Imagem raciométrica de pH extracelular no biofilme dentário

Resumo

Um corante raciométrica sensível ao pH é utilizado em combinação com a microscopia de varrimento a laser confocal e análise de imagem digital para monitorar o pH extracelular em biofilmes dentários em tempo real.

Resumo

O pH em biofilmes bacterianas nos dentes é de importância central para a cárie dentária, uma doença com alta prevalência em todo o mundo. Nutrientes e metabólitos não são distribuídas uniformemente em biofilmes dentais. Uma interacção complexa de sorção de reacção e com a matéria orgânica no biofilme reduz os caminhos de difusão de solutos e cria gradientes íngremes de moléculas reactivas, incluindo os ácidos orgânicos, entre os biofilme. métodos microscópicos fluorescentes quantitativos, tais como a imagiologia de tempo de vida de fluorescência ou ratiometry pH, pode ser utilizado para visualizar o pH em diferentes microambientes de biofilmes dentais. pH ratiometry explora um deslocamento dependente do pH na emissão de fluorescência de corantes sensíveis ao pH. O cálculo da razão de emissão em dois comprimentos de onda diferentes permite a determinação do pH local em imagens microscópicas, independentemente da concentração do corante. Contrariamente ao microeléctrodos a técnica permite monitorar ambos os gradientes de pH verticais e horizontais em tempo real commecanicamente perturbar o biofilme. No entanto, é preciso ter cuidado para diferenciar com precisão entre os compartimentos extra e intracelulares do biofilme. Aqui, o corante raciométrica, seminaphthorhodafluor 4F-5- (e-6) ácido carboxílico (C-SNARF-4) é empregue para monitorizar o pH extracelular in vivo em biofilmes dentais cultivadas espécies de composição desconhecida. Após a exposição a glicose do corante é up-concentrada dentro de todas as células bacterianas nos biofilmes; É, assim, usado tanto como uma mancha universal de bactérias e como um marcador do pH extracelular. Após a aquisição da imagem microscópica confocal, a biomassa bacteriana é removida de todas as fotos usando o software de análise de imagem digital, que permite calcular exclusivamente pH extracelular. ratiometry pH com o corante proporcional está bem adequado para o estudo do pH extracelular em biofilmes finos de até 75 um de espessura, mas está limitada ao intervalo de pH entre 4,5 e 7,0.

Introdução

O método descrito aqui permite a monitorização do pH extracelular em biofilmes dentais na gama entre 4,5 e 7, utilizando o corante raciométrica seminaphthorhodafluor 4F-5- (e-6) ácido carboxílico (C-SNARF-4), em combinação com a microscopia de varrimento a laser confocal e análise de imagem digital. O corante fluorescente empregue é sensível ao pH e exibe uma mudança na sua emissão fluorescente, dependendo do estado de protonação. A emissão fluorescente dos picos de moléculas protonadas a 580 nm, e a emissão da molécula desprotonado em 640 nm ^1. A razão entre as intensidades de emissão fluorescente em duas janelas de detecção que compreende os dois picos de emissão (576-608 nm e 629-661 nm) reflecte, portanto, o pH na fase líquida, independentemente da concentração de corante. Com um valor _de pKa de 6,4 ~ o corante é adequado para visualização em ambientes de pH moderadamente ácidas.

PH no biofilme bacteriano é de importância central para todos os processos metabólicos.No caso de biofilmes dentais, o pH na matriz extracelular é o factor de virulência chave para o desenvolvimento de cárie dentária. Longos períodos com pH baixo na liderança interface de biofilme-tooth para retardar a desmineralização do esmalte subjacente ^2. Devido à arquitectura tridimensional complexa de biofilmes, metabolitos, incluindo os ácidos orgânicos, não são uniformemente distribuídos através do biofilme. Altamente e menos microambientes acidogênicas pode ser encontrada em estreita proximidade espacial ^3.

Durante décadas, os gradientes de pH verticais em biofilmes foram gravadas com a ajuda de microeletrodos ^4-6. Enquanto eles oferecem uma boa resolução espacial devido ao seu tamanho pequeno ponta, eles não são adequados para monitorar gradientes horizontais. Além disso, a inserção do eléctrodo perturba o biofilme mecanicamente. técnicas microscópicas fluorescentes quantitativos oferecem a vantagem de visualizar mudanças de pH em diferentes áreas de um biofilme sem interferir mecânicance. Diferentes campos de vista microscópico pode ser escolhido livremente e fotografada várias vezes ao longo de períodos prolongados ^1,7-9. No entanto, ao interpretar imagens microscópicas de biofilme, é importante fazer a distinção entre a fluorescência derivada da biomassa microbiana e a fluorescência resultante a partir do espaço extracelular. Em condições acídicas, o pH no interior das células bacterianas é diferente do pH na matriz extracelular, como as bactérias transportar activamente protões através sua membrana celular à custa de adenosina trifosfato ^10. No contexto da cárie dentária, pH bacteriana intracelular não tem um impacto direto sobre o esmalte subjacentes enquanto baixo pH extracelular leva a desmineralização. Média de pH em imagens microscópicas que contêm ambas as áreas e bactérias livres de bactérias leva a resultados errados. A utilização de outras manchas, juntamente com o corante sensível ao pH, a fim de visualizar a biomassa bacteriana e diferenciar entre as áreas extra e intracelulares traz abo risco de contaminação de fluorescência do espaço extracelular e erros de medição ^11.

Por conseguinte, o presente manuscrito descreve a utilização do corante raciométrica numa função dupla; tanto como um marcador de pH e como uma mancha universal de bactérias. Como o corante é-se concentrado em células bacterianas, a combinação de imagem microscópica confocal e um processo de análise de imagem digital preciso permite determinar o pH extracelular no intervalo entre 4,5 e 7,0 em biofilmes finos dentários.

Protocolo

O protocolo experimental foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética de Aarhus County (M-20100032).

1. confocal microscópica Calibração do Ratiometric Dye

1. Para aquisição de imagem, use um microscópio invertido confocal equipado com uma incubadora, uma objectiva de imersão em água abertura 63X / 1.2-numérico, uma linha de laser 543 nm e um detector de META.
2. Preparar tampão HEPES soluções de reserva (50 mM, ajustado a pH 4,5-8,5 em passos de 0,1 unidades de pH). Pipetar 100 l de cada solução nas cavidades de uma placa de 96 poços de fundo claro, por microscopia de fluorescência.
3. Usar luvas de borracha nitrílica ao manusear o corante ratiometric C-SNARF-4. Prepara-se uma solução de estoque 1 mM do corante em sulfóxido de dimetilo. Adicionar 5 uL da solução stock a cada poço com tampão HEPES. Colocar a placa de 96 poços sobre o microscópio.
4. Ligue o microscópio. Abra o software microscópio. Clique nos seguintes painéis: Adquirir → Laser; Adquirir → MICRO; Adquirir → Config; Adquirir → Digitalização; Adquirir → Stage. Aquece-se a incubadora a 37 ° C.
5. Ligue a linha de laser 543 nm, clicando sobre o laser 543 nm e o botão "On" na janela "Controle Laser". Escolha a objetiva de imersão 63X / 1.2-numérico água abertura na janela "Controle Microscópio".
6. Defina o detector META para monitorar simultaneamente a fluorescência dentro de 576- a 608 nm (verde) e 629- a 661 nm intervalos (vermelho) ( "Controle de Configuração" → "ChS"). Ajustar a potência do laser ( "Controle de Configuração" → "Excitação"). Defina o pinhole para produzir uma espessura de corte óptico de 1,6 mm ( "Control Scan" → "Pinhole").
7. Adquirir uma imagem de cada solução tampão de HEPES, 5 mm acima do fundo de vidro da placa de 96 poços. Nota: Assim que o plano de focagem está situado por baixo do fundo de vidro, sem luz fluorescente pode ser vistona tela. Depois de cada terceira imagem, defina a potência do laser para zero e ter uma imagem para a subtração de fundo.
8. Realizar o experimento de calibração em triplicado (1,2-1,7).
9. Determinar a intensidade de fluorescência média e desvio padrão, em todas as imagens vermelhas e verdes.
   1. Calcula-se a relação R e erro padrão da média, S _R, para cada imagem de acordo com as equações (1) e (2)
      (1)
      (2)
      g, r, s _g e s _r são as médias e desvios-padrão nas respectivas imagens verde e vermelho. b _g, b _r, s _bg e s _l são os valores correspondentes para as imagens de fundo. n ² é o número de pixels fotografada.
   2. Traçar as razões calculadas para cada valor de pH a partir de três experiências de calibração replicar num diagrama e construir uma curva ajustada a partir desta série de pontos de dados (ou seja, utilizando o software SigmaPlot 13). Fazer uma função matemática da curva ajustada, que pode converter proporções em valores de pH ^10.

2. Recolha de In Situ Grown amostras Dental biofilme

1. Selecione voluntários que preenchem os critérios de inclusão e exclusão relevantes para o estudo. Faça impressões de alginato de sua arcada dentária superior e inferior. Faça modelos de gesso de estas impressões e fabricar um splint de acrílico no maxilar inferior. Projetar a tala com flanges de acrílico bucais ligados por um fio ortodôntico lingual que permite que o voluntário a morder oclusão normal ^12.
2. Recessões broca nos flanges vestibular do splint de acrílico (Figura 1 ) Com a ajuda de fresas acrílico dental para permitir a inserção de placas de vidro para recolha do biofilme. A profundidade das recessões deve ser de pelo menos 1,5 mm, enquanto a largura e o comprimento das recessões podem variar, dependendo do número de placas de vidro a serem inseridos.
3. Para a recolha de biofilme, utilizar placas feitos por medida não fluorescentes de vidro (4 x 4 x 1 ^mm3), com uma rugosidade da superfície de granalha de 1200, a fim de imitar o padrão de colonização em esmalte natural, ^11.
4. Esterilizar os pavimentos de vidro por autoclavagem antes da montagem. Montar as placas de vidro com cera pegajoso nas depressões nos flanges bucais de cada lado ligeiramente recuadas para a superfície da superfície de acrílico de modo a proteger o biofilme de forças de cisalhamento exercidas pelo movimento dos mordentes ^11.
   Nota: O número de placas de vidro colocadas numa recessão pode variar entre 3 e 14, dependendo do objectivo do estudo.
5. Insira o aparelho na boca do voluntário. Instrua o Volunteer para reter o dispositivo intra-oralmente durante todo o período experimental. Instruir o voluntário para guardar o aparelho em um recipiente retentor ortodôntico com um pedaço de lenço de papel molhado (para mantê-lo húmido) à temperatura ambiente durante a escovação dos dentes e da ingestão de alimentos e outros do que a água bebidas. Instrua o voluntário para não tocar nos flanges acrílico bucais com as placas de vidro enquanto colocar e retirar o aparelho.
   Nota: O período experimental podem variar dependendo do objectivo do estudo (um dia a várias semanas).
6. Cuidadosamente remover as placas de vidro a partir do aparelho no final do período experimental. Remover a cera pegajoso em torno das placas, com uma faca e transferi-los com um par de pinças para um recipiente fechado, o biofilme voltada para cima, até que a análise microscópica. Mantenha o recipiente úmido com lenço de papel molhado. Realizar imagem pH dentro de poucas horas após a coleta do biofilme.

3. biofilme pH de imagem

1. Prepararsalivar solução por adição de ditiotreitol à saliva recolhida de acordo com o método de De Jong et ai. ^13. Titula-se a solução para pH 7,0 salivar e adicionar glucose a uma concentração de 0,4% (peso / vol). Pipetar 100 ul por biofilmes ser analisadas numa placa de 96 poços com fundo de vidro para microscopia. Adicionam-se 5 ul de corante raciométrica por poço.
2. Colocar a placa de 96 poços na platina do microscópio. Ligue o microscópio e a linha de laser 543 nm. Aquece-se a incubadora a 37 ° C. Use as mesmas configurações microscópio como para a calibração do corante (veja as etapas 1,5-1,6). Esperar durante 30 min, até que a placa de 96 poços atingiu a temperatura de trabalho.
3. Pegar uma ou mais placas de vidro com um conjunto magro de pinças e colocá-los nos poços cheios de saliva, uma laje por poço, com os biofilmes viradas para baixo.
4. Adquirir imagens individuais ( "Control Scan" → "single") ou Z-stacks ( "Control Scan" → "Start") spanning a profundidade dos biofilmes em diferentes áreas. Para adquirir z-stacks escolher o número de fatias a ser trabalhada ( "Scan Control" → "Definições Z" → "Num fatias") e marque o z-position para a primeira e a última fatia no software microscópio ( "Controle de Digitalização "→" Configurações Z "→" Mark First ";" Mark Last ").
   Nota: Z-pilhas com uma profundidade de até 75 fim pode ser adquirido com um bom contraste entre as áreas extracelulares e intracelulares.
5. Para acompanhar as mudanças de pH em um campo de vista microscópico ao longo do tempo, marcar o xy-posição no microscópio software ( "Stage e Controle Focus" → "Mark Pos") e tomar imagens repetidas em momentos consecutivos ( "Control Scan" → " Solteiro"). tomar regularmente imagens com a potência do laser fixada em zero por subtração de fundo.

4. Análise de Imagem Digital

1. para export as imagens microscópicas como arquivos TIF, use o lote exportação do arquivo do software microscópio ( "Macro" → "Batch File Export"). Marque os arquivos a serem exportados e salvar imagens dos canais vermelho e verde em pastas separadas como TIF-arquivos ( "Start Batch Export"). Renomear os arquivos em ambas as pastas, dando-lhes números sequenciais.
2. Importar a série de imagens vermelho e verde em um software como o daime (análise de imagem digital em ecologia microbiana) ^14. Segmento as imagens dos canais verdes com limiares escolhidos individualmente brilho (segmento → segmentação → limiar automático personalizado). Escolha os limiares de brilho com cuidado (tipicamente entre 20 e 80), de modo a que todas as bactérias (mais brilhante do que a matriz extracelular), mas não a matriz será reconhecido como objectos durante segmentação. Verificar visualmente se as regiões reconhecidas como objectos correspondem bem ao biomassa bacteriana.
3. Transferir a camada de objeto do g segmentadaimagens reen canal para o canal vermelho imagens correspondentes (segmento → camada objecto de transferência). Use a função de editor de objetos para rejeitar e excluir todos os objetos nas imagens dos canais vermelho e verde. Agora, apenas a matriz extracelular é deixado nas imagens de biofilme. Exportar a série de imagens processadas como arquivos TIF.
4. Importar a série de imagem em ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij; v.1.47). Determinar a intensidade média de fluorescência nas imagens de fundo tomadas com o laser desligado (Analisar → Histograma). Subtrair o fundo adequado a partir das imagens vermelhas e verdes (Processo → Math → Subtrair).
5. Ainda em ImageJ, divida a série de imagens verde (G1) por si só (Processo → calculadora de Imagem). Em seguida, multiplique a série imagem resultante (G2) com a série de imagens verde (G1). Isto irá produzir uma série de imagens (G3), onde NaN é atribuído a todos os pixels pertencentes a áreas que foram reconhecidos como objetos em daime. Proceda tele mesmo modo com a série de imagens vermelho (R1 / R1 = R2; R2 x R1 = R3).
   Observação: Como a biomassa bacteriana foi removido a partir das imagens no passo 4.3, a intensidade fluorescente é 0 nestas áreas. Etapa 4.5 é necessário para converter o valor de 0 a NaN, o que permite o cálculo proporção no passo 4.6.
6. Aplique o filtro 'média' (Processo → Filtros → Média; raio: 1 pixel) para compensar o ruído detector. Divida a série de imagens verde pela série imagem vermelha (Processo → calculadora de Imagem). Isto resulta numa proporção verde / vermelho para todos os pixels restantes no espaço extracelular das imagens. Use falsa coloração para representação gráfica das proporções nas imagens (Tabelas Imagem → Lookup). Calcular a relação média para cada imagem (Analisar → Histograma).
7. Converter os rácios de verde / vermelho para valores de pH de acordo com a função instalado sob 1.9.2). Nota: Um exemplo para dados de calibração e curva ajustada pode ser visto na Schlafer etal, 2015 ^11.

Resultados

O método apresentado permite a monitorização extracelular pH cai em diferentes microambientes de biofilmes dentais na gama de pH de 4,5 a 7, em tempo real. Se as condições experimentais são escolhidas como descrito acima, o pH começa a cair em todas as áreas dos biofilmes logo após a exposição à glicose.

Quando o pH em um biofilme gotas, as células bacterianas se tornam visíveis dentro de pouco tempo (<1 min),...

Discussão

Monitorização microscópica de pH biofilme proporciona várias vantagens, como comparado com eléctrodos ou microeléctrodos ^4-6 medições. técnicas microscópicas permitir determinar pH com uma alta resolução espacial e permitir a captura gradientes de pH horizontais e verticais em biofilmes sem perturbar o biofilme mecanicamente. As tentativas anteriores de monitoramento do pH microscópico, no entanto, não conseguiram diferenciar entre pH extracelular e intracelular no biofilme ^1,7,9. Dev...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss LSM 510 META	Zeiss	N/A
C-Apochromat 63X water immersion objective	Zeiss	N/A
XL Incubator	PeCON	N/A
SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid	Life Technologies	S23920
Dimethyl sulfoxide	Life Technologies	D12345
HEPES	Life Technologies	11344-041
Costar 96-well black clear-bottom plate	Fisher Scientific	07-200-567
Custom-made glass slabs (4 x 4 x 1 mm3; 1,200 grit)	Menzel	N/A
Alginate impression material	GC Corporation	N/A
Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs	Axis Dental	LS-906
Orthodontic retainer containers	Spark Medical Equipment Co., Ltd	SK-WDTC01
Sticky wax	Dentsply	N/A
Chewing paraffin wax	Ivoclar Vivadent AG	N/A
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	D0632	Used during preparation of salivary solution
0.45 µm and 0.2 µm syringe filters	Sigma Aldrich	CLS431220; CLS431219
daime	University of Vienna, Austria	http://dome.csb.univie.ac.at/daime
ImageJ	NIH, Bethesda, Maryland, USA	http://imagej.nih.gov/ij/