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Resumo

Identificar os alvos diretos de moléculas-alvo do genoma permanece um grande desafio. Para compreender como as moléculas de ligação de ADN envolver o genoma, foi desenvolvido um método que se baseia em ligação cruzada de moléculas pequenas para isolar cromatina (cósmica).

Resumo

O genoma é o alvo de alguns dos mais eficazes agentes quimioterapêuticos, mas a maior parte destes fármacos não têm especificidade de sequência de ADN, que conduz a toxicidade dose-limitante e muitos efeitos colaterais adversos. Segmentação do genoma com pequenas moléculas específicas para a sequência pode permitir que moléculas com elevação do índice terapêutico e menos efeitos fora do alvo. -methylpyrrole N / N poliamidas -metilimidazole são moléculas que podem ser racionalmente concebidos para dirigir sequências de ADN específicos com precisão requintado. E diferentemente da maioria dos fatores de transcrição naturais, poliamidas podem se ligar ao DNA metilado e chromatinized sem perda de afinidade. A especificidade da sequência de poliamidas tem sido extensivamente estudada in vitro com a identificação do local cognato (CSI) e com abordagens bioquímicas e biofísicas tradicionais, mas o estudo de poliamida de ligação para alvos genómicos em células permanece indefinida. Aqui nós relatamos um método, a reticulação de moléculas pequenas para Isolate cromatina (COSMIC), que identifica os locais de ligação de poliamida em todo o genoma. Cósmica é semelhante a imunoprecipitação da cromatina (ChIP), mas difere em dois aspectos importantes: (1) um photocrosslinker é empregue para permitir a captura selectiva, controlada temporalmente de eventos de ligação de poliamida, e (2) a afinidade punho biotina é utilizada para purificar poliamida -ADN conjugados sob condições semi-desnaturante para diminuir o ADN que não é ligada de forma covalente. Cósmica é uma estratégia geral que pode ser usado para revelar os eventos de ligação de poliamidas e outros agentes quimioterapêuticos-alvo do genoma de todo o genoma.

Introdução

A informação para fazer cada uma das células no corpo humano é codificado no DNA. A utilização selectiva de informação que governa o destino de uma célula. Os factores de transcrição (TFS) são proteínas que se ligam a sequências específicas de ADN para expressar um subconjunto particular dos genes no genoma, e o mau funcionamento do TFS está associada ao aparecimento de uma ampla variedade de doenças, incluindo defeitos no desenvolvimento, cancro e diabetes 1,2. Estamos interessados ​​em desenvolver moléculas que podem se ligam selectivamente ao genoma e modulam redes reguladoras de genes.

Poliamidas composto de N -methylpyrrole -metilimidazole e N são moléculas de ADN que podem atingir com especificidades e afinidades que rivalizam com factores de transcrição naturais 3-6. Estas moléculas se ligam a sequências específicas no sulco menor do ADN racionalmente concebido. 4,5,7 -11 As poliamidas têm sido empregues para ambos reprimir e activar a expressão de g específicaenes. 4,12-19 Eles também têm interessantes antivirais e anticancerígenas 20-24 12,13,25-30 propriedades. Uma característica atraente de poliamidas é a sua capacidade de aceder a sequências de ADN que são metilados 31,32 e envolvidos em torno de proteínas histonas 9,10,33.

Para medir as especificidades de ligação abrangentes de moléculas se ligam ao DNA, o nosso laboratório criou o método identificador do site cognato (CSI). 34-39 A ocorrência previsto de locais de ligação com base em in vitro especificidades (genomescapes) pode ser exibido no genoma, porque o in vitro intensidades de ligação são diretamente proporcionais constantes de associação (Ka). 34,35,37 Estes genomescapes fornecer a introspecção em poliamida ocupação em todo o genoma, mas medir poliamida obrigatório em células vivas tem sido um desafio. ADN é empacotado firmemente no núcleo, o que poderia influenciar a acessibilidade de locais de ligação. A umccessibility destas sequências de ADN chromatinized para poliamidas permanece um mistério.

Recentemente, muitos métodos para estudar as interações entre as moléculas pequenas e ácidos nucleicos têm surgido. 40-48 A captura de afinidade química e sequenciamento de DNA massivamente paralelo (chem-seq) é uma tal técnica. Chem SEQ utiliza-formaldeído para reticular moléculas pequenas para um alvo genómico de interesse e um derivado biotinilado de uma pequena molécula de interesse para capturar a interacção ligando-alvo. 48,49

Formaldeído reticulação conduz a interações indiretas que podem produzir falsos positivos. 50 Desenvolvemos um novo método, a reticulação de moléculas pequenas para isolar cromatina (COSMIC), 51 com um photocrosslinker para eliminar esses chamados picos "fantasmas". 50 Para começar, nós projetamos e sintetizados derivados trifuncionais de poliamidas. Estas moléculas continha uma ligação a DNA-polyamide, um photocrosslinker (psoraleno), e um identificador por afinidade (biotina, Figura 1). Com poliamidas trifuncionais, que podem covalentemente capturar interacções DNA-poliamida com irradiação UV a 365 nm, um comprimento de onda que não danificar o DNA ou induzir reticulação não-psoraleno-base. 51 Em seguida, fragmentar o genoma e purificar o ADN capturado sob rigorosas, semi -denaturing condições para diminuir o ADN que não é ligada de forma covalente. Assim, vemos cósmicos um método relacionado com a Chem-SEQ, mas com uma leitura mais directa de ADN de direccionamento. Importante, a fraco (K 10 3 -10 4 M -1) a afinidade para o ADN de psoraleno não detectável impacto poliamida especificidade. 51,52 Os fragmentos de ADN enriquecidos podem ser analisados ​​por qualquer polimerase de reacção em cadeia quantitativa 51 (cósmicos de qPCR) ou por sequenciamento de próxima geração 53 (COSMIC-seq). Estes dados permitem um projeto imparcial, guiada por genoma de ligantes que a Interagir com seus loci genômica desejado e minimizar os efeitos fora do alvo.

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Figura 1. poliamidas bioativos e esquema cósmico. (A) poliamidas Hairpin 1 - 2-alvo a sequência de ADN 5'-WACGTW-3 '. Poliamidas lineares 3 - 4 5'-alvo AAGAAGAAG-3 '. Anéis de N-metilimidazole estão em negrito para maior clareza. Círculos abertos e cheios representam N e N -metilimidazole -methylpyrrole, respectivamente. Praça representa 3-clorotiofeno, e os diamantes representam β-alanina. Psoralen e biotina são denotados por P e B, respectivamente. (B) esquema cósmico. As células são tratadas com os derivados de poliamidas trifuncionais. Após reticulação com irradiação UV a 365 nm, as células são lADN genómico ysed e é cortado. Contas magnéticas revestidas com estreptavidina para capturar são adicionados aductos ADN-poliamida. O DNA é liberado e pode ser analisado por PCR quantitativa (qPCR) ou por sequenciamento de próxima geração (NGS). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. A reticulação em células vivas

  1. Comece com 2,5x10 ~ 7 células H1, ​​ou outras células cultivadas.
    NOTA: O número de células H1 corresponde a cinco placas de 10 cm (aproximadamente 40% de confluência).
  2. Cultivar células em meio E8 em pratos revestidos sobre uma superfície que suporta as células estaminais pluripotentes (ver lista de materiais), e incubar a 37 ° C em atmosfera humidificada de 5% de CO 2. Células colheita enzimática (ver Lista de Materiais). Nota: Não permitir que as células H1 exceder 90% de confluência; confluência induz a diferenciação de células espontânea H1. Para contar as células, crescer um extra de 10 cm prato de células, levante as células enzimaticamente como descritos nos pontos 1.8-1.10, e contá-las com um hemocitômetro.
    1. Preparar os meios de cultura como descrito E8 em Chen et al. 54
  3. Antes da adição de poliamida, remover o meio de cultura gasto, com uma pipeta de Pasteur ligada a um sifão de vácuo. Adicionar meio fresco com comopipeta erological e pipeta distribuidor (8 mL por 10 cm de prato).
    NOTA: Adicionar a mídia para o lado do prato, a fim de evitar perturbar as células. A partir deste ponto em diante proteger as células da luz para evitar prematura foto-reticulação.
  4. Adicionar poliamida com uma pipeta (8 uL de 400 uM de poliamida em DMSO, concentração final 400 nM) directamente ao meio de cultura de cada prato. Agitar o prato para dispersar a poliamida uniformemente nos meios de comunicação.
    NOTA: A concentração pode ser variada, mas assegurar que nenhuma toxicidade celular é observada para o tratamento seleccionado.
  5. Incubam-se as células 24 h 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2, e garantir que eles são protegidos da luz.
    NOTA: O tempo de incubação pode ser variado para medir poliamida de ligação ao longo do tempo.
  6. Lava-se cada prato de 10 cm com 4 ml de PBS (1,05 mM de fosfato de potássio monobásico, cloreto de sódio 155,17 mM, 2,97 mM de fosfato de sio dibico), utilizando uma pipeta e pipetas serológicas DISpenser. Aspirar PBS e adicionar 3 ml de meio de cultura E8.
  7. Com as luzes se apagaram, remover a tampa de 5 pratos de cultura e colocar as células em uma superfície plana do lado de fora da capa. Colocar um filtro de vidro ao longo dos 5 pratos de cultura para filtrar a luz com λ <300 nm. Coloque a fonte de UV em cima de filtro. Amostras Crosslink 30 min com 365 nm de irradiação UV (2,4 mW / cm2).
    NOTA: O tempo de reticulação deve ser determinado empiricamente.
  8. Transferência de placas de cultura de volta para a capa. Aspirar a mídia com uma pipeta Pasteur ligado a uma armadilha de vácuo. Lava-se cada prato de 10 cm com 4 ml de PBS. Aspirar o PBS. Adicionar 3 ml de enzima para a dissociação de células (ver Lista de Materiais) por 10 cm prato dissociar as células. Incubar 5 min a 37 ° C.
    NOTA: Não pré-aquecer a enzima.
  9. Extingue-se a enzima com 3 ml E8 mídia por prato. Transferência de células dissociadas em 15 ml de um tubo cónico.
    NOTA: células colocar no gelo a partir deste ponto em diante.
  10. Centrifuge células dissociadas 5 min, 500 x g a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante para remover a enzima e mídia.
    NOTA: Pausa ponto. As células podem ser congelados rapidamente em azoto líquido, armazenado a -80 ° C para subsequente processamento em um momento posterior.

2. Isolamento de cromatina

  1. Adicionar 1,2 ml de tampão cósmica (20 mM de Tris-HCl [pH 8,1], EDTA a 2 mM, NaCl 150 mM, 1% de Triton-X100, 0,1% de SDS) e pipeta cima e para baixo várias vezes para voltar a suspender o sedimento de células para cada amostra em 1,2 ml de tampão cósmica.
    1. Adicionar 133 ul de cada um dos 100 mM fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 100 mM de benzamidina e 150 ^ M, pepstatina inibidores da protease fresca para uma concentração final de 1 mM de PMSF e para benzamidina e 1,5 uM para pepstatina. Solução de divisão de ligado de células em duas âmbar 1,7 mL tubos de microcentrífuga.
  2. Sonicate com sonicator 35 min (10 seg on, 10 seg off, poder de 60%) para fragmentar o genoma para entre 100 and 500 pb.
    1. Manter o nível de solução da cromatina no tubo de microcentrífuga paralelamente ao nível da água no reservatório. Confirmar este nível por inspeção visual.
      NOTA:. Confirmar que o DNA foi cortado com um gel de agarose a 1,5% 55
    2. Optimizar o tempo de sonicação empiricamente. Use uma quantidade mínima de gelo no reservatório para relaxar as amostras, e garantir o gelo não está a interferir entre as amostras eo chifre copo.
  3. Centrifugar a 12000 xg amostra 10 min. Salve a solução aquosa que contém cromatina solúvel, transferindo-o para um novo tubo de microcentrífuga âmbar com uma pipeta. Descarte o sedimento.
  4. Transferir 110 mL (10%) de amostra para um novo tubo de microcentrífuga e rotulá-la DNA de entrada. Armazenar a -80 ° C. Guardar o resto da amostra cromatina em gelo para utilizao no passo 3.3.

3. Capturar de ligando-DNA As ligações cruzadas

  1. Usar uma pipeta para dispensar 60 ul streptavidin-esferas magnéticas revestidas num tubo de microcentrífuga. Adicionar 1 ml de tampão COSMIC e misture em uma nutator 5 min a RT. Coloque esferas magnéticas sobre separação magnética rack de 2 min para capturar esferas. Retirar tampão COSMIC com uma pipeta.
    NOTA: Não permita que as contas a secar. Proceder imediatamente à etapa seguinte.
  2. Adicionar amostra cromatina (~ 1 ml) a esferas (60 ul) e ressuspender as esferas. Incubar com cromatina revestidas com estreptavidina esferas magnéticas, pelo menos, 4 h em um rotativo, misturador de balanço, a 4 ° C. Incubar as amostras S / N se desejado.

4. Isolamento de ADN purificado por afinidade

  1. Lavar com grânulos de 7 min de intervalo à TA com os seguintes tampões de lavagem para remover as interacções não específicas. Use um rack de separação magnética para capturar grânulos após cada lavagem. Ressuspender as esferas após cada mudança de tampão de lavagem.
  2. Prepare tampões de lavagem em água e filtro (0,2 m) destilada deionizada antes do uso. Tampões de lavagem loja 1 e 2 a 4 ° C para several meses. Prepare Wash Buffer 3 fresco todos os dias. Adicionar e remover tampões de lavagem a partir da amostra com uma pipeta. Para 2 e 4, adicionar 1 e 3 (5 mM), respectivamente, nas lavagens. As amostras podem ser, adicionalmente, lavado duas vezes com tampão cósmica (uma vez 12 h, uma vez que 4 horas) antes das lavagens listados abaixo.
    1. Lavar uma vez com tampão de lavagem 1 (10 mM de Tris-Cl [pH 8,0], EDTA 1 mM, 3% de SDS). Lavar uma vez com tampão de lavagem 2 (Tris 10 mM-Cl [pH 8,0], LiCl 250 mM, EDTA 1 mM, NP40 a 0,5%, desoxicolato de sódio a 1%). Lavar duas vezes com Tampão de Lavagem 3 (4 M de ureia, 10 mM Tris-HCl [pH 7,5], EDTA 1 mM, 0,1% de NP-40). Lavar duas vezes com Tris EDTA (TE) de tampão (10 mM de Tris-Cl [pH 8,0], EDTA 1 mM).
  3. Ressuspender as pérolas em 200 ul de tampão TE com uma pipeta. Esta amostra de ADN capturado é referido como ADN purificado por afinidade (AP).
  4. Suplemento de entrada e AP ADN com 10x Crosslink Reversão Buffer (100 mM de Tris-Cl [pH 8,0], KOH 1 M, 4 mMEDTA) para concentração final de 1x. 56,57 Incubar 30 min a 90 ° C.
    NOTA: 254 nm irradiação UV também pode ser usado para inverter a reticulação psoraleno, 58 mas ciclobutilo dímeros de pirimidina pode ser formado a partir de irradiação a este comprimento de onda e interferir com o processamento a jusante do ADN.
  5. Para ADN de AP, colocar o tubo de microcentrífuga contendo a amostra sobre a separação magnética cremalheira 2 min à temperatura ambiente e líquido isolante (ADN) com uma pipeta. Transferir o DNA AP (que foi libertado a partir das pérolas) para um novo tubo de microcentrifugação âmbar.
    NOTA: O DNA AP desejado está no líquido, não mais ligada às esferas.
  6. Neutralizar de entrada e de DNA AP-se com HCl concentrado até pH 7 pela adição de cerca de 1 mL de HCl 6 N por 100 ul da amostra com uma pipeta. Confirmar as amostras são neutralizados pela adição de 0,5 ul ~ sobre papel de pH com uma pipeta ATENÇÃO:. HCl concentrado é um ácido forte corrosiva. Manusear de acordo com a sua instituição217; s diretrizes para o equipamento de proteção pessoal adequado.
  7. Adicionar RNase A (100 mg / mL) a 0,2 mg / mL concentração final de entrada e de ADN de AP. Incubar 1 hora a 37 ° C. Adicionar proteinase K (20 mg / ml) a 0,2 mg / mL concentração final de entrada e de ADN de AP, adicionar. Incubar 1 hora a 55 ° C.
  8. Purifica-se o ADN com um kit de limpeza de coluna de ADN (ver Lista de Materiais). Eluir 55 ADN em 58 ul de ADN de grau H2O Entrada da loja e AP amostras a -20 ou -80 ° C
  9. Analisar DNA AP por reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) com primers específicos de locos, e / ou por sequenciamento de última geração. Para qPCR, utilizar 2 ul de DNA AP por locus com os seguintes parâmetros: 1 ciclo de 95 ° C, 10 min e 40 ciclos de 95 ° C 20 seg, 54 ° C ou 56 ° C 20 seg, 72 ° C 40 seg.
    NOTA: A temperatura de recozimento deve ser modificada de acordo com a temperatura de fusão dos pares de iniciadores utilizados. Selecione uma temperatu recozimentore que minimiza o ciclo de quantificação com qualquer amplificação não específica.
    NOTA: Para a análise por sequenciamento de próxima geração, apontar para, pelo menos, 10 milhões mapeada lê. O número de leituras mapeados pode ser aumentada através do aumento da quantidade de DNA AP e pela combinação de menos amostras em uma corrida para o seqüenciamento. Mais lê melhorar a sensibilidade. Pacotes padrão para a análise ChIP-seq (por exemplo, local, 59 MACS, 60 e 61) SPP trabalhar com dados COSMIC-seq. Tal como acontece com outros métodos que dependem de sequenciamento de última geração, incluindo a sequenciação do genoma e ChIP-seq, regiões repetitivas criar ambiguidades em alinhamento e montagem e, assim, continuar a ser um desafio técnico.

Resultados

Para ter em conta a fragmentação genoma não uniforme e outras variáveis, o ADN purificado deve sempre ser normalizadas contra uma referência de ADN de entrada. Os iniciadores específicos para um locus de interesse pode ser utilizado. É também útil para analisar um locus em que não se espera que a molécula para se ligar, como um controlo negativo. Vemos um aumento> 100 vezes na ocupação de poliamida, após irradiação com luz de 365 nm (Figura 2).

DNA enrique...

Discussão

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam...

Divulgações

A.Z.A. is the sole proprietor of Vista Motif, LLC and WINStep Forward.

Agradecimentos

We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H. I. Romnes faculty fellowship, and the W. M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)any source
Benzamidineany source
Pepstatinany source
Proteinase Kany source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Life Technologies65001
PBS, pH 7.4Life Technologies10010-023Other sources can be used
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentLife TechnologiesA1110501
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104We have tried other manufacturers of DNA columns with success.
TruSeq ChIP Sample Prep KitIlluminaIP-202-1012This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing
Matrigel Basement Membrane MatrixBD Biosciences356231Used to coat plates in order to grow H1 ESCs
pH paperany source
amber microcentrifuge tubesany source
microcentrifuge tubesany source
pyrex filterany sourcePyrex baking dishes are suitable
qPCR master mixany source
RNaseany source
HCl (6 N)any source
10-cm tissue culture dishesany source
Serological pipettesany source
Pasteur pipettesany source
Pipette tipsany source
15-ml conical tubesany source
centrifugeany source
microcentrifugeany source
nutatorany source
Magnetic separation rackany source
UV sourceCalSunB001BH0A1AOther UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically
Misonix SonicatorQsonicaS4000 with 431C1 cup hornOther sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically
Humidified CO2 incubatorany source
Biological safety cabinet with vacuum outletany source

Referências

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