Um método melhorado para rápida de intubação da traqueia em Ratos

Resumo

Este artigo apresenta um método rápido e simples para a administração de bleomicina diretamente na traquéia do mouse através de intubação. As principais vantagens deste método é que ele é altamente reprodutível, fácil de dominar, e não requer equipamento especializado ou tempos de recuperação longos.

Resumo

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

Introdução

Apesar de algumas diferenças anatômicas e fisiológicas, ^{1 modelos} murino continuam a ser de valor inestimável para a modelagem de biologia humana e patogênese da doença. ² Do ponto de vista pecuária, os ratos são fáceis de manusear, tem um tempo de reprodução baixa, um tempo de vida acelerado, e são relativamente baratos para abrigar. Com o desenvolvimento de diversas estirpes genéticas e estratégias (por ex., Condicionais knock-outs, ratinhos repórter, abordagens de rastreio de linhagem, etc.), bem como a grande variedade de reagentes disponíveis (por exemplo., Anticorpos, proteínas recombinantes, inibidores, etc.), os ratos se tornaram um organismo essencial modelo de vertebrados para descobrir processos de homeostase e de doenças humanas ^3.

Os ratos têm sido especialmente valiosa para estudar as condições pulmonares, incluindo lesão pulmonar aguda (LPA) e fibrose pulmonar. ⁴ LPA em seres humanos pode ser causado por trauma, lesão, ou septicemia e é caracterizada por células epiteliais evazamento endotelial (isto é., edema), inflamação e fibrose nascente. Em muitos pacientes, ALI progride para sua forma grave, síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), que muitas vezes resulta em fibrose e morte por insuficiência respiratória. ^5,6 fibrose pulmonar é uma patologia progressiva, fatal caracterizada pela deposição excessiva de matriz extracelular , digite mais notavelmente I colágeno, levando a função pulmonar prejudicada. ^7,8 a administração de bleomicina (BLM) é o modelo mais amplamente utilizado e melhor caracterizado para induzir ALI e fibrose em animais experimentais. ⁹ Apesar de fibrose pulmonar BLM-induzida em roedores faz não recapitular plenamente os fenótipos fibróticas humanos, ¹⁰ estudos com ratos com este modelo levaram à descoberta de muitos fatores importantes que influenciam o aparecimento e progressão da doença ^11.

Enquanto o mecanismo exacto (s) por detrás fibrogénese induzida por BLM são desconhecidas, a lesão iniciarPensa-se que surgir a partir de rupturas dos filamentos de DNA dependente de contacto nas células epiteliais que revestem as vias aéreas condutoras e alvéolos e, em particular, tipo 1 pneumócitos. ¹² A necessidade de contacto directo entre BLM eo epitélio pulmonar destaca a importância de uma rota de entrega robusta , e estas preocupações são também pertinentes para uma vasta gama de tratamentos direccionado para as vias respiratórias distais, incluindo proteínas recombinantes, anticorpos, siRNA, vírus, bactérias, partículas, e mais. Aspiração orofaríngea (OPA) tem sido amplamente utilizado para este fim ^13, mas um grande inconveniente de uma OPA é que alguma porção do agente fornecido pode ser engolida para o tracto gastrointestinal, conduzindo assim a imprecisão na dose administrada. Outra abordagem amplamente utilizada é a instilação transtraqueal, que envolve traqueostomia sob anestesia forte para expor a traqueia e a instilação de um agente directamente no tracto respiratório. ¹⁴ No entanto, tal não só podeum procedimento ser indesejável devido ao seu invasividade, mas também consome tempo, exige um pouco de formação, e provoca uma lesão potente ao tracto respiratório têm sido desenvolvidos. ^15,16 Vários protocolos que envolvem a administração directa de agentes para o traqueia, sem a necessidade de intervenção cirúrgica, ^{16,17,18,19,20} tempos de recuperação, mas estes métodos envolvem estendidos causada pelos anestésicos potentes, o uso de equipamento caro (isto é., otoscope / laringoscopio, disponíveis comercialmente placas de procedimento, de fibra óptica fios, etc.), um excesso de manipulação na cavidade oral, e a incerteza sobre a dosagem.

Este artigo descreve um método relativamente fácil de administração por entubação que permite que um investigador de forma rápida, barata, e infundir de forma fiável um reagente para o pulmão de murino com o risco reduzido de danos residuais para os tecidos circundantes.

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Protocolo

Os Comitês Institucionais de Animais Cuidado e Uso (IACUC) da Universidade de Washington e Cedars-Sinai Medical Center aprovaram o animal de trabalho necessário para estes estudos.

1. Preparação

1. Esterilizar ambas as pinças de extremidade embotada e o autoclave através de depressor.
2. Usando uma câmara de segurança biológica, prepare um estoque de trabalho de BLM em PBS a partir do pó liofilizado. Sonicar a solução durante 10 min a 35 kHz a assegurar uma mistura uniforme.
   Nota: Um volume total de entre 30 e 45 uL é recomendado para evitar a variação de pipetagem na extremidade baixa, e asfixia com volumes maiores.
3. Prepare um espaço de trabalho limpo, que inclui cerca de 1 m ^{2 para} o procedimento em si, bem como locais designados para gaiolas antes e após o procedimento.
4. Fixar a placa de base do procedimento para o banco imediatamente em frente do investigador por a disposição de 2 ou 3 tiras de fita laboratório através da base e Sublinharying banco. Veja a Figura 1 para mais especificações sobre a criação de um conselho.
5. Amarre um único comprimento de tamanho 4.0 fio de sutura entre os dois parafusos de posicionamento da placa de procedimento.
6. Gerar um espirómetro improvisada, removendo e rejeitando o êmbolo a partir de três seringas de 1 ml, e depositar 60 ul de PBS para o topo de cada barril, para formar uma vedação hermética. Fixar o cubo do cateter livremente para uma das seringas e colocá-lo para um lado do tabuleiro.
7. Aspirar 300 ul de ar para uma seringa de 1 mL e colocá-lo para um lado do tabuleiro.
8. Cortar uma peça adicional de fita de aproximadamente 6 polegadas de comprimento e lugar para um lado. Isso será usado para prender o animal para o conselho na etapa 2.4.
9. Configurar uma câmara de isoflurano. Fixe _O 2, isoflurano, e de vácuo para as portas apropriadas, tanto a câmara de exposição e o vácuo de apuramento. Em alternativa, administrar um anestésico de isoflurano-compatível biológicagabinete de segurança.

2. intubação

1. Anestesiar o rato com isoflurano na câmara até que ela perde a consciência e respiração retarda a uma taxa adequada. Uma exposição típico inclui 4% de isoflurano e 2% de O ₂ durante 3 a 4 minutos, e o resultado ideal é de 2 a 2,5 min da sedação. Isto corresponde a uma taxa de respiração de uma respiração cada 2 segundos.
2. Enquanto espera para a sedação para, em conjunto, aspirado entre 30 e 45 l de BLM em uma pipeta e lugar para um lado.
3. Quando estiver pronto, suspender o mouse sedado por seus incisivos superiores do fio ligado aos parafusos de posicionamento da plataforma procedimento. Certifique-se de que o dorso do animal fica plana contra a superfície da plataforma.
4. Tendo o cuidado de não restringir a ventilação, colocar um pedaço de fita livremente entre a parte inferior (caudal) da porção interior da cavidade torácica, logo acima do diafragma. A colocação deve ser apertado o suficiente para manter o alinhamento adequado durante o procedure, mas não tão apertado que restringe a respiração.
5. Ligue o iluminador para entre 80% e 100% de intensidade e orientar o pescoço de ganso de modo que é de 1 a 2 cm da superfície da pele, próximo do plexo solar. Verificar periodicamente a ponta do pescoço de ganso de calor para garantir que ele não ferir o rato.
6. De pé por trás da plataforma, use as estéreis, pinças fim brusco para localizar a língua. Ser cuidadoso para evitar os incisivos inferiores, suavemente aderência e desenhar a lingueta para fora da cavidade oral.
7. Usando a mão restante, insira o depressor e usá-lo para achatar a língua contra o assoalho da cavidade oral. Solte a pinça, mas deixe o depressor no lugar para as próximas duas etapas.
8. Orientar a luz de modo que a traqueia é visível, orientando o pescoço de ganso proximalmente a partir do nível do plexo solar até atingir o nível dos brônquios mainstem.
   Nota: A traqueia pode ser facilmente distinguidos pela acção da respiração, WHICH faz com que a luz emitida a flutuar em intensidade. Quando correctamente posicionada, esta estrutura será visível no plano axial de um pino localizado centralmente de luz com luz ambiente mínima na própria cavidade oral.
9. Ângulo da seringa para que ele segue o caminho natural da traqueia, e abaixe a ponta do cateter 22-G, com a seringa anexo contendo a gota, em linha reta para o lúmen. A bolha PBS começará a subir e descer com cada respiração em cima colocação bem sucedida.
   Nota: Esta acção pode ser retardado por vários segundos, como resultado da sedação profunda.
10. Alimentar o cateter em um adicional de 5 mm. Retire a espátula.
11. Deslocar a seringa ao lado oposto, e agarrando o hub, remova cuidadosamente a seringa.
12. Depósito entre 30 e 45 ul de BLM no centro do interior do cubo de cateter, anexar a segunda seringa e dispensar 300 ul de ar para dentro do cubo.
13. Substitua o segundoSeringa com o primeiro contendo a bolha de PBS. A bolha vai continuar a subir e descer se o procedimento foi realizado com sucesso.

Cuidado 3. pós-procedimento

1. Retirar o cateter e fita, e colocar o animal em um lugar quente e seco até que ele recupera a consciência - geralmente dentro de um par de minutos.

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Resultados

Ratos entubados foram monitorados diariamente para perda de peso e angústia, e sacrificados 4, 10 ou 17 dias depois através de injecção intraperitoneal de 2,5% 2,2,2 tribromoethanol. Lavado broncoalveolar (LBA) foi coletado em três lavagens de PBS como descrito em outra parte ²¹ , e o pulmão direito foi fixado em 10% de formalina, embebidos em parafina, e coradas com tricrómio de Masson pela Universidade de Washington Histologia e imagem ^de ...

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Discussão

Nos casos em que aerossolização é impraticável devido à disponibilidade limitada de reagentes, de segurança, ou de custos, a administração traqueal directa é um método superior para a entrega de agentes exógenos aos pulmões ¹⁶ transtraqueal instilação tem sido amplamente utilizada para realizar isto.; No entanto, como acontece com qualquer intervenção cirúrgica, ele também carrega consigo o potencial de complicações causadas pelo procedimento em si, e não necessariamente o agente a ser in...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleomycin For Injection, 30 units/vial	APP Pharmaceuticals, LLC	103720	For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots
Blunt End Forceps
Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4")	Covidien	E1551G	Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm  from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions.
Exel Safelet Catheter 22G X 1"	Exel International	26746
1 ml Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca)	BD	309659
0.2 ml Pipettor and Filter Tips
Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator	Dolan Jenner Industries, Inc.	181-1	Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea.
Intubation Board			See Diagram 1.
Colored Label Tape: 0.5 in. Wide	Fisherbrand	15-901-15A
Oxygen
Phosphate-Buffered Saline, 1X	Corning	21-040-CV	Product should be sterile
Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0	Harvard Apparatus	517698
Table Top Anesthesia Machine Isoflurane	Highland Medical Equipment		http://www.highlandmedical.net/
Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber	MIP / Anesthesia Technologies	AS-01-0530-SM
FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL	Baxter	1001936040
Nanozoomer Digital Pathology system	Hamamatsu
IgM ELISA Quantification Kit	Bethyl Laboratories	E90-101