Bioprinting celularizado Constrói Usando um específico do tecido Hidrogel Bioink

Resumo

Nós descrevemos um conjunto de protocolos que, juntos, oferecem uma bioink hidrogel que imita o tecido com o qual construções de tecido 3-D funcionais e viáveis ​​podem ser bioprinted para uso em aplicações in vitro de rastreio.

Resumo

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.

Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues.

Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Introdução

Nos últimos anos, uma grande variedade de tecnologias tornaram-se disponíveis, que aborda a necessidade de fontes alternativas de órgãos e tecidos funcionais através pretende fabricar, ou biofabricate, eles. Bioprinting emergiu como um dos mais promissores destas tecnologias. Bioprinting pode ser pensado como uma forma de fabrico aditivo robótico de partes biológicas, que podem ser usados ​​para construir ou de padrão viável estruturas de órgãos ou de tipo de tecido, como em 3 dimensões. ¹ Na maior parte dos casos, bioprinting emprega um 3-dimensional (3 D) do dispositivo de impressão que é dirigido por um computador para depositar as células e biomateriais em posições precisas, recapitulando assim anatomicamente-imitando arquitecturas fisiológicas. ² Estes dispositivos de impressão de um "bioink", que podem assumir a forma de agregados de células, as células encapsuladas em hidrogéis ou fluidos viscosos, ou microtransportadores de células-semeado, bem como polímeros isentos de células que fornecem a estrutura mecânica ou agir como PLA isento de célulasceholders. ^3,4 Na sequência do processo bioprinting, a estrutura resultante pode ser amadurecido em tecidos ou órgãos estruturas funcionais, e utilizado para a sua aplicação final pretendida. ^5,6 Até à data, um órgão de tamanho humano totalmente funcional completa não foi impressa, mas continua a ser o principal objetivo de longo prazo de bioprinting pesquisa e desenvolvimento. ² no entanto, em pequena escala "organ�de" construções de tecido estão actualmente a ser implementado em uma série de aplicações, incluindo modelagem de patologia, desenvolvimento de medicamentos e rastreio de toxicologia.

Um dos principais obstáculos que os pesquisadores têm encontrado na aplicação de tecnologia bioprinting é que muito poucos materiais foram desenvolvidos para o propósito explícito de bioprinting. Para ter sucesso efetivamente em bioprinting, um biomaterial deve cumprir 4 requisitos básicos. O biomaterial tem de ter: 1) as propriedades mecânicas apropriadas para permitir a deposição (seja extrusão através de um bocal como um gel ou um inkjet como uma gota), 2) a capacidade de manter a sua forma como um componente de uma estrutura 3-D após a deposição, 3) a capacidade de controle do usuário sobre os 2 características anteriores, e 4) ambiente amigável e de suporte de uma célula em tudo as fases do processo bioprinting. ⁷ Historicamente, bioprinting trabalho tem muitas vezes tentou empregar biomateriais tradicionais existentes em dispositivos bioprinting sem consideração a sua compatibilidade, em vez de projetar um biomaterial para ter as propriedades necessárias para bioprinting e aplicações pós-impressão subseqüentes.

Uma variedade de bioinks têm sido desenvolvidas recentemente para melhor interface com o equipamento de fabricação e deposição. sistemas de hidrogel padrão representar problemas significativos porque geralmente existem como um ou outro precursor de soluções de fluidos com propriedades mecânicas insuficientes, ou hidrogéis polimerizados que se impressos podem entupir bicos ou tornar-se dividido sobre o processo de extrusão. A nossa equipa, bem como others, têm explorado várias formulações de hidrogel para resolver estes problemas bioprinting, incluindo impressão esferóide célula em substratos de hidrogel, ^5,8 celular e filamentos de hidrogel de extrusão de tubos microcapilares, ^9-11 extrudable ácido hialurônico (AH) hidrogéis de nanopartículas -Gold com propriedades de reticulação dinâmicos , ¹² controlo temporal da rigidez hidrogel utilizando fotopolimerizável metacrilado HA e gelatina, ¹³ de reticulação à base de fibrinogênio-trombina, ^14,15 géis de alginato-colágeno troca iônica, ¹⁶ e recentemente rápida polimerização por luz ultravioleta (UV) reticulação -initiated, ¹⁷

Estes exemplos demonstram a viabilidade de materiais que geram que pode por bioprinted eficazmente. No entanto, para além de integração com o hardware, com sucesso para gerar construções de tecido 3-D viáveis ​​e funcionais, biomateriais deve conter sinais bioquímicos e mecânicos que ajuda na manutenção celularviabilidade e função. Estes factores adicionais, perfis bioquímicos e mecânicos, pode ter uma influência significativa sobre a função bem sucedida de construções de tecido bioprinted.

Ambas as células e a matriz extracelular nativa (ECM) são responsáveis ​​por apresentar uma vasta gama de moléculas de sinalização, tais como factores de crescimento e outras citoquinas a outras células. A combinação destes sinais varia de tecido para tecido, mas pode ser extremamente potente e influente na regulação do comportamento celular e tecidual. ¹⁸ Empregando componentes ECM específicos de tecidos a partir de diferentes órgãos e execução como um hidrogel ou como parte de um hidrogel tem sido explorada com sucesso. ^19-21 Esta abordagem, que é composta de descelularizante um dado tecido, pulverizando-o, e dissolvendo-o, pode ser utilizado para produzir sinais bioquímicos específicos de tecido a partir de qualquer tecido e pode ser incorporada em 3-D construções de hidrogel ^22.

Além disso,é amplamente documentado que os tecidos do corpo ocupam uma grande variedade de rigidezes ²³ como tal., a capacidade para sintonizar as propriedades mecânicas de biomateriais, tais como o módulo de elasticidade E 'ou módulo de cisalhamento G elástica', é uma ferramenta útil em engenharia de tecidos . Como descrito acima, o controlo de propriedades mecânicas bioink permite biofabrication à base de extrusão usando um gel suave, o que pode, em seguida, ainda manipulado por reticulação secundário, a um ponto mais tarde, altura em que os níveis do módulo de elasticidade pode ser alcançada que coincidir com o tipo de órgão-alvo. Por exemplo, biomateriais pode ser personalizado para corresponder a uma rigidez de 5-10 kPa como um fígado nativo, ^23, ou coincidir com uma rigidez de 10-15 kPa como o tecido cardíaco nativo, ^24,25, em teoria, aumentar a capacidade destes para funcionar em Organóides um modo semelhante aos seus homólogos tecido nativo. A influência da rigidez do ambiente no fenótipo da célula tem sido explored nos últimos anos, particularmente em relação às células-tronco. Engler et ai. Demonstrou que a elasticidade do substrato auxiliado na condução células estaminais mesenquimais (MSC) no sentido de linhagens com a elasticidade do tecido correspondente ao do substrato. ²⁵ Este conceito tem sido explorada para a diferenciação no músculo, a função cardíaca, fenótipo hepática, a proliferação de células-tronco hematopoiéticas e manutenção do potencial terapêutico das células estaminais. ^24,26-29 ser capaz de sintonizar um hidrogel de diferentes módulos de elasticidade é uma característica importante de um biomaterial que vai ser utilizado para biofabricate construções de tecido ^30.

Descrevemos aqui um protocolo que representa uma abordagem versátil utilizado no nosso laboratório para formular um sistema de hidrogel que pode ser de extrusão bioprinted e personalizado para 1) contêm o perfil bioquímico de um tipo de tecido particular, e 2) imitar o módulo de elasticidade desse tipo de tecido . Ao abordar esses requisitos, pretendemos provide um material que pode recapitular as características físico-químicas e biológicas do tecido in vivo. ³¹ O sistema composto hidrogel modular aqui descrito tira vantagem de uma abordagem de reticulação multi-para se obter bioinks extrudiveis, e permite uma reticulação secundária para estabilizar e aumenta a rigidez da produtos finais para corresponder a uma gama de tipos de tecidos. personalização bioquímica é cumprida usando componentes da matriz extracelular de tecidos específicos. Como uma demonstração, nós empregamos uma variedade específica de fígado deste sistema hidrogel para bioprint fígado funcional construções organ�de. O protocolo descrito usa um personalizado 3-D dispositivo bioprinting. Em geral, este protocolo pode ser adaptado para a maioria das impressoras de extrusão, os parâmetros de impressão específicas variar drasticamente para cada tipo de dispositivo e exigir testes pelo utilizador.

Protocolo

1. Formulações de hidrogel Bioink e Preparação

1. A fim de proporcionar perfis bioquímicos específicos do tecido, preparar-tecido específico ECM digerir soluções como previamente descrito para o fígado. ²⁰
   Nota: Em geral, este ECM Digest irá compreender 40% do volume bioink hidrogel final que é empregue. Várias centenas de mililitros de solução de ECM digestão pode ser preparado, aliquotas, e congelado a -80 ° C para uso futuro.
2. Antes da formulação de hidrogel, dissolver um fotoiniciador, 2-hidroxi-4 '- (2-hidroxietoxi) -2-metilpropiofenona, em água a 0,1% w / v.
   NOTA: Os volumes no intervalo de 50-100 ml pode ser preparado com antecedência e guardadas protegida da luz a 4 ° C durante vários meses.
3. Para formar bioinks hidrogel, dissolver primeiro os componentes de material de base a partir do ácido hialurónico (HA), kits de hidrogel na solução de água-fotoiniciador.
   1. Dissolver a gelatina tiolada HA e tiolado separadamente em água-psolução hotoinitiator (passo 1.2) para fazer 2% w / v soluções.
   2. Dissolve-se diacrilato de polietileno glicol (PEGDA), o agente de reticulação nos kits de hidrogel, em solução de água-fotoiniciador (passo 1.2) para fazer uma solução a 8% w / v.
   3. Dissolve-se polietileno glicol (PEG) de 8 braços alcino (10 kDa MW) em solução de água-fotoiniciador (passo 1.2) para fazer uma solução a 8% w / v.
4. Em geral, formam hidrogeles utilizando o seguinte esquema, embora personalização adicional é possível.
   1. Combine 4 partes de 2% tiolados HA, 4 partes de 2% de gelatina tiolado, 1 parte de agente de reticulação 1, 1 parte de agente de ligação cruzada 2 com 8 partes de solução ECM tecidos e 2 partes de meios de cultura de hepatócitos (HCM) (ou 10 partes de água como um não-tecido genérico hidrogel espec�ico).
      Nota: adicional de HA não modificada ou gelatina podem ser adicionados para fazer a extrusão bioink mais suavemente. Isto é descrito abaixo.
5. Vortex-se a mistura resultante em alta (velocidade 10 de 10) durante 10 segundos para misturar antes de usar.
6. Uso de hidrogel bioink
   1. Para extrusão ou ensaios bioprinting, transferir a mistura em um cartucho de seringa ou impressora e permitir que a ligação cruzada de forma espontânea, durante 30 minutos (etapa 1 de reticulação) a 37 ° C.
   2. Para medições reológicas, transferir a mistura numa placa de Petri de 35 milímetros e permitir que ele para reticular durante 30 min.
      Nota: A mistura imediatamente começa a reticular por meio de formação da ligação tiol-acrilato e começará a aumentar em viscosidade. A mistura deve ser transferido para uma seringa, cartucho de impressão, ou local alvo dentro de 10 minutos para evitar o entupimento de uma pipeta ou uma seringa durante a transferência.
   3. Quando é desejada reticulação secundária (fase 2), a fase de irradiar um geles reticulados com luz ultravioleta (365 nm, 18 W / ^cm2) para se iniciar uma reacção de polimerização tiol-alcino.
      Nota: A duração da irradiação é dependente da área da superfície do material. Em geral, um centímetro quadrado de material requer apenas 1-2 segundos de exposição de UV a esta fonte de UV.

Teste de Compatibilidade 2. Printer

1. Antes de testes de integração com dispositivos bioprinting, características de teste de extrusão sobre a bancada de laboratório com testes de extrusão simples usando seringas padrão e pontas de agulha de pequeno calibre (20-30 bitola).
   1. Empurre a bioink através de uma seringa padrão para alcançar filamentos suavemente extrudados de hidrogel com poucos ou sem solavancos. Extrusão de linhas ou padrões simples é suficiente para determinar o sucesso.
2. Para a integração bioprinter, carregar bioink preparações pipetando-los em cartuchos de impressora, e permitir 30 min para o bioink se submeter espontânea estágio 1 de reticulação dentro do cartucho.
   Nota: O volume de bioink depende da aplicação específica e deve ser determinada pelo utilizador. Cartuchos de impressora podem assemelhar-se ou ser seringas que são compatíveis com o dispositivo bioprinter.
3. Avaliar a compatibilidade de extrusãopara bioprinting imprimindo um padrão simples usando o bioink. Por exemplo, imprimir um padrão de 7 x 7 milímetros composta de linhas paralelas. Aplicar pressão (pressão pneumática por exemplo, 20 kPa), enquanto a cabeça de impressão se desloca no plano XY a uma velocidade de cerca de 300 mm / min.
   Nota: os diâmetros de bicos da cabeça de impressão de diferentes tamanhos podem ser usados, mas os bicos cónicos com aberturas de 400-500 um de diâmetro são óptimas para a impressão de esferóides no intervalo de 250-350 um.
   1. Se os materiais extrudados são irregulares ou irregulares, consulte o passo 2.4, ou reduzir a quantidade de PEGDA para amolecer o material reticulado estágio 1. formulações bioink devidamente preparados expulsar sem problemas, permitindo a deposição precisa em padrões ou arquiteturas desejados.
      Nota: Os procedimentos bioprinting uso descrito um costume 3-D dispositivo bioprinting projetado em casa especificamente para o tecido construir a impressão ³² Como tal, os parâmetros de impressão específicas variam drasticamente para cada tipo de dispositivo e requerem testin.g pelo utilizador.
4. Para melhorar as propriedades de extrusão, complementar não modificada HA e gelatina para os bioinks (1,5 mg / ml e 30 mg / ml, respectivamente).

3. Validação por bioprinting com construções de fígado primário

1. Prepare 3-D esferóides fígado célula primária por enforcamento métodos de queda como o componente celular ³³
   Nota: bioprinting pode ser realizada sem esferóides, mas em vez disso com as células individuais em suspensão nas bioinks hidrogel bem. Os esferóides são empregues aqui para acelerar as interacções célula-célula e construir funcionalidade. O número de esferóides ou células empregues depende da aplicação específica e deve ser determinada pelo utilizador. Estes passos devem ser realizados sob condições estéreis, utilizando fontes estéreis.
   1. Prepare HCM, adicionando o conteúdo descongelados do kit de componentes suplemento HCM para a mídia de hepatócitos basal (HBM) e filtragem estéril.
      1. Descongelar o componentes do suplemento until líquido.
      2. Adicionar os componentes do suplemento (ácido ascórbico, 0,5 ml; albumina de soro bovino [ácido gordo livre], 10 ml; gentamicina / sulfato de anfotericina B, 0,5 ml; hidrocortisona 21-hemissuccinato, 0,5 ml; insulina, 0,5 ml; factor de crescimento epidérmico humano recombinante , 0,5 ml; transferindo, 0,5 mL) à 500 ml HBM.
      3. Filtrar em condições estéreis através de um ou de 0,45 um filtro de 0,22 uM utilizando uma unidade de filtro de topo de garrafa ou de um filtro de ponta de seringa.
   2. Determinar a densidade celular de hepatócitos humanos primários, células de Kupffer e células estreladas por contagem em um hemocitómetro após cada tipo de célula foi descongelado de acordo com as instruções dos fabricantes.
   3. Combinar hepatócitos humanos primários, células de Kupffer e células estreladas numa razão 80:10:10 pelo número de células em meios de CMH, que foi aquecido a 37 ° C num tubo cónico.
      Nota: O volume do material a ser usado depende do número total da célula específica para a aplicação e deve ser determinada por The usuário.
   4. Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 520 xg a 20 ° C.
   5. Aspirar o sobrenadante, deixando para trás o sedimento celular.
   6. Ressuspender o sedimento de células em meio de HCM, para se obter uma suspensão de células contendo 1000 células por meios 40 ul. O volume total é dependente do número de esferóides a ser produzido.
   7. Transferir a suspensão de células a placas de 96 poços gota formato de suspensão. Adicionar um total de cerca de 1000 células para cada poço na CMH e manter a 37 ° C, em 5% de CO ₂ durante 3 dias, durante o qual esferóides multicelulares formam.
   8. Recolhe esferóides fígado a partir do prato de gota suspensa usando um pipetador. Transfira para um tubo de 15 ml estéril.
2. esferóides fígado Bioprint em bioink hidrogel específico do fígado
   1. Prepara-se uma formulação de fígado contendo ECM bioink hidrogel tal como descrito no Passo 1, utilizando 8% PEGDA e 8% de PEG com 8 braços alcino como agentes de reticulação. Use esta combinação para a sua capacidade em resulting em um hidrogel de perto no módulo de elasticidade ao corte de tecido do fígado nativo.
   2. Deixe os esferóides se depositam no fundo do tubo cónico em que foram colocados no passo 3.1.7. Isso varia de acordo com o tamanho e densidade esferóide, mas geralmente ocorre dentro de 1-2 min. Remova toda a mídia com cuidado aspiração ou com uma pipeta.
   3. Transferir o volume desejado de solução de hidrogel bioink preparada de fresco ao tubo cónico contendo os esferóides. Geralmente, é adequado um volume de 10% -25% maior do que o volume da construção 3-D a ser impresso. Cuidadosamente pipeta cima e para baixo para voltar a suspender os esferóides na solução de hidrogel bioink. Transferir para um cartucho bioprinter usando uma pipeta ou pipeta serológica.
   4. No interior do cartucho de bioprinter, permitir que a solução submetida à primeira fase de reticulação (reacção tiol-acrilato) durante 30 min.
      Nota: Dependendo do tamanho do esferóide, o cartucho pode ter de ser rodado lentamente ou o conteúdo pode ter de ser misturada comuma espátula estéril para manter os esferóides distribuídos por todo o bioink durante a fase de uma reticulação. Isto é menos de uma necessidade para bioinks preparados com células em suspensão em vez de esferóides.
      Nota: Após a fase 1 de reticulação, os usuários têm uma janela de funcionamento de várias horas. No entanto, recomenda-se realizar o processo de bioprinting rapidamente para melhorar a viabilidade celular.
   5. Após uma fase de reticulação, utilizar um dispositivo bioprinting para criar estruturas de hidrogel desejados contendo os esferóides hepáticos primários (ou outras células).
      Nota: Esta tecnologia proporciona um sistema para biofabricating uma ampla variedade de estruturas. Parâmetros tais como o volume total, o número de células ou esferóides, a geometria da estrutura de impresso, e o substrato sobre o qual são impressas as construções são altamente dependentes dos objectivos do utilizador.
   6. Após a deposição para a configuração desejada, administrar luz UV durante 2-4 segundos para iniciar o mecanismo de reticulação secundária, estabilizando a constructs e aumento da rigidez para o nível desejado.
      Nota: A concentração de PEG-alcino, e, assim, a densidade global de reticulação final, controla principalmente a rigidez construção final.
   7. Repetir o 3.2.4 e 3.2.5 passos, a fim de criar estruturas de várias camadas.

Resultados

Quando os processos acima descritos são seguidos correctamente, hidrogeles devem conter um perfil bioquímico específico para o tipo de tecido alvo, ²⁰ para permitir um elevado grau de controlo sobre bioprinting e módulo de elasticidade final, e ³⁴ suportam células viáveis ​​funcionais em construções de tecido.

hidrogel Personalização
Para melhor fígado nativo mímico...

Discussão

Existem vários componentes que são essenciais para considerar quando se tenta biofabricate 3-D construções de tecido, para eventual utilização em humanos ou para aplicações de rastreio in vitro. Empregando os componentes celulares adequadas determina o fim funcionalidade potencial, enquanto o próprio dispositivo biofabrication determina a metodologia geral para atingir a construção final. O terceiro componente, o biomaterial, é igualmente importante, uma vez que serve duplo papel. Especificamente, o...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronic acid	Sigma	53747
Gelatin	Sigma	G6144
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone	Sigma	410896
Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)	ESI-BIO	GS315	Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)
PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa	Creative PEGWorks	PSB-887
Primary human hepatocytes	Triangle Research Labs	HUCPM6
Primary human liver stellate cells	ScienCell	5300
Primary human Kupffer cells	Life Technologies	HUKCCS
Hepatocyte Basal Media (HBM)	Lonza	CC-3199
Hepatocyte Media Supplement Kit	Lonza	CC-3198	HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5 ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5 ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 ml; insulin, 0.5 ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 ml; transferring, 0.5 ml)
Triton X-100	Sigma	T9284	Other manufacturers are ok.
Ammonium hydroxide	Fischer Scientific	A669	Other manufacturers are ok.
Fresh porcine cadaver tissue	n/a	n/a
Lyophilizer	any	n/a
Freezer mill	any	n/a
Bioprinter	n/a	n/a	The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.
Hanging drop cell culture plate	InSphero	CS-06-001	InSphero GravityPlus 3D Culture Platform