O Desenvolvimento da liofilizado Loop-mediadas isotérmicas de amplificação Reagentes para a detecção de<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Resumo

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Resumo

Coxiella burnetii, o agente causador da febre Q, é uma bactéria intracelular obrigatório. Ensaios de diagnóstico baseado em PCR, têm sido desenvolvidos para a detecção de C. ADN burnetii em culturas de células e amostras clínicas. PCR exige equipamento especializado e treinamento extensivo usuário final e, portanto, não é adequado para o trabalho de rotina, especialmente em uma área de recursos limitados. Nós desenvolvemos um ensaio de amplificação isotérmica mediada por ciclo (LAMP) para detectar a presença de C. burnetii em amostras de doentes. Este método é realizado em uma única temperatura de cerca de 60 ° C em um banho-maria ou bloco de aquecimento. A sensibilidade deste ensaio de LAMP é muito semelhante a PCR com um limite de detecção de cerca de 25 cópias por reacção. Este relatório descreve a preparação de reacção, utilizando reagentes liofilizados e visualização dos resultados utilizando azul hydroxynaphthol (HNB) ou uma lâmpada de UV com corante fluorescente intercalante na reacção. Os reagentes LAMP foram lyophilized e armazenado à temperatura ambiente (TA) durante um mês sem perda de sensibilidade de detecção. Este ensaio LAMP é particularmente robusto, porque a preparação da mistura de reacção não envolve etapas complexas. Este método é ideal para uso em ambientes de recursos limitados onde a febre Q é endêmica.

Introdução

A pequena bactéria gram-negativa Coxiella burnetii é o agente causador da febre Q, que é uma zoonose em todo o mundo. Devido à distribuição mundial da febre Q ea alta infectividade do C. burnetii, pessoal militar e civil dos Estados Unidos desdobradas no exterior estão em risco de serem infectados nas áreas endêmicas.

febre Q manifesta de duas formas: infecções agudas e crónicas. Febre Q aguda apresenta-se com sintomas semelhantes aos da gripe, hepatite ou pneumonia, e geralmente é uma doença autolimitada, com uma taxa de mortalidade baixa. Febre Q crónica, embora menos prevalente, muitas vezes resulta em endocardite, que tem uma taxa de mortalidade muito maior se não tratada ^1,2. Portanto, o diagnóstico precoce para orientar um tratamento adequado é fundamental para o atendimento ao paciente. Reacção em cadeia da polimerase (PCR) e PCR quantitativo em tempo real (qPCR) ensaios foram desenvolvidos para a detecção de C. DNA burnetii em culturas de células e amostras clínicas ^{3-5 <}/ Sup>. Ambos PCR e qPCR são caros e muitas vezes não é facilmente disponível em áreas com recursos limitados para o trabalho de rotina.

Originalmente descrito por Notomi ^6, amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) oferece um método de amplificação de DNA alternativa. LAMP utiliza ADN-polimerase Bst ADN para a síntese de deslocamento de cadeia, juntamente com conjuntos de iniciadores especialmente concebidos para que reconhecem, pelo menos, seis regiões independentes do gene alvo. A vantagem mais significativa de LAMP é que a amplificação ocorre sob condições isotérmicas. Por conseguinte, apenas um banho de água, ou um bloco de aquecimento da incubadora é necessária. Este método tem sido utilizado para detectar vários agentes patogénicos rickettsiais ^7-9. A visualização dos produtos de ADN amplificados por electroforese em gel é o método mais preciso que pode diferenciar a partir de verdadeiros positivos falsos positivos devido à amplificação não específica. No entanto, os procedimentos envolvidos na electroforese em gel não são práticos para ar de recursos limitadoseas. Vários métodos alternativos foram desenvolvidos para detectar os produtos de reacção. Estes alternativa, tal como turbidez derivado de pirofosfato de magnésio formação ¹⁰ ou utilizando um corante fluorescente intercalante a ser visualizado sob luz UV ^11,12 são mais favoráveis ​​do que a execução de um gel. Os reagentes LAMP foram estáveis ​​durante um mês quando armazenada a 25 ° C e 37 ° C, que são temperatura ambiente em países tropicais e sub-tropicais onde a febre Q é endémica ^13.

Um ensaio de LAMP foi desenvolvido no nosso laboratório para detectar a presença de C. burnetii em amostras de plasma ^14. Descrevemos aqui um protocolo simples para a preparação da mistura de reacção a partir de LAMP os reagentes liofilizados. Os reagentes liofilizados são estáveis ​​durante um mês quando armazenada à temperatura ambiente. Quando combinado com um método fácil visualização, este é um método ideal para utilizar para a detecção de C. burnetii em um ambiente de recursos limitados.

Protocolo

1. Preparar diluições de DNA plasmídico como padrão para a Reacção LAMP

1. Utilizar um espectrofotómetro para determinar a densidade óptica (OD) a 260 nm para determinar o plasmídeo (contendo IS1111a gene alvo de C. burnetii RSA 493) a concentração de ADN. Um OD ₂₆₀ de 1 é igual a 50 ug / ul de ADN.
2. Converter a quantidade de DNA de plasmídeo no número de cópias. Uma vez que o tamanho do plasmídeo é 6330 pb, o peso molecular deste plasmídeo é de 4,1 x 10 ⁶ g (6,330 pb x 649 g / BP). A concentração do ADN do plasmídeo é 34,2 ng / mL (tal como determinado a partir do passo 1.1). 1 ul desta amostra de ADN contém 34,2 ng de ADN plasmídico, o equivalente a 5 x 10 ⁹ cópias (34,2 x 10 ^-9 g / 4,1 x 10 ⁶ 6,02 x 10 gx ²³⁾ de ADN.
3. Adicionar 10 ul de ADN de plasmídeo (5 x 10 ⁹ cópias / mL) a 90 uL de água para uma diluição de 10 vezes para fazer uma amostra de ADN de 5 x 10 ⁸ cópias / ul.
4. Repetir o passo 1.3 para preparar amostras de ADN de 5 x 10 ^7, 5 x 10 ^6, 5 x 10 ^5, 5 x 10 ^4, 5 x 10 ^3, 5 x 10 ^2, 5 x 10 ^1, e 5 x 10 ⁰ cópias / ul.

2. Prepare Template DNA a partir de amostras de Reacção LAMP

1. Realizar a extracção do ADN a partir de amostras de plasma humano, utilizando um kit de ADN de mini-comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Usar um total de 200 ul de amostra para a extracção e eluir o DNA extraído num volume de 20 ul.

3. Prepare 2x Tampão LAMP Reaction

1. Misturar 200 mL de 10x tampão de Pol, 320 ul de 5 M trimetilglicina, 12 ul de 1 M de _MgSO4, 280 uL de mistura de dNTP (10 mM cada) e 188 ul de água para perfazer 1 ml de tampão de 2x LAMP. Misture por pulso-vórtex durante 10 segundos.

4. Execute lâmpada padrão Reaction

1. Misture 12,5 ul de 2x LATampão PM (tal como preparado no passo 3; Tris-HCl 40 (pH 8,8), KCl 20 mM, MgSO mM 16 _4, 20 mM de (NH _{4) 2} SO _4, 0,2% de Triton X-100, trimetilglicina 1,6 M, 1,4 mistura de dNTP mM), 1,2 ul de mistura de iniciadores, 1 mL de polimerase de ADN Bst (8 U / ul) e 5,3 ul de água para tornar a mistura de reacção (20 ul) num tubo de PCR de 0,2 ml.
2. Adicionar 5 uL de ADN (do passo 1 ou 2) para a mistura reaccional de 20 ul e misturar bem.
3. Primeiro tubo e incubar a 60 ° C durante 60 min num banho-maria ou bloco de aquecimento. Esta é a temperatura de reacção óptima previamente determinada.
4. Adicionar 5 uL de tampão de carga de gel de 10x para terminar a reacção.
5. Carga de 5 ul dos produtos de reacção a um gel de agarose a 2% corado com intercalando mancha de ácido nucleico.
6. Executar gel a 100 V durante 35 min em tampão 1 x TBE.
7. Visualize os resultados por luz UV.

5. Execute Reaction LAMP com Reconstituídoreagentes

1. Misturar 125 ul de Tampão 10 x Pol, 200 mL de 5 M trimetilglicina, 7,5 ul de 1 M de _MgSO4, 667,5 ul de água para perfazer 1 ml de tampão de reconstituição. Misture por pulso-vórtex durante 10 segundos.
2. Retire os tubos que contêm os reagentes liofilizados a partir do saco de folha de alumínio selado. Não utilize os tubos se o saco de folha de alumínio não está vedada ou se ele estiver danificado.
3. Adicionar 20 ul de tampão de reconstituição em cada tubo para ressuspender reagentes liofilizados.
4. Misture pipetando tampão cima e para baixo 5 vezes. Dê uma olhada para garantir que os reagentes liofilizados são completamente re-suspensa. O pó branco deve desaparecer no tubo.
5. Adicionam-se 5 ul de molde de ADN (do passo 1 ou 2) para os reagentes reconstituídos e misturar bem.
6. Primeiro tubo e incubar a 60 ° C durante 60 min num banho-maria ou bloco de aquecimento.
7. Adicionar 5 uL de tampão de carga de gel de 10x para terminar a reacção.
8. Carga de 5 ul de reacçãoprodutos para um gel de agarose a 2% corado com corante intercalante ácido nucleico.
9. Executar gel a 100 V durante 35 min em tampão 1 x TBE.
10. Visualize os resultados por luz UV.

6. Execute LAMP Reação com Reconstituição tampão contendo HNB ou fluorescente intercalando Dye

1. Misturar 125 mL de 10x Pol de Amortecimento, 200 mL de 5 M trimetilglicina, 7,5 ul de 1 M de _MgSO4, 7,5 ul de HNB 20 mM (ou 12,5 ul de 100x corante fluorescente intercalante) e 660 uL (ou 655 ul) de água para fazer 1 ml de tampão de reconstituição. Misture por pulso-vórtex durante 10 segundos.
2. Use o tampão reconstituído preparado na seção 6 para repetir os passos 5.2 - 5.6.
3. Visualize os resultados por a olho nu (reacção contendo HNB) ou uma luz UV (reacção contendo corante de intercalação fluorescente).

7. Realizar em tempo real Reaction LAMP com Scanner Tubo

1. Adicionam-se 5 ul de DNA para o reconstitutreagentes ed contendo corante de intercalação fluorescente, perto do tubo e inseri-lo para o scanner tubo.
2. Ajuste da temperatura de incubação a 60 ° C. Medir a fluorescência a 520 nm durante 60 min.

Resultados

Os reagentes liofilizados LAMP no interior do tubo de 0,2 ml contém polimerase de ADN Bst, iniciadores e os dNTP. 20 ul de tampão de reconstituição é utilizado para re-suspender os reagentes liofilizados. A Figura 1 mostra os resultados da reacção LAMP em géis de agarose com reagentes recém-preparados e reagentes liofilizados. O reagente liofilizado não reduz a sua actividade. Reacções LAMP preparados por ambos os reagentes pode detectar 25 cópias d...

Discussão

Anteriormente, foi desenvolvido um ensaio LAMP sensível e específico visando o elemento de inserção IS1111a ^14. O elemento IS1111 foi selecionado porque ele é altamente conservado entre as diferentes estirpes de C. burnetii e o seu elevado número de cópias (7-110) em que as bactérias (Klee 2006). Os nossos resultados mostraram que a lâmpada pode detectar cerca de 25 cópias do elemento IS1111, que pode correlacionar-se com tão pouco como uma única cópia cromoss?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
LAMP primers	Eurofins MWG operon	10 nmol, salt free	Sequence designed by customer
Bst DNA polymerase	New England Biolabs	M0275L	8 units/ml
10x Thermo pol buffer	New England Biolabs	B9004S
dNTP mixture	New England Biolabs	N0447L	10 mM each
Betaine	Sigma-Aldrich	B0300	5 M, Trimethylglycine
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M3409-1ML	1 M
10x Bluejuice	Invitrogen	10816-015	gel loading buffer
SYBR green	Invitrogen	S7585	10,000x, visualize products in tubes
GelRed	Phenix Research Products	RGB-4103	10,000x, visualize products in gels
Lyophilized reagents	Gene Reach
Hydroxynaphthol blue	Fluka	33936-10G
ESEQuant tube scanner	Qiagen		real-time detection