biocompatíveis tais como lípidos. Na presença de água, os lípidos interagir com os nanotubos de carbono de forma que a superfície hidrofóbica dos nanotubos de carbono é protegido a partir de meio aquoso polar enquanto que os grupos de cabeça hidrófilos de lípidos auxiliar a sua solubilidade em água ou dispersão ^60,61. Os lípidos são componentes integrais de organelos celulares, bem como alguns materiais alimentares, por conseguinte, a sua decoração devem, idealmente, diminuir a toxicidade in vivo de nanotubos de carbono. Aplicações biomédicas com base independentemente em nanotubos de carbono ^18,19 e nanoestruturas lipídicas ^9-13 estão em desenvolvimento extenso, mas as aplicações que combinam as propriedades dos dois ainda não são bem-explorado.

Neste trabalho, empregamos dois tipos diferentes de lipídios e três tipos de nanotubos de carbono dos quais SWCNTs estão na forma pura enquanto MWCNTs são funcionalizado com hidroxilo e grupos carboxílicos. Usámos concentrações muito baixas de nanotubos de carbono para preparar as dispersões cujosestabilidade depende de vários factores, por exemplo, o tipo de lípido, tipo de CNT, razão de lípido para CNT utilizado, bem como sobre os parâmetros de sonicação empregues, tais como o poder e a duração. Este protocolo de vídeo fornece detalhes técnicos de um método de cineticamente estabilização nanopartículas lipídicas utilizando várias CNT-estabilizadores.

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Protocolo

Cuidado: os nanotubos de carbono usados ​​neste trabalho estão na forma de nanopartículas, que podem ter riscos adicionais em comparação com as suas contrapartes granel. A inalação de grafite, tanto naturais como sintéticas, podem causar pneumoconiose ⁶² semelhante a pneumoconiose dos mineiros de carvão. Além disso, tem havido preocupações relativamente à toxicidade de nanoestruturas à base de carbono e alguns dos estudos anteriores sugerem que a toxicidade aguda e crónica associada com a inalação de nanotubos de carbono ^63-68. Assim, evitar a inalação do pó CNT multa e segurá-lo com muito cuidado. Se inalado, mover-se para o ar fresco. Se a respiração é difícil, usar oxigênio puro em vez disso e procurar consulta médica. formulações de solução / dispersão de nanotubos de carbono são bastante seguro de manusear.

Cuidado: Os lipídios e surfactantes usados ​​neste estudo são materiais de qualidade alimentar e, portanto, não perigosos em geral, mas eles são irritantes para os olhos e pele, e também altamente inflamável. Por isso, utilize todas as práticas de segurança adequadas, tais como o uso de encontroles engenha- (exaustor) e equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça de corpo inteiro, sapatos fechados) amostras de nanopartículas durante o manuseamento ou a preparar. Em caso de contacto com a pele ou olhos, imediatamente lave a pele ou os olhos com água em abundância por pelo menos 15 min. Consultar um médico, se necessário.

1. Preparação de lípidos massa Fases / Água

Cuidado: Armazenar os lipídios na geladeira a 4 ° C. lípidos puro grau deve ser armazenado no congelador (-20 ° C). Alíquota-os em pequenos frascos de vidro para evitar a contaminação de todo o caldo e comodidade de manuseamento. Outros produtos químicos, incluindo os nanotubos de carbono e surfactantes pode ser armazenado à temperatura ambiente, mas mantê-los longe da luz solar direta.

1. Manter lípidos, isto é, Dimodan L (DU) e Phytantriol (PT) a TA durante 15-20 min antes de abrir o / tampa de frasco de garrafa, a fim de evitar a condensação de humidade.
   (Nota: DU é um glicérido destilada que compreende 96% de monoglicéridos e aresto são diglicéridos e ácidos graxos livres. Dois componentes principais monoglicérido DU são linoleato (62%) e oleato (25%). Por conseguinte, a parte hidrofóbica do DU contém principalmente cadeias C18 (91%), a composição exacta dos quais é como se segue; C18: 2 (61,9%), C18: 1 (24,9%), e C18: 0 (4.2%), indica onde a C18 de cadeia 18C e depois o número de cólon indica o número de ligações C = C. A PT é uma mistura de isómeros ópticos 3,7,11,15-tetrametil-1,2,3-hexadecanetriol. Ele não contém um grupo funcional éster mas consiste em cauda phytanyl altamente ramificada com uma headgroup tri-hidroxi. Ambos DU e PT formar fases cúbicas em presença de excesso de água, que também é o caso para os núcleos de partículas lipídicas estabilizadas ^{13, 45).}
2. Derreter os lípidos, colocando os frascos num banho de água quente ou de um copo contendo água mantida acima de 60 ° C (aquecimento agitador magnético: 230 V, 50 Hz, 630 W ou semelhante para ser usado para aquecer a água numa proveta).
3. Alternativamente frascos de calor que utilizam aquecedores de bloco. Não aquecer o lípido contendo frascos directamente sobre a placa quente, a fim de evitar um gradiente de temperatura e a subsequente decomposição de lípidos.
4. Pesar 500 mg do lípido fundido, em tubo de microcentrífuga pesado previamente (com tampa de encaixe cónico, 1,5 ml), utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro com uma lâmpada de látex.
5. Adicionar 500 ml de água ultrapura (resistividade de água = 18,2 mohms · cm) para o tubo de microcentrífuga acima.
6. Misturar os componentes manualmente durante 15 min usando minúsculos (custom-built) espátula. Fazer tal espátula pelo achatamento da ponta de uma agulha de seringa (0,9 mm Comprimento cânula x 40 mm) usando um alicate.
7. Centrifugar a mistura de lípido / água durante 10 min a uma velocidade de 2000 x g. Novamente agitar a mistura manualmente durante 10 min, em seguida equilibrar-lo durante 24 h. Antes de caracterizar as amostras, agitá-los, durante 5 min e depois deixá-los à temperatura ambiente.
8. Para assegurar a formação de uma fase lipídica equilíbrio ao longo de todo o tubo, executar cerca de 10 ciclos de congelamento e descongelamento e inte rmittently realizar um passo de centrifugação, tal como definido acima. Tanto a forma altamente viscosos fases lipídicas granel DU e PT tornando difícil lidar com eles manualmente (Figura 1).
   Nota: O protocolo acima (seção 1) só é necessário, se um gostaria de comparar o comportamento nanoestrutural (tipo treliça e dimensões de auto-montagem) de partículas dispersas com a fase lipídica granel e / ou usá-lo como um controle para confirmar a retenção de nanoestrutura originais.

Figura 1. Preparação de S / W com emulsão de partículas de consistência fluida fase lipídica altamente viscosa utilizando a entrada de energia elevada (ultra-sons) e utilizando diferentes estabilizadores CNT-SWCNT, nomeadamente, MWCNT-OH, MWCNT-COOH (Figura reproduzida a partir da referência [50] com permissão da The Royal Society of Chemistry)._upload / 53489 / 53489fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Preparação do surfactante estabilizada Partículas lipídicas

1. Preparar uma solução a 0,2% (w / w) de surfactante (Pluronic F127) em solução de água.
   1. Dissolve-se 200 mg do agente tensioactivo (pó fofo branco) em 100 ml de água ultrapura por agitação durante 20-30 min (numa placa magnética com uma barra de agitação magnética). Pluronic F127 é um tensioactivo não iónico e é comumente utilizado como estabilizador de emulsão. É um copolímero tribloco PEO de ₉₉ -PPO ₆₇ -PEO _99, e, consequentemente, demora muito tempo a dissolver-se em água.
2. Adicionar 500 mg de fundido DU ou PT (usando uma pipeta de Pasteur de vidro) para um frasco de vidro (de cintilação de soda-cal equipado com uma folha de tampa forrada ureia, 20 ml).
3. Adicionar 9,5 g de solução de F127 a 0,2%.
4. Na máquina de ultra-som sonda, prender firmemente o frasco para a retorta ficar mandíbula (Retort Montagem Stands comsuporte, braçadeira, base, haste, borracha 3 mandíbula e bosshead), de modo que possa resistir às vibrações geradas por sonicação.
5. Inserir a sonda liga de titânio sólido (13 mm de diâmetro x comprimento 139 milímetros) ligado ao Sonicator celular. Ajuste a altura ea posição do frasco para garantir que os seus lados e no fundo não se estão a tocar a sonda. Uma distância de 0,5 cm entre a ponta da sonda e o fundo do frasco de vidro dá bons resultados.
6. Sonicar a mistura durante 10 min num modo pulsado com impulsos de 1 segundo mediada pelo tempo de atraso de 1 segundo a 35% (do máximo) de energia. O frasco fica muito quente devido ao calor gerado durante a sonicação. Portanto, deixe-o arrefecer até à temperatura ambiente antes de tirá-lo do grampo.
7. Armazenar a dispersão formada-leitoso à temperatura ambiente durante pelo menos 24 horas, antes de posterior utilização. Isto é para assegurar a sua estabilidade contra a separação de fase.
   Nota: Antes e depois de usar a sonda, limpe-o com acetona e seco com uma toalha de papel, em seguida, lave-o com água ultrapura umd secá-lo mais uma vez.

3. Preparação de dispersões de nanotubos de carbono puros de Água

1. Em dois copos separados, pesam em 4 mg de pó MWCNT-OH e MWCNT-COOH, ambos os quais são de cor preta.
2. Adicionar 500 ml de água ultrapura a cada copo. Usando uma sonda de ultrasonicator sonicar as misturas durante 2 minutos num modo de impulsos contínua a 40% (do máximo) de energia. A concentração resultante da dispersão MWCNT é de 8 ug / ml (solução-mãe).
3. Diluir a solução estoque MWCNT com quantidades apropriadas de água ultrapura para atingir 6,25, 5, 4, 2 ug / ml de dispersões MWCNT.
4. Sonicate estas dispersões como descrito anteriormente (ver 3.2).
5. Da mesma forma, dispersar 3 mg de SWCNT em pó (também na cor preta) em 500 ml de água ultrapura para fazer uma / dispersão SWCNT ml 6 mg (solução-mãe).
6. Dilui-se a solução estoque SWCNT e sonicar-los como acima descrito (ver 3.2) para se obter 0,5, 0,4, 0,3125, 0,2 ug / ml dispe SWCNTrsions.
   Nota: Todas as dispersões são claros para cerca de 30 min, após o que os nanotubos de carbono começam a se depositam no fundo.

4. Preparação de CNT-estabilizado nanoestruturado Lipid partículas (Figura 1)

1. Pesa-se 500 mg do DU fundido num frasco de vidro.
2. Adicionar 9,5 ml de o / mL de dispersão de SWCNT 6 ug para o frasco.
3. Sonicar a mistura CNT-DU utilizando os mesmos parâmetros utilizados para fazer dispersões CNT puro (ver 3.2). Após arrefecimento até à temperatura ambiente, as partículas lipídicas CNT-estabilizado com nanoestrutura auto-montados internamente conservada estará pronto.
4. De uma maneira similar, preparar as partículas lipídicas utilizando os 0,4 ug / ml e 0,2 ug / ml dispersões SWCNT.
5. Seguir os protocolos de 4,1 a 4,4 para fazer partículas lipídicas utilizando MWCNT-OH e MWCNT-COOH, mas usando concentrações diferentes, a saber, 8, 4 e 2 ug / ml de CNT.
6. Do mesmo modo, preparar três dispersões CNT-PT diferentes usando 4 ug / ml MWCNT-OH e MWCNT-COOH, Bem como 0,4 ug / mL SWCNT. Note-se que as dispersões CNT-PT requerem menos energia (35% do máximo) mas mais tempo (15 min) num modo contínuo de impulsos. Arrefecer as dispersões para RT e deixá-los por 24 horas antes de caracterizá-los.
   Nota: Os parâmetros de sonicação pode ser diferente para diferentes lipídios (como para DU e PT aqui) e para composições diferentes; que necessitam de ser optimizados para conseguir dispersões bem estabilizadas.

5. Controlo da estabilidade das dispersões de lípidos CNT-estabilizados

1. Monitorizar a estabilidade das dispersões por observação visual: verificar se as dispersões são desestabilizadas ou protuberâncias se formaram nas dispersões.
2. Tirar fotos (com câmera digital) em intervalos regulares. Por exemplo, tirar fotos de dispersões todos os dias na primeira semana, em seguida, todos os dias durante uma semana seguida de uma vez por semana, durante as próximas duas semanas, e, finalmente, uma vez por mês como por obrigação.

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Resultados

Os resultados seguintes representam a) a estabilidade de dispersões, b), a distribuição do tamanho de partículas de lípidos, c) do tipo de auto-montagem e d) a evidência para o revestimento lipídico de nanotubos de carbono. A estabilidade das dispersões (Figura 2) foi monitorado usando uma câmera de 5 MP com foco automático e flash LED.

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Discussão

A estabilização de partículas lipídicas
Três nanotubos de carbono diferentes são usados ​​para estabilizar as dispersões de lípidos; dois dos quais são de paredes múltiplas e funcionalizado utilizando -OH e grupos -COOH, e um único é murado e não-funcionalizado (primitivo). O CNT variaram em tamanho, como se segue (diâmetro x comprimento): MWCNT-COOH: 9,5 nm x 1,5 m; MWCNT-OH: 8-15 nm x 50 mm; SWCNT: 1-2 nm x 1-3 | im. Os nanotubos de carbono em pó foram dispersas em água por ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimodan U	Danisco	15312	Store at 4 °C. Non-hazardous. Irritant to eyes and skin.
Phytantriol (> 95%, GC)	TCI Europe N.V.	P1674	Store at 4 °C. Non-hazardous. Irritant to eyes and skin.
Single walled Carbon Nanotubes (90%)	Nanostructured & Amorphous Materials, Inc.	1246YJS	Store at room temperature. Away from direct light. Irritating to eyes, skin and respiratory system.
Multi-walled carboxylic acid functionalized Carbon Nanotubes (> 80% Caron basis, > 8% carboxylic acid functionalized)	Sigma-Aldrich Co. LLC	755125	Store at room temperature. Away from direct light. Causes serious eye irritation. May cause respiratory irritation.
Graphitized Multi-walled hydroxy functionalized Carbon Nanotubes (99.9%)	Nanostructured & Amorphous Materials, Inc. (NanoAmor)	1224YJF	Store at room temperature. Away from direct light. Irritating to eyes, skin and respiratory system.
Pluronic F127	Sigma-Aldrich Co. LLC	P2443	BioReagent, suitable for cell culture. Not a hazardous substance or mixture. Store at room temperature.
Acetone (99.5%)	Fisher Scientific	10134100	Highly flammable liquid. Causes serious eye irritation. May cause drowsiness or dizziness.
Jars with loose, enfolding lids (375 ml)	VWR International Ltd	216-3308
Beaker, 1,000 ml	Fisher Scientific	12942161	heavy duty, low form, with spout and graduations
Pasteur glass pipette (150 mm length) with latex bulb	Fisher Scientific	10006021
Microcentrifuge tube conical snap cap 1.5 ml	Fisher Scientific	11558232
Spatula	Fisher Scientific	11352204
Heating magnetic stirrer	Fisher Scientific	11715704
Magnetic stirrer bars (cylindrical, opaque PTFE, 30 mm x 7 mm (l x diameter))	Fisher Scientific	10011792
Needle (0.9 mm x 40 mm cannula length)	Terumo UK Ltd	MN-2038MQ
Retort Stand Set - With stand, clamp, base, rod, rubber 3 jaw and bosshead	Camlab Ltd, UK	1177157
Millipore water equipment	Barnstead Nanopure, Thermoscientific, USA
Progen Genfuge 24D Digital Microcentrifuge	Progen Scientific	C-2400
Probe ultra-sonicator, with 13 mm	SONICS, Vibracell,  USA
5 MP camera with auto-focus and LED flash	Samsung Galaxy Fame Mobile camera
Raman Spectrometer	Horiba Jobin-Yvon LabRAM HR800 spectrometer
Mastersizer 3000	Malvern Instruments Ltd, Malvern, United Kingdom
Small angle X-ray scattering (SAXS)	SAXSpace camera (Anton Paar, Graz, Austria), X-ray generating equipment (ISO-DEBYEFLEX3003, GE Inspection Technologies GmbH), closed water circuit (Chilly 35, HYFRA, Germany).