Um método rápido e eficiente para a purificação de células da endoderme Gerado de células estaminais embrionárias humanas

Resumo

Aqui, descrevemos um método para a purificação de células-tronco embrionárias humanas diferenciadas que estão comprometidos para a endoderme definitiva para a melhoria das aplicações a jusante e outras diferenciações.

Resumo

As capacidades de diferenciação de células estaminais pluripotentes, tais como células estaminais embrionárias (CES) permitem uma aplicação terapêutica potencial para terapias de substituição de células. Terminalmente tipos de células diferenciadas pode ser utilizado para o tratamento de várias doenças degenerativas. Diferenciação in vitro destas células no sentido de tecidos do pulmão, fígado e pâncreas requer como um primeiro passo na geração de células da endoderme definitivas. Este passo é para a posterior diferenciação em direcção tipos de células terminalmente maturados tais como células beta produtoras de insulina, hepatócitos, ou outros tipos de células derivadas de endoderme limitante da velocidade. As células que são comprometidas com a linhagem endoderme altamente expressar uma grande variedade de factores de transcrição, tais como Foxa2, Sox17, HNF1B, membros da família GATA, e o receptor da superfície CXCR4. No entanto, os protocolos de diferenciação são raramente de 100% eficiente. Aqui, nós descrevemos um método para a purificação de uma população de células CXCR4 + após a diferenciaçãona DE usando microesferas magnéticas. Esta purificação remove adicionalmente células de linhagens indesejados. O método de purificação suave é rápido e fiável e pode ser usado para melhorar as aplicações a jusante e diferenciações.

Introdução

As células estaminais pluripotentes, tais como células estaminais embrionárias (CES) têm a capacidade de se diferenciar em virtualmente qualquer tipo de células do corpo humano. Assim, os protocolos in vitro de diferenciação podem ser usadas para gerar numerosos tipos de células, tais como adultos cardiomiócitos ^{1, 2} hepatócitos, células beta ^{3, 4} ou epitelial de pulmão de células neuronais ^5. Isso faz com que os CES uma ferramenta valiosa para o tratamento potencial de várias doenças degenerativas ^3.

A diferenciação in vitro dos CES no sentido de tecidos adultos do pulmão, fígado e pâncreas requer um pseudo-gastrulação em células reminiscentes da endoderme definitivo (DE) ^6. Uma vez que a diferenciação em direcção a jusante dos tipos de células somáticas atrás referidos é significativamente menos eficiente, uma endoderme diferenciação óptima é considerada como a taxa de limitação ^7. As células que estão comprometidos para com a linhagem endoderme submeter chamudanças racteristic em seu perfil de expressão gênica. Genes reguladores mestre pluripotência são regulados negativamente, enquanto que a expressão de outros factores de transcrição tais como Foxa2, Sox17, HNF1B, membros da família GATA e o receptor da superfície CXCR4 é altamente regulada positivamente ^{6, 8, 9.} CXCR4 é conhecido por ser transactivado por Smad2 / 3, a jusante de sinalização Nodal / TGF-β e Sox17 devido a locais de ligação específicos na sua região promotora ^10. Assim, é um marcador muito adequado utilizado num certo número de relatórios de ^{6, 8, 11-13.} Estas mudanças de expressão reflete um evento pseudo-gastrulação, em que os CES primeiro adquirir características de uma população de células streak-like primitivo e posteriormente comprometer na camada germinativa endoderme ^6.

No entanto, os protocolos de diferenciação são raramente de 100% eficiente como algumas células podem resistir ao processo de diferenciação ou diferenciar em relação a outras linhagens não intencionais ^14. Estas células podem Influe negativamentemaior diferenciação nce. Além disso, as células indiferenciadas residuais abrigar grandes riscos para experiências de transplante mais tarde e pode dar origem a teratomas ^15-17.

Para remover estas células indesejadas cedo-CXCR4 na superfície marcador pode ser utilizado para a purificação de células que estão comprometidos para a DE ^18. Aqui, nós descrevemos um método para a selecção positiva de células CXCR4 + a partir de culturas de diferenciação de ED. Para isso, o CXCR4 marcador de superfície está ligada por um anticorpo o qual, em seguida, por sua vez, liga-se a microesferas magnéticas. Ao contrário das condições adversas durante a separação por FACS, as células como DE-magneticamente marcadas podem então ser facilmente purificadas em um formato de bancada utilizando um método de purificação suave. Este protocolo proporciona um método simples para a remoção das populações de células que resistiram ao processo de diferenciação DE.

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Protocolo

1. Diferenciação de ESC Humano para o Endoderma Definitive

1. Cultivar as células estaminais embrionárias humanas (CES) em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2.
2. Revestimento um novo 6 poços da placa de cultura de células com 1 ml de uma matriz de membrana basal e incubar a cultura-louças durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente. Para obter detalhes específicos por favor, ligue com as instruções dos respectivos fabricantes.
3. Confirmar que os CES humanas cultivadas atingiram 80% -90% de confluência ao microscópio utilizando uma ampliação baixa (por exemplo, 4X). Aspirar o meio das cavidades por sucção fora o meio com uma pipeta de Pasteur de vidro estéril. Lavar as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Por isso, adicionar 2 ml de PBS a cada poço suavemente agitar a placa e chupam a solução para remover as células mortas e detritos celulares.
4. Adicionar 1 ml de reagente solução passaging livre de enzima para a dissociação suave de grupos de células. Incubar as células a 37 ° C, umd 5% de CO ₂ até que as células apresentam sinais claros de perturbações de agregados de pequenas.
   NOTA: O tempo de incubação depende do reagente utilizado. Para a solução Passaging isento de enzimas mencionados na secção de materiais, o tempo de incubação é de cerca de 7 minutos.
5. Adicionar 1 ml de DMEM meio F-12 / e perturbar os agregados de células remanescentes em células individuais pipetando para cima e para baixo usando uma pipeta de 1 ml de ponta. Utilizar esta para lavar as células a partir da superfície e transferência das células para um tubo de centrifugação. Para obter todas as células, lavagem de cada poço com 1 ml de meio DMEM / F-12 e adicionar o meio ao tubo de centrifugação.
6. Centrifugar as células durante 5 min a 300 x g. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de meio de cultura de células ES contendo 10 uM de inibidor a Rho-cinase (ROCHA).
7. Contar as células ao microscópio usando um hemocitómetro e sementes 150.000 - 400.000 células por 6 poços ou em outra disposição de placa, dependendo da linha de células ES utilizadas. Use culture meio contendo inibidor ROCHA 10 uM para evitar apoptose e cultivar as células em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2.
8. Aproximadamente 24 horas após a sementeira Aspirar o meio com uma pipeta de Pasteur de vidro estéril e adicionar 2 ml de meio de indução linha primitiva.
   NOTA: Este meio contém concentrações finais de 1% de glutamina, 0,2% de FCS, 5 uM e CHIR-99021 50 ng / ml de activina A em meio RPMI-1640 avançada. Geralmente, utilizar 2 ml de meio de cultura em placas de 6 poços.
9. 48 horas após a semeadura, substitua a médio e endoderme meio de indução. Cultivar as células neste meio durante mais 48 horas com troca de meio por dia.
   NOTA: Este meio contém 1% de glutamina, 0,2% de FCS e 50 ng / ml de activina A em meio RPMI-1640 avançada. As células que estão comprometidos para a endoderme definitiva expressam o marcador de superfície CXCR4. A coloração de CXCR4 pode ser utilizado para quantificar o número de células anuladas.

2. Coloração de CXCR4 + endoderme definitivo Células para Análise de Citometria de Fluxo

1. Para o final de 24 horas, mas, pelo menos, 1 hora antes da colheita das células adicionar inibidor ROCHA 10 uM para o meio de cultura.
2. Revestir a cultura de células-louças que vai ser utilizado para re-sementeira com uma matriz de membrana basal, ou seja, placas de 12 poços para análise ou câmara de lâminas qPCR para coloração por imunofluorescência. Incubar as placas ou lâminas durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente.
3. Aspirar o meio com uma pipeta de Pasteur de vidro estéril a partir dos poços das células diferenciadas utilizados para a coloração e / ou classificação.
4. Adicionar 1 ml de reagente solução passaging livre de enzima para a dissociação suave de grupos de células. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO ₂ até que as células apresentam sinais claros de ruptura em pequenos aglomerados.
   NOTA: O tempo de incubação depende do reagente utilizado. Para a solução Passaging livre de enzima mencionada no materiseção de als, o tempo de incubação é de cerca de 7 min.
5. Adicione 1 ml meio DMEM / F-12 e perturbar restantes agregados de células em células individuais pipetando cima e para baixo usando uma ponta de 1 ml. Utilizar esta para lavar as células a partir da superfície e transferência das células para um tubo de centrifugação. Para obter todas as células, lavar cada cavidade com 1 mL de meio DMEM / F-12 w / o FCS e adicionar o meio ao tubo de centrifugação.
6. Contar as células ao microscópio utilizando um hemocitômetro. As células a partir de três cavidades de uma placa de 6 poços deve resultar em 10-15 x 10 ⁶ células após três dias de diferenciação. Centrifugar as células durante 5 min a 300 x g.
   NOTA: O número exato de células obtidas dependerá da linha de células pluripotentes utilizado para a diferenciação.
7. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em tampão de PEB contendo 10 uM de inibidor ROCHA. Utilizar 100 ul desta tampão durante até 10 ⁷ células. Adicionar o inibidor ROCHA 10 pM no dia da staining. Utilize este tampão para todas as aplicações a jusante (referido como tampão PEB + RI).
   NOTA: PEB tampão contém 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM em PBS. Se mais células são para ser corado, ajustar o volume de tampão em conformidade.
8. Adicionar 10 uL de um anticorpo CXCR4-APC por 10 ⁷ células em 100 ul, isto representa aproximadamente uma diluição de 1:10.
   Nota: O uso de um anticorpo de APC-ligado não é obrigatória. Em vez disso, pode ser substituído de acordo com as micropérolas usadas. Se mais células são para ser coradas ajustar o volume de anticorpo em conformidade.
9. Misturar suavemente invertendo o tubo com os dedos e incubar a 4 ° C num frigorífico durante 15 min. Ressuspender as células com 1-2 ml de tampão de PEB. Centrifugar as células durante 5 min a 300 x g.
10. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta Pasteur de vidro estéril e ressuspender o sedimento celular em 80 ul de PEB por 10 ⁷ células e adicionar 20 ul microesferas anti-APC.
    NOTA: Se mais células estão a ser manchado, ajustar o volume micro-esferas em conformidade.
11. Misturar suavemente invertendo o tubo com os dedos e incubar a 4 ° C num frigorífico durante 15 min. Volte a suspender as células com 1-2 ml de tampão PEB + RI. Centrifugar as células durante 5 min a 300 x g. Aspirar o tampão. Ressuspender em 500 ul de tampão PEB + RI.

3. Separação Magnética de CXCR4 + Células

1. Coloque uma coluna magnética tamanho médio em um campo magnético, conforme as instruções de fabricação. Pré-lavar a coluna com tampão de 500 ul PEB + RI. Aplicar a suspensão de célula inteira para a coluna. Recolhe-se o fluxo através de células uma vez que nem todos se ligam à coluna. Certifique-se para não perturbar as colunas para a recuperação ideal de células CXCR4 +.
2. Lava-se a coluna três vezes com tampão de PEB 500 ul + RI. Recolher o primeiro fluxo através de e combiná-lo com as células coletadas de Passo 3.1. Retirar a coluna magnético do campo magnético e coloca-se numatubo de recolha adequado. Adicionar 1 ml de tampão de PEB + RI na coluna. Para eluir as células firmemente pressionar para baixo o êmbolo para dentro da coluna.
3. Opcional: Recolha todo o fluxo através de amostras separadamente e usar 20 l cada, para analisar o número de células CXCR4 + utilizando citometria de fluxo. Seu número deve diminuir com cada etapa de lavagem.
   NOTA: Pelo menos 2 x 10 ⁴ viável, células fechadas deve ser contado para resultados confiáveis.
4. Repita os passos 3,1-3,3 com o fluxo coletados por meio de amostra do Passo 3.1 e o primeiro fluxo através da amostra a partir do passo 3.2 utilizando uma nova coluna. Não re-utilizar a coluna anterior. Ao utilizar o ar êmbolo é pressionado para a coluna, o que bloqueia.
5. Contar as células ao microscópio utilizando um hemocitômetro. Dependendo da eficiência da diferenciação até 6 x 10 ⁶ células podem ser classificados inicialmente e mais 1 x 10 ⁶ células, utilizando uma segunda coluna ao utilizar 10 ⁷ células para o procedimento.
6. Centrifugar as células a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e com uma pipeta de Pasteur de vidro estéril e ressuspender as células em 1 ml de meio de indução endoderme do Passo 1.9, com inibidor adicional ROCHA 10 uM.
7. Contar as células ao microscópio utilizando um hemocitômetro. Semear as células a uma densidade adequada, isto é, ~ 4 x 10 ⁵ células por poço de uma placa de 12 poços (app. 3,6 ^cm2 de superfície) ou ~ 1,5 x 10 ⁵ células por poço de um de 8 poços câmara de corrediça.

4. Opcional: Análise de Purificada População Endoderma Definitive

1. Para coloração por imunofluorescência fixar as células purificada do passo 3.7 aproximadamente 24 horas após a sementeira com paraformaldeído a 4% e de manchas de endoderme definitivo (DE) e / ou proteínas marcadoras pluripotência.
   NOTA: normalmente usado DE marcadores incluem Foxa2 e Sox17, marcadores de pluripotência comumente usados ​​incluem OCT3 / 4, NANOG e SOX2 ^{6, 8.}
2. foR análise de RT-qPCR, a colheita das células purificadas directamente ou 24 horas após a sementeira, extrato total de ARN e a transcrição reversa de ADNc a partir das amostras de ARN total de-extraídos. Use 10 cDNA ng como modelo por reacção RT-qPCR (triplicado) para analisar a expressão de DE e genes pluripotência marcador ^{6, 8.}
   NOTA: genes marcadores comumente usados ​​são mencionados no Passo 4.1. As condições de ciclo são 5 min a 95 ° C e 40 ciclos de 15 seg a 95 ° C e 1 min a 60 ° C, seguido de análise da curva de fusão.

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Resultados

Após a diferenciação CES sofrer alterações drásticas no gene e a expressão da proteína. A Figura 1 representa genes marcadores típicos que podem ser utilizados para verificar uma diferenciação endoderme bem sucedida. Alvos principais para a análise de expressão gênica são GSC, Foxa2 e Sox17. Em uma análise de expressão gênica relativa especialmente Foxa2 e Sox17 são aumentados em> 2.000...

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Discussão

protocolos de diferenciação utilizados actualmente raramente resultam em células diferenciadas 100%. Por razões que ainda têm de ser abordadas algumas células resistir ao processo de diferenciação. Dependendo da eficiência do protocolo utilizado diferenciação e a propensão do CES alinhar um certo número de células pluripotentes residuais são vulgarmente observadas mesmo após a diferenciação em endoderme definitiva. Estas células residuais pode prejudicar diferenciações a jusante ou uma análise mais...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hues8 human embryonic stem cell line	Harvard Department of stem cell & regenerative biology		Suitable cell line for endoderm generation
Hes3 human embryonic stem cell line	ES Cell International		Suitable and robust cell line for endoderm generation
mTeSR1	Stemcell Technologies	5850	ESC culture medium
FCS	Biowest	S1860
Advanced RPMI 1640	Life Technologies	12633012
CD184 (CXCR4)-APC, human	Miltenyi Biotec	130-098-357
anti-APC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-109	magnetic field
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	ROCK inhibitor
CHIR-99021	Tocris Bioscience	4423
Activin A	Peprotech	120-14
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stemcell Technologies	7174	Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA
Matrigel*	Corning	354277	basement membrane matrix * solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12. Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature. Remove the matrigel and use immediately.
MS Columns	Miltenyi Biotec	30-042-201
MACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga	Life Technologies	NA
Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta	Life Technologies
Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt	Life Technologies
Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg	Life Technologies
SOX17 TaqMan assay	Applied Biosystems	Hs00751752_s1
Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg	Life Technologies
Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag	Life Technologies
Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg	Life Technologies
Human POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca	Life Technologies
Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc	Life Technologies
Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct	Life Technologies
Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc	Life Technologies
Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g	Life Technologies
Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c	Life Technologies
Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g	Life Technologies
Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a	Life Technologies
Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t	Life Technologies
Anti-SOX2	Santa Cruz Biotechnology	sc-17320
Anti-FOXA2	MerckMillipore	07-633
Anti-SOX17	R&D Systems	AF1924