Quantificação de Vascular Cerebral Arquitetura usando dois fótons Microscopia em um modelo de mouse Neuroinflammation induzida por HIV

Resumo

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Resumo

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

Introdução

Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 (VIH-1) invade o cérebro durante a fase aguda da infecção pelo vírus, e produtivamente infecta ambas as microglia e macrófagos residentes cérebro, que conduz à sua activação - e a libertação de ambos os mediadores inflamatórios derivados do hospedeiro e solúvel HIV-1 virotoxins como Tat e gp120 (revisto em ^1,2). Como consequência, um estado neuroinflamatória crônica torna-se estabelecido no CNS, que é pensado para contribuir para a patogênese do HIV-1 Distúrbios Associated neurocognitivos (a mão) ^3-5.

Superexpressão crónica do HIV-1 Tat ou interleucina (IL) -17 no SNC de ratinhos foi mostrado para resultar em ^6,7 rarefacção microvascular. Isto levanta a possibilidade de que neuroinflama�o crónica pode contribuir para a patogénese da mão através de efeitos sobre a vasculatura cerebral. A fim de analisar melhor esta questão, temos desenvolvido métodos para quantificar struc vasculares cerebraisturas.

Este artigo descreve um método para a quantificação do número de nodos capilares, segmentos capilares, comprimento do segmento, o comprimento total do segmento dizer, o diâmetro médio do capilar, e o volume total do capilar utilizando imagiologia in vivo de redes capilares através de uma janela cortical crânio fina (modificado a partir do descrito anteriormente protocolos de ^8,9), assim como ex vivo de imagens de secções do cérebro, utilizando microscopia de dois fotões. Esta abordagem combinada fornece para uma quantificação global de parâmetros vasculares cerebrais, desde fina-crânio janela cortical in vivo permite a preservação do meio ambiente cerebral, enquanto ex vivo de imagens de redes capilares em fatias de cérebro permite a reconstrução completa, tridimensional - redes capilares que pode, então, ser quantificada utilizando software disponível comercialmente.

Protocolo

A Universidade do Comitê Universidade de Rochester em Recursos Animais aprovado todos os procedimentos realizados neste trabalho.

Preparação 1. Pré-cirúrgica (e ratos)

1. Prepare a área cirúrgica com todos os equipamentos necessários. Esterilizar todos os instrumentos utilizados durante o procedimento de antemão usando 70% de etanol. Opcionalmente, use um esterilizador de bolas de gude ou autoclave para esterilizar os instrumentos.
2. Posicione o mouse em uma câmara de indução isoflurano ligado a um vaporizador de isoflurano. Definir níveis de isoflurano a 4% a uma taxa de 1 L / min.
   Nota: para as experiências aqui relatadas, ratinhos com uma doxiciclina (DOX) indutível transgene HIV-1 Tat conduzida pela proteína glial fibrilar específicos de astrócitos (GFAP) promotor (ratinhos Tat de HIV-Tg) ¹⁰ foram utilizados para examinar o efeito do VIH -1 induzida neuroinflama�o em estrutura vascular cerebral, como descrito anteriormente ^7,10.
3. Delicadamente incline a câmara de indução para observar o rato &# 39; s reflexo de endireitamento. Uma vez que o reflexo de endireitamento foi suprimida, definir o nível de isoflurano a 2% e redireccionar o fluxo de ar a partir da câmara de indução para o cone de nariz na bancada cirúrgica.
4. Mova rapidamente o mouse da câmara de indução à infusão de água almofada de aquecimento. Continuar a aplicar isoflurano (1,5-2%), através do cone do nariz. Ajuste anestesia de acordo com a tolerância individual do mouse avaliada através freqüência respiratória (FR) de monitoramento.
   Nota: A depressão de RR pode perturbar parâmetros fisiológicos de gases que alteram o fluxo sanguíneo cerebral e avaliação diâmetro do vaso. Tentativa de manter RR entre 55-65 respirações por minuto. A frequência cardíaca (HR) também pode ser usado avaliar profundidade da anestesia; HR manter entre 300-450 batimentos por minuto para evitar alterações fisiológicas ao diâmetro do vaso. Tipicamente, a anestesia adequada será entre 1,5-2,0% de isoflurano em 1 L / min para um dado rato.
5. Realizar uma pitada dedo do pé para buscar ainda mais a profundidade da anestesia. Se o mouse não responder, commrência os procedimentos cirúrgicos.

2. Preparação do Cranial Janela Thin-crânio

1. Aplique gel lágrima artificial para os olhos do mouse. Completamente remover os pêlos do couro cabeludo do rato usando uma tesoura ou um barbeador elétrico.
2. Esterilizar o couro cabeludo através da aplicação de solução de iodo-povidona; deixar secar. Então, sob um microscópio de luz, retire a pele do couro cabeludo do rato, expondo completamente os ossos parietais, ossos frontais caudais, e marcação Bregma.
3. Aplicar uma pequena quantidade de uma solução de cloreto férrico a 10% no crânio, a fim de secar as membranas para remoção fácil. Retirar as membranas secas com o # 5/45 fórceps raspando suavemente o crânio.
4. Aplicar uma fina camada de cola em torno da janela placa frontal. Pressionar suavemente a placa frontal contra o crânio do rato, mantendo a área de interesse no centro da janela. Aplicar uma gota de cimento dental para a placa frontal para polimerizar a cola.
5. Aplique uma camada finade cola ao longo da borda da janela de placa frontal para criar um reservatório em que a segurar salina. Uma vez que a cola secar, parafuso da placa frontal para o arnês do mouse placa frontal.
   Nota: o arnês de rato Headplate utilizado neste procedimento é uma estrutura com uma base de metal e duas colunas de metal. Em cada coluna há uma mola e uma porca de orelhas. A placa frontal é colocada no topo da mola, e a porca de orelhas é apertado até que a cabeça está nivelada e não se move.
6. Remova qualquer cola da janela placa frontal usando uma broca anexado a uma broca MicroTorque fixado em 6.000 rpm. Pare a cada 10-15 segundos para evitar o superaquecimento do rato crânio que pode resultar em danos estruturais aos navios.
   1. Utilizando uma nova broca, colocar a broca de 1,5 mm MicroTorque lateralmente a partir da linha média (um terço do diâmetro da janela da placa frontal). Começam a diluir o crânio em torno este local a 4.000 rpm. Mova a broca suavemente em todo o crânio sem pressão descendente direto.
   2. Cease drilling cada 10-15 segundos para evitar o superaquecimento do crânio mouse. Durante este tempo, remover a poeira acumulada crânio utilizando um reservatório de ar comprimido.
   3. Use gotas de solução salina RT para esfriar crânio para 5-10 seg. Remova cuidadosamente todo o líquido com um tecido macio para continuar afinamento crânio.
7. Para a diluição final do crânio, colocar um pequeno volume de solução salina no reservatório placa frontal e levemente varrer uma micro-lâmina dentária através da área de interesse até pequenos vasos são claramente visíveis.

3. verificação de parâmetros fisiológicos

1. Uma vez que o crânio é completamente diluído, retire o rato do suporte e colocá-lo em sua parte traseira. Gentilmente fita para baixo ambas as pernas traseiras para expor claramente as coxas medial.
2. Remova o cabelo sobre ambas as coxas medial com uma tesoura ou um barbeador elétrico. Desinfetar o local da cirurgia, cobrindo as coxas com iodopovidona.
3. Comprimir a pele na coxa medial à direita acima da veia femorale a artéria usando uma pinça # 5. Puxe delicadamente a pele para cima e usar uma tesoura para cortar e remover a pele.
   Nota: a coxa esquerda é reservada em caso de complicações cirúrgicas (anomalias vasculares, vasos rompidos).
4. Aplique aproximadamente 3-5 gotas de solução salina 0,9% ao sítio cirúrgico. Isto permite uma maior ampliação de navios, bem como mantendo o local hidratada e prevenir a secagem dos vasos. Separa-se a veia femoral a partir da artéria por sem rodeios dissecar no feixe neurovascular femoral usando dois # 5/45 fórceps.
5. Coloque dois, três peças cm de sutura cirúrgica por baixo da artéria femoral aproximadamente 1 cm de distância. Torça o horário de sutura superior para criar um torniquete vascular que vai ajudar a evitar a perda excessiva de sangue durante o cateterismo.
6. Faça uma pequena incisão na artéria femoral usando a tesoura primavera. Colocar o cateter na artéria através da incisão e avanço até que o cateter é segura no interior da artéria.
7. Untwist a sutura superior (torniquete) para avaliar se há vazamentos e colocação do cateter adequado. Fixar o cateter na artéria femoral, amarrando dois nós em torno do cateter no interior do recipiente utilizando as suturas.
8. Injectam-se 10 uL de heparina (100 IU / ml) através do catéter para impedir a coagulação do sangue. Em seguida, feche cirurgicamente a coxa direita por costura a pele, juntamente com uma sutura 4-0 em um padrão simples interrompido.
9. Injecte 50 ul de uretano (1,2 mg / g) por via intraperitoneal no quadrante inferior direito. Cinco minutos mais tarde, repita com outra injecção de 50 uL para o quadrante inferior esquerdo para um total de 100 ul de uretano intraperitoneal. Lentamente reduzir os níveis de isoflurano para cerca de 0,25%, enquanto que concomitantemente rechecking rato para a profundidade de anestesia.
   Nota: Manter a agulha superficial dentro da cavidade peritoneal, ao longo da parede abdominal posterior de modo a que não perfure o intestino. Isto pode ser conseguido por beliscar o mu reto abdominalscles longe das vísceras e, em seguida, injetar.
10. Usando um tubo capilar, recolher uma amostra de 40 ul de sangue arterial a partir do catéter. Encaixe do cateter ao transdutor de pressão do sangue equipado com uma torneira de quatro vias cheio de solução salina e seringa cheia de heparina.
11. Tape o transdutor de pressão sanguínea para o aparelho cirúrgico para a remoção não intencional prevenir do cateter. Iniciar a monitoração da pressão arterial média.
12. Insira o sangue encheu tubo capilar em uma porta de entrada analisador de gases no sangue. Uma vez todo o sangue ter sido extraído, remover o tubo capilar a partir da porta de entrada. Os _O 2 e CO ₂ níveis de gases sanguíneos aparece em um papel impresso do analisador de gases no sangue.

4. Injecção do corante fluorescente

1. Comprimir a pele na coxa esquerda medial usando o # 5 fórceps. Puxe delicadamente a pele para cima e usar uma tesoura para cortar e remover a pele. Prepare corante vermelho de rodamina conjugada com dextrano emissores(70 kDa) (10 mg / kg, dissolvidos em soro fisiológico).
2. Localizar a femoral vein.Using uma seringa de 1 ml com uma agulha G 30 anexado, desenhar uma solução previamente preparada de um corante fluorescente adequada para a imagiologia para a linha de 130 ul da seringa. Retirar as bolhas de ar através da elaboração o corante completamente para dentro da seringa e sacudindo firmemente parede da seringa.
   1. Dobre a agulha G 30 em um ângulo de aproximadamente 30 graus, pressionando-o contra uma superfície dura lado bisel para cima. Encher a agulha com o corante e eliminar qualquer excesso de líquido, deixando uma amostra de 100 ul.
3. Injectar a amostra de 100 ul de corante lentamente para dentro da veia femoral. Após a remoção da agulha, aplicar constante, a pressão suavemente para o local da injecção para parar qualquer sangramento. Permitir que o corante circular durante 5 min.
   Nota: Alternativamente, a veia femoral direita pode ser usado em vez de a injecção de corante fluorescente para evitar a perda de sangue através da criação de um outro local cirúrgico. Além disso, se oanimais é a hemorragia descontrolada do local cirúrgico, este pode ser uma indicação de que o excesso de heparina foi determinada para lavar o cateter. Se não houver a coagulação dentro de 10-15 min e o mouse ainda está sangrando, considere reiniciar o experimento com um novo mouse.
4. Feche a coxa esquerda por costura a pele, juntamente com uma sutura 4-0, em seguida, virar cuidadosamente o mouse sobre seu estômago, e colocá-lo no arnês do mouse placa frontal.

5. In Vivo Two-Photon Imagens

1. Mova o aparelho cirúrgico para o microscópio de dois fotões, certificando-se de manter os níveis de anestesia contínuas. Colocar uma pequena quantidade de 0,9% de solução salina para dentro do reservatório placa frontal e diminuir o objectivo do microscópio de modo que ele entra em contacto com a solução salina. Localize a área de interesse, utilizando o objetivo de visualização brightfield
2. Definir a excitação de dois fotões a um comprimento de onda de laser adequado para o corante fluorescente. Comece a imagem de dois fótons usando a 25x objective.
   Note-se que nestas experiências foi utilizado um dextrano conjugado com um corante rodamina vermelho emissor de que estava animado em um comprimento de onda de 780 nm. Um filtro passa banda 607/36 de emissão para detectar a fluorescência do corante, e um filtro de emissão de 480/20 passa banda foi utilizado para detectar a autofluorescência arterial
3. Localize um capilar cama na tela de exibição e ampliar essa área usando o zoom 2. Adquirir imagens ópticas dos capilares usando o software de imagem de dois fótons.
4. Depois de imagem estiver concluída, sacrificar o rato por deslocamento cervical seguido por decapitação.

6. Ex Vivo Two-Photon Imagens

1. Usando a tesoura Extra Fino, fazer uma incisão no couro cabeludo dos ossos interparietais para os ossos frontais do mouse. Fixar a pele para os lados do crânio com o dedo indicador e o polegar.
2. Coloque a tesoura extra fino por baixo do osso interparietal medial e cortar o crânio ao longo da sutura sagital. Pare o corte do crânio de aproximadamente 3 mm após o bregma marcação.
   Nota: Aplicar uma pressão ascendente ao cortar o crânio para evitar o corte do cérebro.
3. Usando o # 5 fórceps, separar o crânio a partir do cérebro e cuidadosamente remover qualquer meninges a partir da superfície do cérebro. Meninges restantes podem acidentalmente lacerar o cérebro; deve ser tomado extremo cuidado para evitar isso. Deslize cuidadosamente os # 5 fórceps sob o cérebro avançando lentamente para a frente até que o cérebro está livre de crânio.
   Nota: se a pressão para baixo deve ser usado, a fim de evitar a perfuração do cérebro.
4. Coloque o cérebro de uma ferramenta de corte cerebral específico para ratos. Lave o cérebro através da aplicação de gotas de líquido cefalorraquidiano artificial sobre o cérebro.
5. Retirar a 2 mm Secção coronal do cérebro de bregma 0 a bregma -2. Coloque a secção coronal numa lâmina de vidro côncavo contendo líquido cefalorraquidiano artificial com a 0 bregma (maior parte cranial da secção) virado para cima. Gentilmente cobrir o cérebro slgelo com uma lamela de vidro.
   Nota: Evite pressionar o vidro uma vez colocado no seção do cérebro, pois isso pode deformar a arquitetura vascular.
6. Transferir as lâminas para o estágio do microscópio e coloque uma pequena quantidade de solução salina 0,9% sobre a lamela. Abaixe a objetiva do microscópio até que ele entra em contato com a solução salina. Localizar a linha média do cérebro utilizando a objectiva de campo claro.
7. Comece a imagem de dois fótons e localize a linha média novamente usando o objetivo de 25x. Conseguir isso, procurando a fissura longitudinal na superfície cortical da secção coronal. Coloque a borda direita da tela de imagem na linha média e mover a tela do espectador sobre lateralmente três quadros completos (aproximadamente 1,5 mm da linha média).
   Note-se que nestes experimentos, os parâmetros de imagem foram idênticos aos mencionados na nota no passo 5.2.
8. Localize a profundidade em que os capilares são pouco visíveis na tela de exibição. Abaixe o plano de foco mais 20iM para determinar o início do Z-pilha.
9. Defina a espessura imagem para 1 m. Abaixe a tela de visualização para 100 mm e ajustar a potência do laser ao longo de tal forma que menos de 1% dos pixels são oversaturated.
   Nota: as imagens z-stack são compilados a partir de uma série de 100 imagens 500x500x1 consecutivo M. Quanto maior a pilha z-os mais precisos os cálculos de pós-processamento será. Em geral, tentar recolher uma pilha de Z-100 um ou maior.
10. Pressione o ícone de repetição XY seguido pelo ícone XY adjacente. Uma vez que o z-stack for concluída, pressione o ícone Série Feito e salve o arquivo.

7. Processamento de Dados

1. Abra uma imagem capilar vivo em no software ImageJ. Definir manualmente o pixel à relação de distância com base nos valores obtidos a partir do software de dois fótons.
   1. Selecione o ícone * * reta a partir do menu ferramentas. Desenhar uma linha que se estende a partir de uma parede capilar para o OPPOparede capilar local, e gravar o tamanho fornecido pelo ImageJ.
      Note-se que pode ser necessário para aumentar a imagem, a fim de visualizar claramente as bordas das paredes capilares.
   2. Repetir o passo 7.1.1 em diferentes locais ao longo do capilar, assim como para múltiplos capilares na imagem.
2. Abra o arquivo z-stack no software analítico, como Amira. Selecione o ícone Filament editor da barra de ferramentas sub-aplicação
   1. Defina a espessura do espectador a aproximadamente 20. Mova o espectador a parte superior ou inferior de z-stack.
   2. Selecione o ícone de rastreamento e mova o cursor sobre a imagem carregada. Nós colocar no capilares nos locais descritos na Figura 2C; segmentos aparecerá automaticamente entre nós adjacentes. Seguir a capilares em todo o inteiro z-pilha.
      Nota: será necessário colocar os nós de entre os pontos finais e pontos de ramificação, a fim de traçar os capilares throughout o z-stack.
   3. Para remover esses nós, clique no ícone Intermediate Remover.
      Nota: Isto pode criar segmentos em loop errôneas que devem ser removidos manualmente, selecionando o loop usando o ícone Individual Select, e em seguida, selecionando o ícone Remove Selected. Se lacetes continuam a aparecer na mesma área, durante o rastreio, é provável que os gânglios foram colocados em diferentes capilares.
   4. Uma vez que o rastreamento estiver completo, selecione o ícone Graph informações para abrir uma planilha contendo os parâmetros vasculares extraídos automaticamente. O número de nós e segmentos estão disponíveis na tela de visualização principal.

Resultados

A janela cortical crânio-fino permite in vivo de dois fotões imagiologia de capilares corticais (Figura 1). Uma área adequada para a imagem mostra numerosos capilares, distintos (Figura 1A). No mesmo campo de visão, não há nenhuma parede arterial autofluorescência celular, e podem existir outros sinais fluorescentes, tais como o colagénio, a fluorescência induzida por geração segunda harmónica ¹¹ (Figura 1B).

Discussão

O método aqui descrito pode ser aplicado para analisar as estruturas microvasculares cerebrais em uma ampla gama de modelos / configurações experimentais. Para o sucesso deste método, três passos críticos deve ser dominado. Em primeiro lugar, a janela crânio-fina não deve danificar o crânio ou cérebro subjacente. É fácil de perfurar o crânio durante o desbaste, ou causar perda vascular induzida pelo calor. Isto pode interferir com a formação de imagens conforme o corante fluorescente vai infiltrar-se no p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leica Microscope	Leica Inc.	MZ8
High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner	180
Heating Pad	Stryker	TP3E
T/PUMP	Gaymar Industries, Inc.	TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer	Datex Ohmeda	447
Artificial Tear Gel	Butler AHS	7312
Povidone-Iodine solution	Aplicare	52380-1855-9
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Dumot #5 Forceps	Fine Science Tools	11295-10
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Ferric Chloride Solution	Ricca Chemical Company	3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel	Henkel	45404
Dental Cement	Stoelting	51459
Microtoruqe II Handpiece Kit	Pearson Dental	R14-0002
005 Burr for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05
Norland Blade (Dental Microblade)	Salvin Dental	6900
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	Group 2B Carcinogen
Braided Suture	Ethicon	735G
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03
Arterial Catheter	SAI Infusion Technologies	MAC-01	The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter.
Blood Pressure Moniter	World Precision Intruments	SYS-BP1
Blood Pressure Transducer and Cable	World Precision Intruments	BLPR2
RAPIDLab Blood Gas Analyzer	Siemens	248
40 μl Capillary Tube	VWR	15401-413
Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline)	Invitrogen	D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope	Olypmus	FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser	Spectra-Physics
ImageJ Software	National Institutes of Health (NIH)		Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira Software	Visage Imaging