Eliminação celular seletiva de Cultura 3D Mixed usando uma técnica de infravermelho próximo Photoimmunotherapy

Resumo

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Resumo

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Introdução

A eliminação de células específicas, sem danificar outras células é extremamente difícil, especialmente no tecido estabelecido, e não há uma necessidade urgente de um método de eliminação de células no campo da engenharia de tecidos. Hoje em dia no campo da medicina regenerativa, as culturas de tecido, utilizando células estaminais embrionárias (ES), células estaminais pluripotentes (PSCs), ou induzida por células estaminais pluripotentes (IPS) são materiais promissores ^1-3.

Embora esta regeneração de tecidos é promissor, a contaminação com células não desejadas é uma grande preocupação. Além disso, existe uma preocupação de segurança de tumorigenicidade após o transplante ^4,5. Embora muitos estudos têm-se centrado sobre estas questões para eliminar as células específicas, especialmente em medicina regenerativa ^6-8, nenhum método prático tem sido desenvolvido.

Perto photoimmunotherapy infravermelho (NIR-PIT) é um tratamento baseado em um anticorpo conjugat-fotoabsorventee (APC). Uma APC é constituído por um anticorpo específico de células monoclonais (mAb) e um fotoabsorvente, IR700. IR700 é um derivado de ftalocianina de sílica-hidrofílico e não induz por si só a fototoxicidade ^9. IR700 é covalentemente conjugada com o anticorpo através de resíduos de amida na cadeia lateral de moléculas de lisina. A APC liga-se moléculas alvo na membrana celular e, em seguida, induz necrose celular quase imediato após a exposição à luz NIR a 690 nm. Durante a exposição à NIR-luz, as rupturas de membranas celulares que levam à morte celular ^9-14. NIR-PIT tem provado ser eficazes com vários anticorpos ou fragmentos de anticorpos, incluindo o anti-EGFR, anti-HER2, anti-PSMA, anti-CD25, anti-mesotelina, anti-GPC3, e anti-CEA ^15-21. Portanto, NIR-poço pode ser usada contra uma ampla variedade de moléculas-alvo. Além disso, NIR-PIT é um tratamento bem controlado que permite tratamento selectivo de regiões específicas, restringindo o NIR-light irradiação ^18,22.

Aqui, apresentamos um método de eliminação célula específica usando NIR-PIT a partir de culturas em 3D mistos.

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Protocolo

Nota: O protocolo a seguir descreve as etapas necessárias para eliminar as células específicas usando NIR-PIT. Controles e outros detalhes sobre NIR-PIT e viabilidade celular pode ser encontrada em outro lugar ^18.

1. Conjugação de IR700 a anticorpos monoclonais (mAb)

1. Prepare o mAb de interesse a 2-5 mg / ml em solução (pH 8,6) 0,1 M de Na ₂ HPO _4.
2. Misture 6,8 nmol de mAb com 30,8 nmol de IR700 10 mM em Na ₂ HPO H ₄ solução 0,1 M (pH 8,6) num tubo de microcentrífuga e incubar à TA durante 1 h, coberto com folha de alumínio.
3. Lavar a coluna PD-10 (ver Tabela de Materiais / Equipamentos) com 15 ml PBS, duas vezes. Coloque a amostra a partir do passo 1.2.
4. Purifica-se a mistura através da coluna PD-10 por eluição PBS de acordo com as instruções do fabricante.
   Nota: Aqui, a eluição foi ao longo da cor banda de IR700. Para uma amostra de 300 ul, fracção de eluição PBS é tipicamente entre 2,5 ml a 4,4 ml.
5. Determine oconcentração de proteína com coloração com Coomassie, medindo a absorção a 595 nm com um espectrofotómetro ^9. Determinar a concentração de IR700 com absorção a 689 nm para confirmar o número de moléculas de fluoróforo conjugadas a cada molécula de Acm ^9.
   Nota: É importante para determinar um número de conjugação óptima de moléculas IR700 em um mAb com um espectrofotómetro. Geralmente, cerca de 3 moléculas de IR700 na molécula um mAb é óptimo para ambas in vitro e in vivo de trabalho. métodos de HPLC e SDS-PAGE pode ser usado para confirmar se o mAb e IR700 são obrigados ou não.
6. Armazenar a 4 ° C, depois de determinar a concentração de proteína.

2. Preparação de Cultura de Células 3D Misto (Mixed Spheroid)

1. Aplicar água estéril (cerca de 1 ml) na seção do reservatório placa de pendurar placas gota.
2. Prepare a várias proporções dos tipos de células de interesse - células A431-Luc-GFP e células 3T3-RFP -com cada amostra contendo 5000 células no total, suspensos em 50 ul de meio de cultura.
   Nota: Preparar 1: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 100, etc proporções de tipos de células de interesse em meios de cultura, dependendo do tipo de célula.
3. Incubar a mistura durante 5-7 dias a 96 em placa bem pendurado gota numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono. Alterar os meios de cultura a cada 2 dias. Nota: Para fazer o 3D esferóides precisamente, lidar com a placa suavemente, como gotas contendo células cair facilmente antes de formar formas 3D.
4. Observar a morfologia e tamanho dos esferóides utilizando um microscópio de campo claro invertido a 10X - 40X de ampliação. Nota: Embora dependa em tipos de células e o tamanho de gota suspensa de, assegurar que o diâmetro do esferóide é de cerca de 400-600 uM, após 7 dias de incubação em 96 a placa de suspensão bem gota.

3. In Vitro NIR-PIT para Cultura Celular 3D Mixed

1. Alterar a mídia da hanging placas gota a 10 ug / ml de conjugado anticorpo-fotoabsorvente (APC) meios que contêm, e incuba-se durante 6 h num incubador humidificado a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono.
2. Após 6 horas de incubação, lavar o esferóide duas vezes com meio de cultura fresco (vermelho de fenol livre). Gentilmente transferir o esferóide a um prato de fundo de vidro de 50 mm, com 100 ul fresco fenol meios de cultura livre vermelho usando um estéril 200 mL ponta da pipeta com a ponta cortada. Coloque um esferóide em cada prato.
3. Observar o esferóide com um microscópio de campo claro invertido para detectar a alteração da morfologia. Para observar os repórteres ópticos (por exemplo, GFP e RFP) usam microscópio de fluorescência com as seguintes configurações de filtro: GFP - filtro de excitação 469 nm e filtro de emissão de 525 nm; RFP - 559 nm, filtro de excitação, e um filtro de emissão de 630 nm.
4. Coloque o diodo emissor de luz (LED) acima do prato com fundo de vidro para irradiação.
   Nota: Os esferóides podem ser expostos a NIRluz quer no microscópio ou na capa laminar.
   1. Medir a densidade de energia da luz NIR com um medidor de potência óptica ^9. De acordo com esta medida, irradiar NIR-luz através de diodos emissores de luz (LEDs) que emitem luz em comprimentos de onda de 670 a 710 nm a 2 J / cm ^2.
      Nota: diodo emissor de luz pode penetrar profundidade máxima de aproximadamente 5 polegadas. Efeitos citotóxicos de NIR-PIT depende apenas dada energia, independentemente da densidade de potência e duração da exposição ^23.
5. Após a irradiação, a transferência do esferóide para uma nova placa de gota em suspensão com 50 ul de meio de cultura fresco e incubar durante um dia numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono.
6. Suavemente transferir o esferóide de um prato de vidro de fundo com 100 ul de meio de cultura fresco (sem vermelho de fenol), utilizando uma ponta de pipeta esterilizada de 200 ul com a ponta cortada. Observe o esferóide com um microscópio de fluorescência 1 dia após NIR-PIT usando ficonfigurações PELD descrito no passo 3.3.
   1. Detecção de células mortas através da adição de iodeto de propídio para os meios de comunicação a uma concentração final de 2 ug / mL, ou pela perda de fluorescência citoplasmática GFP-usando um microscópio de fluorescência (Figura 2B) ^14,18,22.
7. Repita os passos de 3,1-3,6 se as células-alvo não são completamente eliminados.

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Resultados

Para monitorizar o efeito opticamente de NIR-PIT, a linha celular A431, que sobre-expressa EGFR, foi geneticamente modificado para expressar GFP e também de luciferase (Luc-A431-GFP). Como um não-alvo de NIR-PIT, a linha de células Balb / 3T3 foi opticamente modificada para expressar RFP (3T3-RFP). A APC, panitumumab-IR700 (pan-IR700), foi sintetizado. Esferóides mistas, compostas de várias proporções de células (A431-Luc-GFP e 3T3-RFP) foram fabricados de acordo com este protoco...

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Discussão

Nós demonstramos um método de eliminação de células específicas a partir de uma cultura de células mista 3D sem danos para as células não alvo usando NIR-poço. Até agora, não existe nenhum método prático de eliminação da célula uma vez que o tecido é estabelecida ou após o transplante. Assim, NIR-PIT é um método promissor para alcançar este objetivo. Esta técnica também pode ser utilizada in vivo, ^18,22, desde APCs mostram farmacocinéticos semelhantes aos do próprio...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
IRDye 700DX Ester Infrared Dye	LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)	929-70011
Na2HPO4	SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)	S9763
Sephadex G25 column (PD-10)	GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)	17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay	Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)	PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates	3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA)	HDP1096-8
Optical power meter	Thorlabs (Newton, NJ, USA)	PM100
LED: L690-66-60	Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA)	L690-66-60
Vectibix (panitumumab)	Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm	Cellvis (Mountain View, CA, USA)	D35-10-0-N