Avaliação transcutânea da função renal em roedores conscientes

Resumo

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

Resumo

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

Introdução

taxa de filtração glomerular (TFG) é o melhor parâmetro para avaliar a função renal global. O padrão de ouro para determinar a GFR se baseia na depuração do plasma ou urina dos marcadores renais exógenos, tais como inulina ^1. No entanto, estes procedimentos são demorados e complicados, exigindo a recolha de sangue em série e / ou amostras de urina e posteriores ensaios laboratoriais para a sua análise. Além disso, estes métodos são invasivos e stressante para os animais, o que limita o número de vezes e de frequência em que as medições podem ser utilizadas. Um número de abordagens alternativas têm sido desenvolvidas para simplificar os procedimentos clássicos para determinar GFR, mas eles ainda dependem de urina e plasma de amostragem ^2-4 e / ou requerem anestesia profunda ^5,6, que é conhecido por influenciar a hemodinâmica e função renais ^{7, 8.} Produtos finais do metabolismo, tais como creatinina, também são amplamente utilizados para estimar a função renal. No entanto, sabe-se que o accurACY destes marcadores endógenos não é óptima e, por outro lado, a analisá-los, a urina ou a amostragem de sangue, também é indispensável.

Aqui nós descrevemos uma metodologia transcutânea para avaliar a função renal em animais conscientes. Este método é mais simples e mais rápido do que os métodos tradicionais, bem como apenas minimamente invasiva. Com esta técnica, usando um dispositivo óptico miniaturizado e o -sinistrin exógeno renal marcador de isotiocianato de fluoresceína (FITC), é possível determinar a função renal quase em tempo real sem a necessidade de plasma ou amostras de urina e sem cateterização cirúrgico para a administração da substância. Devido a estas características, o método é adequado para realizar medições sequenciais no mesmo animal.

FITC-sinistrin é um marcador renal filtrado livremente pelos glomérulos, sem reabsorção tubular ou secreção. A parte óptica do dispositivo miniaturizado consiste em dois diodos emissores de luz (LEDs), que excitamo marcador administrado e um fotodíodo para detectar a fluorescência emitida através da pele. Os dados gravados são armazenados na memória interna integrada no dispositivo e que pode ser usado para gerar a curva cinética de eliminação de FITC-sinistrin. A energia é fornecida por uma pequena bateria de lítio recarregável. Para obter informações mais detalhadas sobre o dispositivo e seus componentes individuais referem-se a Schreiber et al. ^9. O dispositivo é facilmente montado sobre o corpo do animal utilizando um emplastro de dupla face adesiva levando uma janela transparente para os componentes ópticos. Os resultados estão disponíveis após o período de gravação é longo.

Com o método e o protocolo fornecido aqui, introduzimos uma tecnologia promissora, que pode substituir o padrão de ouro para determinar TFG actual, não só na pesquisa mas também no campo clínico.

Protocolo

experimentos necessários para desenvolver o protocolo foram realizados de acordo com os regulamentos nacionais e foram aprovados pelo comitê de ciência ética local (Regierungspräsidium Karlsruhe).

1. Preparação da solução de injecção de FITC-sinistrin

1. Dissolve-FITC sinistrin em solução salina fisiológica para preparar uma solução de reserva. A dose recomendada em murganhos é de 7,5 mg / 100 g de peso corporal (BW), enquanto que em ratos 5 mg / 100 g BW-FITC sinistrin é preferível. Para ratinhos, preparar uma solução de uma solução de estoque de FITC-sinistrin a 15 mg / ml, enquanto que para os ratos preparar a uma concentração de 40 mg / ml.
   Nota: solução de FITC-sinistrin pode ser preparado antecipadamente e guardado a -20 ° C ao abrigo da luz.

2. Preparação de animais

1. Aclimatar os animais durante pelo menos uma semana antes da sua introdução em qualquer experiência.
2. Anestesiar o animal utilizando 5% de isoflurano em 5 L / min _{de O2} Fluir por 2 min.
3. Confirmar que o animal está devidamente anestesiados por observar a sua respiração, o que torna-se mais lenta e profunda, e verificar a ausência de resposta com a falta de uma resposta dedo do pé.
4. Uma vez que o animal está adormecido, reduzir a anestesia para 2,5% de isoflurano em O taxa de entrega de 2 L / min ₂ e tomar o BW.
5. Remover a pele do flanco da parte de trás do animal utilizando uma máquina de barbear eléctrica. Raspar uma área ligeiramente maior do que a área que irá ser ocupada pelo pedaço de material adesivo de dupla face, que tem dimensões de 3 cm x 6 cm.
6. Posteriormente aplica o creme de depilação por um curto período (2-3 min) para remover a pele restante.
7. Lave bem a área até que o creme foi completamente removido, como o próprio creme pode ser fluorescente.
   Nota: Evite coçar a pele do animal, pois ele pode produzir irritação / edema. Se a área depilada mostra pigmentação na pele, raspar uma área maior, até um ponto não pigmentado para oparte óptica do aparelho é encontrado. Recomenda-se fazer a barba 24 horas de antecedência para minimizar a exposição a anestesia.

3. Dispositivo de preparação

1. Colocar o dispositivo óptico para medir a função renal em um lado do pedaço de material adesivo de dupla face, o posicionamento da parte óptica acima da janela transparente (Figura 1), deixando a parte oposta com a película de protecção.
   Nota: Quando se trabalha com pequenos roedores, reduzir o tamanho do penso, como mostrado na Figura 2.
2. Anexar um pedaço de emplastro adesivo de dupla face de tamanho correspondente para a bateria, como mostrado na Figura 3.

4. Fixação do dispositivo no animal

1. Calcular o volume adequado de injecção com base no peso corporal do animal.
2. Anestesiar os animais com isoflurano como anteriormente indicado em secções 2.1-2.3.
3. Corte um pedaço de gaze tubular elástica atadura of cerca de 1 cm mais longo do que a largura do pedaço de material adesivo de dupla face para ser utilizado.
4. Puxe a atadura de gaze elástica sobre a cabeça do animal e do lugar em suas costas, deixando a área raspada descoberto.
   Nota: Como alternativa, fixar o dispositivo usando apenas fita adesiva, mas esteja ciente de pressão indevida sobre o dispositivo.
5. Ligar a bateria para o dispositivo, ligando o conector da bateria para a porta correspondente no dispositivo. Depois disso remover a folha de protecção da parte de remendo e montagem da bateria sobre a superfície superior do dispositivo (Figura 4A). Certifique-se de que a bateria está devidamente ligado ao verificar que o dispositivo começa a piscar.
   Nota: Em ratos, a bateria pode ser também ligado directamente sobre o pedaço de material adesivo, ao lado do dispositivo (Figura 4B).
6. Remover a tampa de protecção a partir do emplastro com o dispositivo de operação e colocá-lo na área rapada no dorso do animal, segurando-s bordas até que seja correctamente fixa.
7. Cobrir o dispositivo com a atadura de gaze tubular elástica aderindo-o à superfície adesiva do penso (Figura 5).
8. Corretamente esticar a atadura tubular no abdômen do animal, garantindo que os membros podem circular livremente.
9. Para uma melhor fixação e a protecção do dispositivo, aplicar uma tira de fita adesiva da seguinte forma do dispositivo e que cobrem os fios da bateria.
10. Meça fundo para 1 a 3 min, sem colocar pressão sobre o dispositivo

Administração 5. FITC-sinistrin e Procedimentos de Medição

1. Se necessário, aquecer-se a cauda do animal, por meio de água quente antes de injecção ou uma placa de aquecimento com controlo de temperatura ao longo de todo o procedimento.
2. Injectar através da veia da cauda do volume apropriado de solução de FITC-sinistrin. O volume de injecção depende BW animais e, por conseguinte, deve ser calculado para cada contras individuaisidering a dose desejada e concentração da solução de reserva, acima mencionado na secção 1.1.
3. Assegure-se que toda a solução de FITC-sinistrin é administrado por via intravenosa e não por via subcutânea.
   Nota: Em alternativa, FITC-sinistrin pode ser administrada através de um cateter intravenosa pré-implantados saiu na nuca do pescoço em roedores ou por injecção retro-orbital em murganhos.
4. Cuidadosamente, devolver o animal para sua gaiola evitando movimentos fortes e qualquer pressão sobre o dispositivo, uma vez que iria introduzir artefatos de movimento.
5. Coloque a gaiola em um lugar calmo para evitar que o animal é perturbado.
6. Realizar a medição durante pelo menos 1 hr se trabalhar com camundongos e 2 horas quando se utiliza ratos. Durante esse período, o dispositivo óptico irá medir através da pele a fluorescência emitida por FITC-sinistrin.
   Nota: Durante o período de gravação do animal deve ser hospedado sozinho. Além disso, o abastecimento de água, bem como salienteestruturas como as tampas de arame, deve ser removido para evitar danos do aparelho e do movimento artefatos eletrônicos devido aos impactos com objetos.

Remoção 6. Dispositivo

1. Uma vez que o período de gravação é longo, remover o dispositivo sem anestesia; No entanto, se necessário, anestesiar o animal brevemente sob 5% de isoflurano em taxa de libertação de 5 L / min _{de O2} durante 2 min.
2. Cuidadosamente, retirar a fita adesiva em primeiro lugar, em seguida, a bandagem tubular.
3. Gentilmente desprender o adesivo dupla face adesiva da pele e devolver o animal à sua gaiola normal.

7. Leia fora de Dados

1. Desligue a bateria do aparelho e remover o adesivo.
   Nota: Os dados são armazenados no dispositivo até que um novo começa a medição. Quando a bateria está ligada aos dados armazenados são substituídos com as novas gravações. Portanto, não volte a ligar a bateria antes de baixar os dados dodispositivo. Há um período de carência de 10 seg destinado a reconexão acidental da bateria.
2. Conecte o dispositivo a um PC usando um cabo USB micro e baixar os dados usando o software fornecido. O arquivo de saída é um arquivo .csv que pode ser aberto e modificado com um programa de planilha.
3. Abra o ficheiro de dados com o software específico para o dispositivo óptico e gerar a curva cinética de eliminação, utilizando os protocolos de software.
4. Analisar a curva, seguindo as instruções fornecidas com o dispositivo óptico. Logo, para a avaliação dos dados, definir o sinal de fundo medido administração FITC-sinistrin antes e marca o início da fase de excreção exponencial do marcador, o que geralmente ocorre 15 min e 45 min após a injecção de bólus, em ratinhos e ratos, respectivamente, .
   Nota: O software irá exibir automaticamente a meia-vida de FITC-sinistrin (t _1/2), juntamente com um valor de R ^2, determinada por um 1-Comparmodelo tamento. t _1/2 pode ser utilizado para calcular a taxa de filtração glomerular, utilizando um factor de conversão ^9,10.

Resultados

A configuração da medição transcutânea é muito simples e rápida: o dispositivo é colocado sobre o pedaço de material adesivo de dupla face (Figura 1) e ajustada em tamanho, se necessário (figura 2), a bateria é preparado (Figura 3) e ligado (Figura 4).

Este método para avaliar a função renal já foi validado em diferentes espécies, em comparação com a abordagem tradicional da depuração plasmática ^9,11,12. Seguindo o protocolo exposto aqui, Schreiber et ai. demonstraram a validade da técnica em diferentes modelos de ratos, que mostra resultados altamente comparável entre a medição e o plasma passe transcutânea para todos os grupos estudados (Tabela 1) ^9. Neste trabalho a obtida t _1/2 foi convertido para GFR usando um mouse de conversão semi-empírica específicafator.

A consistência da avaliação transcutânea da função renal também é provada usando diferentes cepas de camundongos. Medidas sequenciais dentro de 3 dias no mesmo animal, mostrou um coeficiente de variâncias de 3,0-6,2% ^13. Neste estudo, não houve conversão ao TFG, mas os resultados foram expressos e interpretados diretamente em termos de t _1/2.

A possibilidade de ter os resultados quase em tempo real é uma das grandes vantagens deste método. Após o período de gravação, os resultados estão imediatamente disponíveis para a análise e o software fornecido mostra a curva de excreção de FITC-sinistrin instantaneamente (Figura 6). Dentro do mesmo software a t _1/2 de FITC-sinistrin pode ser obtido, o qual pode ser utilizado directamente como o parâmetro para avaliar a função renal do convertida em termos de taxa de filtração glomerular. Figura 7 mostra como ele olha a curva de excreção FITC-sinistrin medida transcutânea em um animal com insuficiência renal. Quando a função renal é afetada, FITC-sinistrin t _1/2 aumenta devido à excreção reduzida da substância e a aparência da curva muda. Normalmente, a curva medida não voltar para o nível de fundo e apresenta uma área aumentada sob a curva. No mesmo animal, as medições de pré para pós-lesão pode experimentar um aumento na intensidade de fluorescência máxima devido à acumulação do marcador causada por sua excreção reduzida. Na presença de insuficiência renal, a curva medida por via transcutea de FITC-sinistrin pode mostrar um estado estacionário, devido à função severamente prejudicada (Figura 7B).

A utilização do dispositivo miniaturizado em diversas estirpes de roedores com diferente estado de saúde tem mostrado que esta técnica é adequada e suficientemente sensível para detectar alterações due a doença renal e ao envelhecimento. A Tabela 2 mostra um resumo dos modelos murinos estudados até à data com este método.

Figura 1. A colocação do dispositivo sobre o pedaço de material adesivo de dupla face. O dispositivo é montado sobre o pedaço de material adesivo de posicionamento sua parte óptico na janela transparente.

Figura 2. Adaptação do pedaço de material adesivo de pequeno porte roedores. Para uso em pequenos animais, recomenda-se reduzir o tamanho do emplastro. A: usar o dispositivo como um guia para cortar o emplastro adequadamente. B: Uma vez que o tamanho desejado tenha sido obtido, o dispositivo pode ser colocado sobre a superfície adesiva do sistema. Plocação clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Preparação da bateria. Para fixar a bateria ao dispositivo, cortar um pequeno pedaço de adesivo dupla face adesiva (A e B) e coloque-o sobre a superfície da bateria (C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Ligação e colocação da bateria durante a medição. (A) em pequenas roedores tais como ratinhos, devido ao espaço reduzido, a bateria deve ser colocado na parte superior do dispositivo. (B) Em animais maiores a bateria cum ser colocado ao lado do dispositivo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Colocação da atadura de gaze elástica tubular em um rato. A bandagem tubular deve cobrir o adesivo dupla face adesiva, sem interferir com a livre circulação dos membros para o conforto do animal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.

Figura 6. imagem representativo de uma curva de eliminação do FITC-sinistrin. O sinal gerado por FITC-sinistrin é detectado transcuneamente e armazenados na memória interna do dispositivo. Quando os dados registados são descarregados para um PC, o software gera uma curva comparável ao apresentado na imagem. Eixo Y mostra a intensidade de fluorescência registrados [AU], emitida pelo marcador FITC-sinistrin injetado, enquanto eixo X representa a duração da medição em tempo [min]. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. imagem representativo de uma curva de eliminação do FITC-sinistrin em animais com insuficiência renal. (A) curva de eliminação de FITC-sinistrin em animais com uma função renal reduzida tipicamente mostra um aumento da área sob a curva e a incapacidade para atingir a linha de base dentro do período normal de medição . (B) Em animais gravemente prejudicada a curva transcutânea medida pode mostrar um estado estacionário que indica insuficiência renal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1. Validação da medida transcutânea, comparando com a depuração plasmática tradicional. A medida transcutânea da função renal foi validado em diferentes modelos de ratos (saudável e unilateralmente nefrectomia (UNX C57BL) / 6-129 SV ratos e mouse modelo de nefronofitíase ( PCY)) em comparação com a depuração de plasma. Os valores são médias ± DP. TFG, taxa de filtração glomerular ^9.

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Tabela 2. modelos murinos estudada usando a medição transcutânea UNX, unilateralmente nefrectomia.; ECA, enzima conversora da angiotensina; T ^{gumodwt / wt,} transgénico uromodulin nocaute, SD, Sprague Dawley; PKD, doença renal policística.

Discussão

O presente artigo descreve o procedimento para determinar a função renal em roedores conscientes utilizando um dispositivo miniaturizado ea exógena marcador renal FITC-sinistrin. Como afirmado anteriormente, este método tem várias vantagens em comparação com os processos tradicionais de depuração na urina e no plasma. Um deles é a independência em relação a amostragem de sangue e urina, que conduz a uma grande economia em termos de consumo, o tempo e, evidentemente, o stress dos animais.

Como mostrado na Tabela 2, o marcador exógeno renal FITC-sinistrin e a medição da sua cinética de eliminação através da pele permitir que o impacto de patologias renais sobre a função renal a ser estudado ^9,10,14-18. A recolha de amostras de sangue em série dos necessários para avaliar a depuração plasmática ou biomarcadores de doença renal são stressante para o animal, pesado e para os investigadores demorado. Portanto, as medidas sequenciais dentro do mesmo animal ter sido limbida pelo bem-estar dos animais e razões metodológicas. A reprodutibilidade intra-provou animais da medição transcutânea ¹³ faz com que seja um método ideal para a detecção de alterações na função renal devido à progressão da doença ou envelhecimento. Pela mesma razão, também pode ser extremamente útil para estudar a eficácia de abordagens terapêuticas.

Dois passos críticos para uma aplicação bem sucedida desta tecnologia são a fixação do dispositivo óptico no animal e a correta administração do marcador. O dispositivo deve ser fixado de forma adequada para evitar artefatos de movimento. Para esse efeito, impedindo a ligação e separação do pedaço de material adesivo de dupla face é crucial, pois pode levar à perda das suas propriedades adesivas e, finalmente, uma fixação inadequada no animal. Como mencionado no protocolo, a imobilização e proteção do dispositivo óptico, cobrindo-o com fita adesiva é uma abordagem eficaz para garantir uma adequate fixação. Ao realizar a injecção bolus FITC-sinistrin é crucial para administrar toda a substância por via intravenosa e não por via subcutânea. A liberação do marcador no tecido subcutâneo pode ser facilmente identificado por um anel amarelo circulando a cauda do animal produzido pela própria cor do FITC-sinistrin. A injecção subcutânea normalmente se manifesta como uma curva mais plana e hora marcador excreção prolongada. A possível limitação deste método está mais relacionado com o marcador usado do que com a tecnologia por si só. Quando um edema está presente na pele de um animal, a avaliação da função renal transcutânea não seria recomendada, como existe um compartimento adicional que pode alterar a dinâmica de excreção de FITC-sinistrin. Da mesma forma, a pele pigmentada pode limitar o uso da técnica, devido à sobreposição de excitação e de emissão de espectros de FITC-sinistrin e melanina. No entanto, em animais com pigmentação da pele em manchas, o problema é resolvido através da colocação da ópticaparte do dispositivo em uma área não pigmentado.

É possível modificar os diferentes aspectos da avaliação transcutânea da função renal, a fim de adaptar o procedimento a espécie e / ou abordagens diferentes animais. Por exemplo, a dosagem recomendada de FITC-sinistrin ou o comprimento da medição pode ser ajustado dependendo do objectivo do ensaio, bem como para diferentes espécies ou modelos animais. Esta adaptação do método já foi confirmado pela sua aplicação com sucesso em diferentes espécies de roedores e vários tipos de estirpes com problemas de saúde variados. Além disso, a avaliação transcutânea da função renal foi recentemente validado em cães e gatos ^12, com excelentes resultados. Devido às diferenças entre estes animais indubitáveis ​​e roedores, este estudo determinou-se a dose apropriada do FITC-sinistrin para ambos, cães e gatos, e é realizada uma medição de tempo muito mais longo, em vez de 4 horas ou 1 ou 2 horas de usod em roedores.

Tomados em conjunto, a utilização desta técnica pode ajudar a obter insights mais precisos em nefrologia, incluindo uma melhor compreensão da progressão da doença renal e o efeito de terapias. As características da avaliação da função renal transcutânea coloca-lo como uma técnica adequada para ser aplicada em campos clínicos humanos e veterinários no futuro, e deve ser considerado como uma tecnologia promissora para substituir as abordagens tradicionais.

Materiais

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NIC-Kidney device	Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH		Software, batteries and chargers are provided together with the device/s. Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com
FITC-sinistrin	Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH		Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com
Double-sided adhesive patch	Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH		Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com
Isis Rodent electric shaver	Braun Aesculap	GT420
Isoflurane	Abbott GmbH	PZN4831850
Leukosilk adhesive tape	BSN medical	102200
Tubular elastic gauze bandage	MaiMed Medical GmbH	73012	There are different sizes available. Size 1 is recommended for mice.
Veet depilation cream	Reckitt Benckiser	PZN7768307	Sensitive skin formulation is recommended as is more gentle with the skin of the animals
Micro USB cable	Samsung	APCBU10BBE
Deltajonin Physiologic solution	AlleMan Pharma GmbH	3366954	Alternatively, it can be used saline or PBS