A completa e atualizada "Rotifer policultura Method" para a criação de Primeira Zebrafish Alimentar

Resumo

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

Resumo

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

Introdução

O peixe-zebra (Danio rerio) é um animal de laboratório pré-eminente utilizada em um número crescente de disciplinas científicas, incluindo, mas não limitado a genética do desenvolvimento, toxicologia, o comportamento, a aquicultura, biologia regenerativa, ea modelagem de muitas doenças humanas ^{1 - 5.} Embora a espécie é relativamente fácil de manter em laboratório, há uma série de desafios de gestão associados à sua cultura ^6. A mais proeminente delas é larvicultura, especialmente quando o peixe primeiro começa a alimentar a inflação subseqüente à bexiga de gás ^7. Sob condições normais, controlados, este evento desenvolvimento ocorre na ~ 5 dias pós-fertilização (dpf), com os seguintes 3 ​​- 5 dias de crescimento, sendo particularmente crítico ^7. A dificuldade técnica central durante este estágio é atender adequadamente as exigências nutricionais do primeiro larvas alimentação - itens de alimentação deve ser de tamanho adequado, Digestible, atraente e disponível em uma base quase contínua, sem a criação de desperdício excessivo em tanques de cultivo. Historicamente, este foi alcançado normalmente através da apresentação de numerosas pequenas quantidades de alimentos para os peixes em tanques, junto com a rotina ^8,9 troca de água. Enquanto estes métodos são, até certo grau de sucesso, eles não são eficazes, requerem entradas de trabalho elevadas, e retornar única variável e as taxas de crescimento limitadas e ^{sobrevivência} de 10.

Na natureza, larvas do peixe, presumivelmente, se alimentam de zooplâncton abundante pequeno presente na coluna de água ^11. Por esta razão, os protocolos que incorporam larvicultura live feeds, tais como Paramecium, rotíferos e Artemia são tipicamente mais eficiente ^7. Em 2010, Best e co-autores demonstraram que era possível crescer zebrafish larval em água salobra estática, juntamente com rotíferos de água salgada para os primeiros 5 dias de alimentação exógena ^12. Esta abordagem, que aproveitares a alta produtividade natural de culturas de rotíferos para fornecer amplo, presa altamente nutritivos sem poluir a água, produz muito elevadas taxas de crescimento e sobrevivência das larvas com entrada de baixo de trabalho ^12,13. Nos últimos anos, um número crescente de laboratórios em todo o mundo adotaram variações deste protocolo, e muitos estão agora a cultura de rotíferos de forma contínua para apoiar os sistemas de viveiro ^14.

Ao longo dos últimos anos, os métodos para ambos rotifer / policultura peixe-zebra e produção de rotíferos foram aperfeiçoada e melhorada para se tornar mais padronizado e facilmente escalável. Este artigo fornece instruções passo-a-passo para 1) produção de rotíferos contínuo e robusto e 2) o estabelecimento do sistema / policultura peixe-zebra rotifer usado para apoiar o crescimento robusto de peixe para os primeiros 5 dias de alimentação exógena.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Rotifer Cultura

1. Componentes básicos de um sistema de cultura utilizando um recipiente de 100 L Cultura
   1. Reúna todos os componentes para a instalação cultura de rotíferos. A configuração cultura rotíferos consiste de um recipiente de cultura (CV) para cultivar as rotíferos; um recipiente semelhante para manter rotíferos desabastecimento dos silos (vaso de cultura desabastecimento dos silos, FCV); um frasco de fundo redondo de incubação (alimentação Reservoir, FR) para o armazenamento da mistura de alimentação algas (AFM); um suprimento de ar (AS) para arejar o CV, FCV e FR; uma bomba peristáltica com um temporizador de medição (PMT) para controlar o fornecimento de alimentos para as algas para o CV e FCV; e um filtro de partículas fio (FPF) que fica dentro do CV.
      NOTA: A lista completa de consumíveis e componentes é fornecida na Lista de Materiais.
2. Configuração
   1. Eleve o CV e FCV em um carrinho ou mesa para que as culturas podem ser facilmente colhida através de um dreno encaixe em um cont coleçãoainer (Figura 1). Utilize uma tubagem de alimentação de ar flexível para ligar o AS a um comprimento de tubagem rígida em cada recipiente de cultura. Certifique-se de que a tubagem é suficientemente longo para fornecer ar para a parte inferior do CV ou FCV.
   2. Usar uma linha de ar com pequena capacidade para ligar o AS a um comprimento de tubagem rígida que se estende para a parte inferior da FR que contém a AFM. Instale uma válvula em cada linha de ar para regular o fluxo de ar. Ligue o FR para o PMT com tubagem de alimentação, e rodar o tubo do PMT para um buraco perfurado no lado do CV / FCV, perto do topo. Figura 1.
3. Comece
   1. Encher o vaso de cultura a 90% do volume disponível com água de osmose reversa (RO). Se RO não estiver disponível, usar, água limpa sem cloro municipal; No entanto, uma avaliação de risco a segurança biológica deve ser realizada para assegurar que não há organismos potencialmente patogénicos estão presentes na água da fonte. NOTA: Tal análise pode ser realizadapor qualquer laboratório de ensaio de água qualificado.
   2. Dosear a água vaso de cultura com sal aquário para chegar a uma salinidade de 15 g / L. Definir o fluxo de ar para dentro do recipiente de modo a que mantém uma "ferver", e, em seguida, adicionar lentamente a quantidade medida de sal para o recipiente de cultura até que esteja completamente dissolvido por o arejamento. Continue gaseificar a água for> 1 hora para garantir que ele está totalmente oxigenado.
   3. Faça a mistura de alimentação de algas. Para 3 L de limpo, sem cloro (0 ppm) de água doce adicione 100 g de _NaHCO3 e 100 g de amoníaco neutralizador (hydroxymethylsulfonate de sódio). Este último reagente fornece o benefício adicional de neutralizar qualquer cloro residual da água da torneira ou água sanitária resíduos de desinfecção de equipamento de cultura. Ele é fundamental para garantir que estes compostos são totalmente dissolvido. Em seguida, adicionar 1 L de concentrado de algas (peso seco de biomassa ~ 15%). Adicione a mistura de alimentação para o FR e armazenar a 4 ° C.
   4. Adicionar uma cultura inicial de 5-10.000.000 rotíferos Brachionus plicatilis ao CV contendo o aerado 15 g / L salinidade da água. Se os rotíferos foram refrigerados durante o transporte ou armazenagem, devem ser gradualmente (durante 30 minutos ou mais) aclimatados à temperatura da água no vaso de cultura (25 - 27 ° C).
   5. Ligue o PMT e começar a bombear a alimentação para o recipiente de algas de cultura de rotíferos. Usando o recurso de temporizador da PMT, definir a taxa de entrega de mistura de alimentação algas para que ~ 1,6 ml de mistura de alimentação algas é entregue por milhão de rotíferos na cultura, por dia. Distribuir as alimentações em pequenas porções, a intervalos regulares ao longo de um período de 24 horas; a mais frequente das mamadas, o melhor.
   6. Calibrar a taxa de entrega da bomba rodando manualmente na PMT por um determinado período (por exemplo, 1 min) e recolher as algas que ele bombeia durante este intervalo em um cilindro ou proveta graduada. Por exemplo, se as doses de CGP 5 ml de algas em 1 min, em seguida, a taxa de dose seria5 ml de algas / min.
   7. Calcula-se a taxa de alimentação diária requerida através da multiplicação do número de rotíferos presentes, em milhões, por 1,6 ml. Por exemplo, uma cultura de rotíferos com um tamanho da população de 100 milhões de rotíferos exigiria ~ 160 ml de ração por dia (100 x 1,6 mL).
   8. Defina a PMT para dosar a exigência alimentação diária total em intervalos regulares ao longo de um período de 24 horas. Por exemplo, a entrega de uma quantidade diária total de alimentação de 160 mL pode ser entregue em porções, uma vez a cada 3 horas ao longo de um período de 24 horas utilizando um conjunto PMT com uma taxa de bombagem de dosagem de 5 ml / min, durante 4 min, 8 vezes por dia (5 ml / min x 4 min = 20 ml x 8 alimentações = 160 mL).
   9. Permitir que a cultura a crescer até que ele gera a população necessária, normalmente para 48-72 h, antes da colheita. Aos 24 h pós-arranque, adicione os filtros de partículas fio dental para o recipiente de cultura e começar a manutenção normal.
4. Manutenção
   NOTA: A cultura opera em uma base contínua e exige routinmanutenção e que, idealmente, deve ser realizada ao mesmo tempo em cada dia, na seguinte sequência.
   1. Encha o FCV a 90% do volume disponível com limpo, sem cloro água doce, dosados ​​com / L sais aquário de 10 g. Assegure-se que a água é bem misturado, e que todo o sal estar completamente dissolvido. Definir o fluxo de ar para dentro do recipiente de modo a que mantém uma "ferver". Meça a salinidade com um refratômetro e garantir que a salinidade é de 10 g / L. É fundamental para atingir este objectivo e não exceder esse valor.
   2. Experimente os rotíferos no CV: Certifique-se de que a cultura é bem misturado, em seguida, recolher amostras de 3 por 2 - 3 ml cada um usando uma pipeta de transferência ou autopipettor, a partir de diferentes partes da cultura. Ao combinar estas amostras em um tubo ou frasco de tamanho conveniente (por exemplo, 10 ml).
   3. Transferir 1 - 2 ml da amostra combinada para uma placa de Petri de modo que possa ser visualizada sob um microscópio de dissecação. Para verificar a qualidade da cultura (do comportamento de nataçãorotíferos, presença de ovos isoladas, contaminando protozoários).
   4. Imobilizar os rotíferos na amostra combinada restante através da adição de 100 ul de 50% de solução de iodo de Lugol a amostra. Em poucos segundos depois da adição dos Lugols, observar os rotíferos para parar de nadar. Agora, conte facilmente os rotíferos.
      NOTA: O etanol, água sanitária diluída, ou o vinagre pode ser usado em lugar de Lugol. Vinagre (2 gotas / 10 ml) tem a vantagem de ser não perigosos, não perder resistência ao armazenamento em soluções de branqueamento e de iodo pode, e não fazendo com que o contrato de rotíferos, de modo que a coroa de cílios e o "pé" permanece estendido e o animais olhar mais natural.
   5. Garantir que a amostra é bem misturado (rotíferos imobilizadas vai resolver rapidamente), em seguida, tomar rapidamente uma ml subamostra ~ 2 em uma pipeta de plástico e dispensam 1 ml em uma contagem de slides Sedgewick-Rafter (20 x 50 quadrados de 1 mm) (Figura 2 ). Usando um microscópio de dissecação ou composto, contar os rotíferos intactas e a total número de ovos associadas a estes rotíferos (Figura 2). Contagem tanto da área de slide como necessário contar ~ 100 rotíferos. Calcule o número de rotíferos por ml, e gravar isso em uma planilha ou um diário de bordo.
   6. Colheita ~ 30% do volume dos rotíferos na cv: Remover o fornecimento de ar e filtro de fio, abrir lentamente a válvula na parte inferior da CV e permitir que a água flua para dentro de um colector de plâncton com um crivo de malha 53 | im. Recolher a água que flui para fora do fundo do colector depois de filtrar dentro de um balde ou de drenagem. Use uma suave para o fluxo moderado para evitar danos aos rotíferos. Não permita que os rotíferos para secar na tela.
   7. Por razões de consistência, é conveniente estabelecer o FCV com um número padrão de rotíferos cada dia. Portanto, com base no volume CV densidade de rotíferos e colheita conhecido, ajustar o volume total de FCV para alcançar uma densidade final coerente (por exemplo., 1500 rotíferos / ml). Adicione o roti colhidaferências ao FCV: Gentilmente transferir os rotíferos a partir da tela da coleção utilizando um frasco de lavagem preenchido com água salgada limpo (10 - 15 g / L). Inverter a tela sobre o FCV e lavar os rotíferos no FCV com um fluxo suave de água salgada. Inicie a PMT para entregar alimentos para animais (~ 1,57 ml por milhão de rotíferos por dia) para o FCV.
   8. Esfregue todo o interior do CV com uma escova de nylon limpo e macio ou uma almofada matagal.
   9. Fazer uma nova mistura de 15 g / L de água, adicionando a quantidade apropriada de sal a uma quantidade medida de água RO limpos em um balde de 5 galões para substituir o volume de água perdida para a colheita. Adicionar o sal à água no balde e agita-se vigorosamente até que esteja completamente dissolvido, e em seguida, adicionar ao CV.
   10. Usando um spray de alta pressão em uma pia, lavar o filtro fio até que ele esteja livre de detritos, e, em seguida, devolvê-lo ao CV.
   11. Ajustar as taxas de alimentação de algas entregue ao CV, alterando a duração de cada evento de dosagem, de acordo com a contagem diária de rotíferos / ml.Use os cálculos apresentados no passo 1.3.8, acima, para determinar a quantidade adequada de alimentação para ser entregue.
   12. Aproximadamente 24 horas mais tarde, repita o processo. Comece a colheita das rotíferos restantes no FCV (que não eram necessários para o dia anterior) da mesma maneira como descrito acima (etapas 1.4.2 - 1.4.10). Concentrá-las em 2 L de água fresca e limpa sem cloro (5 g / l de sal). Estes podem ser armazenados a 4 ° C, como uma fonte de apoio, ou usado para alimentar fases posteriores de peixe, para além do que é descrito neste protocolo.
       NOTA: Este protocolo permite até 2 - 3 dias de manutenção de cultura reduzida (com alimentação automática normal), porque os rotíferos no CV pode tolerar a omissão de colheitas sem consequências graves.

2. A policultura

1. Configuração
   1. Coletar embriões de peixe-zebra de um evento de desova por vazamento embriões gerados através de um coador de chá e, em seguida, enxaguar cuidadosamente com fis estéreish de água (ou qualquer outra fonte de não-contaminada da solução apropriadamente condicionado, por exemplo, meio de embrião, E3, etc.) a partir de um frasco de lavagem em placas de Petri.
   2. Incubar os embriões a 25 - 28 ° C em placas de Petri a uma densidade de 40 - 50 embriões por placa durante 5 dias.
   3. Começar a fase de policultura no dia 5 pós-fertilização, ou quando maior do que 90% das larvas eclodidas natação são activamente-se na coluna de água.
2. Inoculação
   1. Adicionar 500 ml de cultura de rotíferos directamente a partir do FCV a um tanque de viveiro 3,5 L; inclusão de água cultura de rotíferos fornece alimentação de algas que mantém o conteúdo nutricional dos rotíferos durante policultura.
   2. Delicadamente despeje a larvas de uma placa de Petri para o tanque viveiro. Assegure-se que nenhuma larva permanecem no prato.
   3. Adicionar 500 ml de água limpa e peixes condicionado a partir de um sistema de recirculação de água ou fonte dedicada ao tanque para atingir um volume final de 1 L e um s definitivaalinity de 5 g / L.
      NOTA: Este salinidade é fundamental, porque a sobrevivência larvas do peixe será negativamente impactada se a salinidade é> 7 g / L e sobrevivência rotifer será negativamente impactada se a salinidade <2 g / L.
3. Fase policultura
   NOTA: A fase policultura deve durar até 4 dias após a inoculação (de um total de 5 dias, correspondendo a 5-9 dias pós-fertilização).
   1. Observe a policultura tanque pelo menos uma vez por dia durante este período para garantir que os rotíferos e peixes estão presentes e em crescimento. Certifique-se de que os rotíferos são visíveis em toda a coluna de água. Certifique-se de que os os fishs também são visíveis na coluna de água, nadando entre os rotíferos.
   2. Iniciar o fluxo normal de água através do tanque. Coloque uma tela ou defletor sobre o porto de drenagem para garantir que as larvas não são lavadas para fora do tanque.
      NOTA: No final desta fase, o peixe vai ser grande o suficiente para consumir itens maiores presas, como Artemiaitens de alimentação náuplios ou processados ​​na faixa de tamanho de 75-125 mm.
      NOTA: As dinâmica das populações de rotíferos dentro de um tanque de policultura representante foram medidos por amostragem / rotíferos contando a partir do tanque da mesma maneira como descrito nos passos 1.4.2 - 1.4.5. Isto foi realizado uma vez por dia desde o início da fase de policultura até que foi completada.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

O sistema de cultura de rotíferos contínuo descrito aqui é dinâmica, e é normal que os números de rotíferos a flutuar numa pequena extensão ao longo do tempo se há variações nas taxas de alimentação e de colheita diárias. A população das rotíferos em uma das culturas activas nas instalações de aquacultura do Hospital de Crianças de Boston, mantida na forma descrita acima, foi monitorizado durante 30 dias (Figura 3). A densidade da cultura médio duran...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

A implementação bem sucedida do método policultura rotifer para a alimentação de peixes-zebra larval precoce exige protocolos eficazes para duas tarefas: o estabelecimento e manutenção de um sistema de cultura de rotíferos contínua para alimentar os peixes, e cultura de primeira alimentação larvas do peixe junto com rotíferos no mesmo tanque.

A configuração para um sistema de produção de água salgada rotifer contínua para os laboratórios de peixe-zebra primeiro descritos p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotifer Culture Infrastructure
100 L Culture Vessel	Aquaneering	Custom	Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve
5 Gallon Culture Bucket Kit	Reed Mariculture	CCS Starter Kit	Small volume culture vessel for small facilities
Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for air delivery
Mesh tube	Pentair Aquatic Ecosystems	RT444X	Mesh tube support for floss filter
Rotifer Floss	Reed Mariculture	Rotifer floss 12” x 42”	Particulate waste trap
Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD	Grainger	38M003	Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture)	Coral Vue	SKU: IC-LQD-DSR	Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Silicone Tubing	Cole Parmer		Tubing for algae delivery to rotifer vessel
Rigid Clear Tubing " O.D.,36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for air delivery to algae paste
Rigid Clear Tubing O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for algae delivery
Rotifers
Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L	Reed Mariculture	Type L 5 million	Rotifer stock culture for system startup
Rotifer Feed
Sodium hydroxymethylsulfonate	Reed Mariculture	ClorAm-X® 1lb tub	Ammonia reducer for algae feed mix
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S25533B	pH buffer for algae feed mix
Microalgae concentrate	Reed Mariculture	Rotigrow Plus® 1 liter bag	Nutritionally optimized rotifer feed
RG Complete	Reed Mariculture	RG Complete 6 oz bottle	All in one microalgae based feed for small scale cultures
Water Preparation
Reef Crystals Reef Salt	That Fish Place	198210	Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used).
Refractometer	Pentair Aquatic Ecosystems	SR6	measuring salinity
Rotifer Culture Equipment
Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns	Pentair Aquatic Ecosystems	BBPC20	Mesh screen for collecting rotifers
Scrub Pads	Pentair Aquatic Ecosystems	SCR-58	Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels
Scrub Brush
Bucket	Grainger Supply	43Y530	Graduated bucket for mixing culture water
Hatching Jar	Pentair Aquatic Ecosystems	J30	Storage of algae feed mix
Lugol’s Solution, Dilute	Fisher Scientific	S99481	Agent used to immobilize live rotifers for counting
Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid	Pentair Aquatic Eco-Systems	M415	Counting rotifers
Miscelleneous
Tea Strainer	Kitchenworks	971972	Used for collecting zebrafish embryos after spawning