Modelando os passos iniciais do cancro do ovário Divulgação em uma cultura organotípicas do Peritoneal Cavity Humano

Resumo

Here, we present a protocol to construct a three-dimensional in vitro model of the lining of the peritoneal cavity, composed of primary human mesothelial cells and fibroblasts layered with extracellular matrix, as a tool to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

Resumo

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. Instead, ovarian cancer cells exfoliated from the primary tumor are carried by peritoneal fluid to metastatic sites within the peritoneal cavity. These sites, most notably the abdominal peritoneum and omentum, are organs covered by a mesothelium-lined surface. To investigate the processes of ovarian cancer dissemination, we assembled a complex three-dimensional culture system that reconstructs the lining of the peritoneal cavity in vitro. Primary human fibroblasts and mesothelial cells were isolated from human omentum. The fibroblasts were then mixed with extracellular matrix and covered with a layer of the primary human mesothelial cells to mimic the peritoneal and omental surfaces encountered by metastasizing ovarian cancer cells. The resulting organotypic model is, as shown, used to examine the early steps of ovarian cancer dissemination, including cancer cell adhesion, invasion, and proliferation. This model has been used in a number of studies to investigate the role of the microenvironment (cellular and acellular) in early ovarian cancer dissemination. It has also been successfully adapted to high throughput screening and used to identify and test inhibitors of ovarian cancer metastasis.

Introdução

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy¹. The majority of patients are diagnosed after the cancer has disseminated throughout the peritoneal cavity. Once the cancer has spread throughout the peritoneal cavity, cytoreductive surgery and chemotherapy are often not sufficient treatment to prevent cancer recurrence and chemoresistance, resulting in a less than 30% 5-year survival rate. Ovarian cancer metastasis is predominantly limited to the peritoneal cavity, and several other cancer types, including gastric, pancreatic, and colon cancers, metastasize to the same anatomic sites in the peritoneal cavity. In general, ovarian cancer cells detach from the in situ carcinoma in the fallopian tube or the primary ovarian tumor, travel in peritoneal fluid as single cells or spheroids, and attach to mesothelium-lined surfaces of the omentum, bowel, and abdominal wall².

The tumor microenvironment plays an important role in disease progression and chemoresistance in many cancers^3-6. The peritoneal cavity is a unique microenvironment, with a mesothelial cell monolayer covering the majority of surfaces (Figure 1A)⁷. The mesothelial lining acts as a barrier that creates a low-friction surface, which tends to be protective against cancer cell adhesion⁸. Immediately underneath this mesothelial-lined surface is a layer made predominantly of fibroblasts and extracellular matrix (ECM), which promote cancer cell adhesion and invasion⁸. Ovarian cancer cells secrete factors that induce changes in the mesothelial cell lining that enhance ovarian cancer cell adhesion, invasion, and metastasis^9,10. Ovarian cancer cells adhere to the mesothelial surface via integrin and CD44-mediated mechanisms (Figure 1B)^11-16.

Historically, several 3D models have been developed to investigate ovarian cancer interactions with the microenvironment. Some of the first models studied ovarian cancer-ECM interface^17-21, ovarian cancer-mesothelial cell communication^13,14,21-24, or both²⁵ (reviewed by us ²⁶). Niedbala et al. discovered that ovarian cancer cells display a quicker and firmer adhesion to ECM than to mesothelial cells or to plastic alone²⁵. However, these models did not histologically resemble the peritoneal microenvironment. Therefore, we established a 3D organotypic model to more thoroughly replicate the ovarian cancer microenvironment. In order to better understand the role of the microenvironment and the interaction between cancer and peritoneal cells in the peritoneal dissemination of ovarian cancer, we have developed a 3D organotypic in vitro culture model of the peritoneal cavity lining (schematic in Figure 1C). The proposed model is composed of primary human fibroblasts and ECM, covered with a layer of primary human mesothelial cells-each cell type is isolated from human omentum. Histologically, this model resembles the normal peritoneal or omental lining, and provides a surface on which we can study the tumor microenvironment, the interaction between cancer cells and normal tissue, and the processes of cancer cell adhesion, invasion, and proliferation⁸.

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Protocolo

Todos os protocolos de pesquisa descritas foram revistos pela Universidade de Revisão Institucional Chicago Board (IRB). O consentimento informado foi obtido de cada paciente antes da cirurgia e do estudo foi aprovado pela Universidade de Chicago IRB. Um gabinete de segurança biológica do tipo 2 e as luvas devem ser usados ​​ao manusear tecido humano para proteção e para reduzir o risco de contaminação de células.

1. Isolamento e Cultura de células estromais não transformadas primárias

1. Coleta de tecido humano e preparação.
   1. Obter amostras de omento humano, 2 cm ^3, removida durante uma cirurgia abdominal, e mergulhar imediatamente no tecido RT solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Figura 2A). Um pedaço de omento 3 cm x 2 cm normalmente produz 1 milhão de células primárias humanas mesoteliais (HPMC) e 200.000 fibroblastos humanos primários ou fibroblastos omentais normais (NOF).
   2. Girar o PBS o tecido foi mergulhado em a 0,5 g durante 3min o mais rapidamente possível após a colheita (<2 h em PBS) e transferir para o tecido fresco 20 mL de PBS num tubo de 50 ml. Corta-se o tecido em 5mm ^{3 peças} por picagem com bisturis em um 15 cm de diâmetro, estéril prato de cultura (Figura 2B).
2. Isolamento de células mesoteliais humanas primárias ⁸
   1. Para isolar HPMC, transferir o tecido moído em 50 ml de tubos cónicos e esperar 1 min para os pedaços sólidos a flutuar para o topo (Figura 2C e D). HPMC e glóbulos vermelhos (RBC) estará presente no líquido na parte inferior. Usar uma pipeta para retirar o líquido a partir do fundo do tubo e para um novo tubo cónico. Girar o líquido para baixo, para 0,5 xg durante 3 min e aspirar o sobrenadante do pellet de HPMC / RBC.
      1. Repita o processo três vezes: adicionar 20 ml de PBS ao tecido picada, permitir que o tecido a subir, remover o líquido do fundo com uma pipeta e no tubo de HPMC / RBC, girar para baixo, e retire asobrenadante. Depois de todas as rotações são concluídos e o sobrenadante é aspirado, o sedimento conterá HPMC e RBC.
   2. Placa de todas as células a partir do sedimento num frasco de 75 cm ² em 15 ml de meio de crescimento completo (DMEM com soro a 10% de bovino fetal [FBS], 1% de vitaminas MEM [93 mg / L], 1% de MEM aminoácidos não essenciais ácidos [81,4 mg / l], 1% de penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina]).
   3. Realize uma lavagem PBS secundário para isolar HPMCs adicionais.
      1. Para lavar o secundário PBS, agitar o tecido sólido restante a 200 rpm, 37 ° C durante 10 min em 20 ml de PBS, em seguida, esperar um minuto para o tecido a flutuar para o topo. Remover o líquido a partir do fundo do tubo para um novo tubo, centrifugar a 0,5 xg durante 3 min, e o sobrenadante aspirado.
      2. Placa toda a HPMC / RBC do PBS secundário lavar em um frasco separado 75 cm ^{2 em} 15 ml de meio de crescimento completo.
   4. Para isolar qualquer remaining HPMC, agitar o tecido moído a 200 rpm, 37 ° C graus durante 10 min em 20 ml de uma mistura 1: 1 0,25% de tripsina 25 mM de EDTA: solução de PBS em volume. Permitir que o tecido a subir, recolher o líquido na parte inferior do tubo em um novo tubo de 50 ml, e a rotação para baixo de 0,5 gx 3 min.
      1. Aspirar o sobrenadante e placa toda a HPMC / RBC em um frasco separado 75 cm ^{2 em} 15 ml de meio de crescimento completo.
   5. Cultura das células plaqueadas a 37 ° C e _5% de CO2 num ambiente humidif içado. Alimentar as células banhado, adicionando 15 ml de meio de crescimento completo nos dias 3 e 5 sem a remoção dos meios gastos. HPMC podem ser cultivadas por 5-7 dias antes de se separarem.
      1. Use baixa passagem HPMC (até passagem 2) em todos os experimentos para minimizar desdiferenciação e modificação do fenótipo inicial. Use um microscópio de campo amplo de preferência com uma objetiva de 20x com capacidades de contraste de interferência diferencial plástico ou objetivo 4-20x com contraste de fase capabilities (filtros de fase de contraste no microscópio) para tomar todas as imagens das células, e uma objetiva de 10x () no campo claro para analisar imunohistoquímica 3,3'-diaminobenzidina (DAB) coloração.
   6. Confirme que a HPMC são cubóide e expressar citoqueratina 8 e vimentina através da realização de imunohistoquímica ⁸ (Figura 3A, C, E).
3. NOF isolamento ⁸
   1. Preparar 10 ml de uma solução de estoque de colagenase de tipo III (10x) por combinação de uma mistura 1: 1 de Pen-Strep 100x:: 1 1.500 unidades de actividade / ml de colagenase de tipo III: Actividade de 714 unidades / ml de hialuronidase em PBS.
   2. Agitar o tecido omento picada que permanece após HPMC isolamento a 200 rpm, 37 ° C durante 6 horas em 10 ml da solução 10x colagenase tipo III diluída em meio isento de soro (DMEM com 1% de vitaminas MEM [93 mg / L], MEM a 1% aminoácidos não essenciais [81,4 mg / l], 1% de penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina]). Tecido digerido vai olhar opaco e pode ter alguns detritos fibroso (Figura 2E).
   3. Centrifugar a solução contendo as células NOF em suspensão em 0,5 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente, aspirar o sobrenadante e o sedimento em placa num frasco de 75 cm ^{2 em} 13 ml de meio de crescimento completo.
   4. Remover a velha mídia e substituir com 15 ml de meio de crescimento completo fresco depois de 24 horas. NOF podem ser cultivadas durante 1-3 dias antes de se separarem. Proliferação nota da NOF cessará quando as células atingem a confluência.
   5. Confirmar que os fibroblastos humanos primários, as células são alongadas planas e expressar vimentina mas não citoqueratina 8 ⁸ através da realização de imuno-histoquímica (Figura 3B, D, F). Use NOF de baixa passagem para experiências (idealmente antes da passagem 3) para minimizar desdiferenciação e modificação do fenótipo inicial. Use um microscópio de campo amplo com uma objetiva de 20x com capacidades DIC de plástico para tomar todas as imagens de fase de células,e uma objectiva de 10x em campo brilhante para analisar a coloração imuno-histoquímica DAB.

2. chapeamento o Organotípicas Cultura ⁸

1. NOF lançamento do balão de cultura de 75 cm por lavagem com 10 ml de PBS, seguido de 3 ml de tripsina a 0,25% / EDTA 25 mM, durante não mais do que 5 minutos. Neutralizar a tripsina com pelo menos 3 vezes o volume de meio de crescimento completo.
2. Transferir as células tripsinizadas em um tubo de 50 ml e girar para baixo em 0,5 gx 3 min. Remover o sobrenadante e trazer as células de volta em 5 ml de meio de crescimento completo. Utilizar um contador de células para contagem das células recuperadas a partir do balão de cultura.
3. Dilui-se as células no volume apropriado de meio de crescimento completo ao prato 2.000-4.000 NOF por 100 ul numa placa preta, clara de fundo, de 96 cavidades. Adicionar 0,5 ug / 100 ul de colagénio de cauda de rato-I da mistura de células antes do plaqueamento. Let células sentar a 37 ° C em _5% de CO2 num ambiente humidif içado, durante pelo menos 4 horas, ou até que as célulaspara aderir à superfície da chapa.
4. HPMC liberar a partir do frasco de cultura utilizando os mesmos métodos descritos nos passos 2.1 e 2.2. Dilui-se as células na quantidade apropriada de meio de crescimento completo ao prato 10.000-20.000 HPMC por 50 ul no topo da NOF já revestida com colagénio I, em placas de 96 poços. Permitir que as células se sentar a 37 ° C em _5% de CO2 num ambiente humidif içado durante pelo menos 18 horas antes de iniciar as experiências.
5. Cultura proteína fluorescente verde (GFP) -expressing HeyA8 células cancerígenas de ovário em meio de crescimento completo. HeyA8 células cancerosas do ovário está marcado de forma fluorescente por expressão de um vector lentiviral expressando copépodo cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). HeyA8 células cancerosas do ovário deve ser 80-90% confluentes no dia da utilização (fase de crescimento logarítmica). Libertar as células a partir da placa de cultura e contagem usando os mesmos métodos descritos nos passos 2.1-2.2 para células primárias.
6. Permitir que as células de cancro do ovário para recuperar num meio de crescimento completo durante 15-20 min a 37 ° C numatubo cónico com a tampa solta selado.

3. Ensaio de Adesão ⁸

1. Após a recuperação, sedimentar as células do cancro do ovário por centrifugação durante 3 minutos a 0,5 xg e, em seguida, remover o sobrenadante e dilui-se as células no volume apropriado de meio isento de soro para alcançar uma concentração de 50.000 células / 100 pi.
2. Inverter as placas de 96 poços com as culturas organotípicas / NOF HPMC para remover meios gastos, e adicionar 100 uL da suspensão de células de câncer em meio isento de soro a cada poço. Incubar a placa a 37 ° C em _5% de CO2 num ambiente humidif içado, durante 30 min a 4 h.
3. Inverta a placa de 96 poços e meios para remover as células não aderentes. Use uma pipeta multicanal com baixo poder de cuidado e gentilmente pipeta 100 ul de PBS em cada poço e inverter placa novamente. Repita o PBS lavar mais uma vez.
4. Inverta a remover PBS e adiciona-se 100 ul de paraformaldeido a 4% a cada poço. Permitir que a placa de sentar-se por 20 min para corrigir as células. Após 20 min, inverter a placa e adiciona-se 100 ul de PBS.
5. Note-se que a fluorescência total dos poços pode ser reportada ou o número de células pode ser quantificada. Para a quantificação, a primeira placa de uma curva padrão em duplicado utilizando células HeyA8 a uma concentração de 1 milhão de células / ml.
   1. Fazer a curva padrão por fiação para baixo 1 milhão de células, removendo mídia, e permitindo-lhes para se sentar em 1 ml de paraformaldeído a 4% durante 20 minutos.
   2. Células girar novamente e trazer em 1 ml de PBS (células recontagem para confirmar 1 milhão / ml de concentração). Placa de 50.000, 40.000, 30.000, 20.000, 10.000, 5.000, 1.000 e 0 células em cada cavidade, em duplicado, e adicionar PBS para um volume total final de 50 uL em cada poço.
6. Inferior ler a placa de cultura em um leitor fluorescente placa (excitação = 488 nm, emissão = 528 nm), dimensionamento altos poços (50.000 na curva padrão). Use a curva padrão para calcular quantas células de cancro do ovário aderiram ao organotypIC cultura em cada poço (Figura 4A-C).

4. Ensaio de Proliferação de ¹⁰

1. Após as células de cancro do ovário recuperar (ver passos 2.5 e 2.6, supra), sedimentar as células por centrifugação durante 3 minutos a 0,5 xg e depois dilui-se as células no volume apropriado de 1% de meio de FBS (DMEM com FBS a 1%, 1% MEM vitaminas [93 mg / L], MEM a 1% de aminoácidos não essenciais [81,4 mg / l], 1% de penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina]) para obter uma concentração de 4000 células / 150 ul.
2. Inverta a placa de 96 poços com as culturas organotípicas de HPMC / NOF para remover o meio gasto e adicionar 150 uL da suspensão de células do cancro em 1% de meio FBS a cada poço. Incubar a placa a 37 ° C em _5% de CO2 num ambiente humidif içado, durante 72 h.
3. Parte inferior da placa de cultura de ler num leitor de placas fluorescente, uma vez por dia (excitação = 488 nm, emissão = 528 nm) para avaliar a proliferação relativade células. Continue o ensaio durante 96 horas, mudando a mídia em 48 horas (Figura 5A-C). Tenha cuidado para não perturbar a cultura quando se muda de mídia (invertendo a placa é preferível).

5. Invasão Ensaio ⁸

1. Antes de chapeamento a cultura 3D, adicionar 7,5 g rato-cauda colágeno I em 200 � de PBS a um 24 bem inserção placa de cultura (8 mm de tamanho de poro). Deixe a placa incubado O / N, em seguida, retire cuidadosamente a PBS com uma pipeta imediatamente antes do plaqueamento a cultura organotípico HPMC / NOF para as inserções revestidos com colagénio (etapa 2, acima).
2. Preparar as células de cancro do ovário como no passo 3.1. Ao prato as células de cancro do ovário para as culturas organotípicas sobre as inserções, utilize cuidadosamente uma pipeta para remover o excesso de mídia a partir do topo das inserções. Adicionar 100 ul da suspensão de células do cancro do ovário em meio isento de soro a cada poço.
3. Adicionar 750 ul de meio de crescimento completo na cavidade abaixo da inserção para induzir células no cancrovasion em culturas organotípicas. Incubar a placa a 37 ° C em _5% de CO2 num ambiente humidif içado, durante 24 horas.
   Nota: As células do cancro do ovário que invadem a cultura organotípica vai atravessar a inserção e permanecem no lado inferior da peça inserta.
4. Após 24 horas, segure a inserção com pinças e brevemente enxágüe-la num copo de PBS, em seguida, passar a inserção em um poço vazio. Esfregar a parte superior de cada inserto com dois lados de uma mecha de algodão para um total de 1 min. Rapidamente colocar o inserto para uma placa contendo 750 ul de paraformaldeido a 4% em cada poço. Permitir que cada inserção para sentar-se em paraformaldeído durante 10 minutos antes de transferir as inserções em poços cheios com 750 � de PBS.
5. Ver as células invadidas (aderidas e fixas à parte inferior das inserções) com um microscópio com uma ampliação de 2,5 vezes. Quando todo o poço está dentro do campo de visão, para ajustar a ampliação de 10x e levar 5 imagens, um perto do centro e um em cada quadrante do poço, evitandoa tomada de imagens que são demasiado perto das bordas. Siga o mesmo padrão para cada poço.
6. Usar o programa do fabricante para contar o número de células em cada imagem para obter um número médio de células invadidas por campo em cada poço (Figura 6A-C) de acordo com o seu protocolo.

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Resultados

A cultura organotípica foi montada misturando primeiro fibroblastos humanos primários com colagénio do tipo I e, em seguida, sobrepondo esta cultura com 5 vezes o número de células de mesotélio. A cultura foi incubada durante, pelo menos, 18 horas antes das células de cancro do ovário foram adicionados a estudar a adesão, invasão ou proliferação. Cada ensaio foi repetido com múltiplos (n = 3-5) culturas em 3D obtidas de diferentes pacientes e numerosos poços foram testados em cada condição para a adesão...

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Discussão

Um modelo organotípico do microambiente peritoneal foi criada para avaliar a função (s) individual e coletiva de ambos os componentes celulares e inatas do microambiente na disseminação do cancro do ovário. Os protocolos específicos para o plaqueamento e personalizar a cultura organotípico 3D para investigar ovário adesão célula cancerosa, proliferação e invasão são fornecidos. Células humanas primárias omentais mesoteliais e fibroblastos foram isoladas de pacientes e usado em uma passagem antecipada pa...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Isolation and culture of primary cells
PBS	Fisher Scientific	SH3001304
Single-edged razor blades	Fisher Scientific	12-640
15 cm culture dishes	BD Biosciences	353025
Glass flask	?	?
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000044_3616914956
DMEM with L-Glutamine	Corning	10-013-CV
MEM Vitamins	Corning	25-020-Cl
MEM Nonessential amino acids	Corning	25-025-CI
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI
Shaker	Thermo-Fisher	MaxQ 4450
Centrifuge	Eppendorf	5702
Incubator	Thermo-Fisher	Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100
Trypsin EDTA, 1x (0.25%)	Corning	25-053-CI
Hyaluronidase	Worthington Biochemical	LS002592
T-75 Flasks	BD Biosciences	353136
T-175 Flasks	BD Biosciences	353112
Pipet tips	Rainin	P2, P10, P20, P200 and P1000
Pipet tips	Corning	Filtered tips P2, P10, P20, P200 and P1000
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
2. Plating 3D culture
Cell Counter	Invitrogen	Countess
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10313
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Collagen Type I (Rat Tail)	BD Biosciences	354236
96 well plate, clear bottom, black	BD Biosciences	353219
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
3. Adhesion assay
Multichannel pipet	Eppendorf	Xplorer 300
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
Plate reader	Molecular Devices	Minimax
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
5. Invasion assay
Cell Culture Inserts (8um, 24-well)	BD Biosciences	353097
Cotton swabs	Q-tips	cotton swabs
Microscope	Zeiss	Axiovert 200m
Cell Profiler	public domain
24 well plate	BD Biosciences	353047
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
6. Antibodies
Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609	EMD Millipore	MAB1976
Beta 1	Oncosynergy	OS2966
Alpha 5 [CD49e]	ID Pharmingen	555615
Beta 4 [CD104]	EMD Millipore	MAB 2058