Modelo murino de isquemia-reperfusão

Resumo

Aqui nós descrevemos o procedimento detalhado de isquemia e reperfusão em ratos que resulta em lesão reprodutível sem mortalidade para incentivar a padronização da técnica em todo o campo. Este modelo de lesão por isquemia-reperfusão intestinal pode ser utilizada para estudar os mecanismos celulares e moleculares da lesão e da regeneração.

Resumo

isquemia intestinal é uma condição de risco de vida associada com uma ampla gama de condições clínicas, incluindo a aterosclerose, trombose, hipotensão, enterocolite necrotizante, transplante do intestino, trauma e inflamação crónica. lesão isquemia-reperfusão (IR) é uma consequência da isquemia mesentérica aguda, causada por fluxo inadequado de sangue através dos vasos mesentéricos, resultando em danos intestinal. A reperfusão após isquemia pode agravar os danos do intestino. Os mecanismos de lesão IR são complexos e pouco conhecidos. Portanto, modelos animais experimentais pequenas são críticas para a compreensão da patofisiologia da lesão de IR e o desenvolvimento de novas terapias.

Aqui nós descrevemos um modelo de rato de lesão IR intestinal aguda que fornece lesão reprodutível do intestino delgado sem mortalidade. Isto é conseguido através da indução de isquemia na região do íleo distai por temporalmente ocludinag ramos colaterais periféricos e terminais da artéria mesentérica superior por 60 min usando clipes microvasculares. A reperfusão durante 1 hora, ou 2 horas após a lesão em resultados lesão reprodutível do intestino examinado por análise histológica. posição apropriada dos clipes microvasculares é crítica para o processo. Por isso, o clipe de vídeo fornece uma descrição detalhada visuais passo-a-passo desta técnica. Este modelo de lesão intestinal de IR podem ser utilizados para estudar os mecanismos celulares e moleculares da lesão e da regeneração.

Introdução

O intestino é muito sensível à interrupção do fluxo sanguíneo que provoca isquemia e epitelial danos. A reperfusão após isquemia fornece a re-oxigenação do tecido, e pode promover ainda mais a patologia. Portanto, a lesão por isquemia e reperfusão intestinal está associada com uma vasta gama de patologias, incluindo enterocolite necrotizante, a rejeição de aloenxertos em transplantes do intestino delgado, complicações de cirurgia abdominal aórtica do aneurisma, bypass cardiopulmonar, e ^1,2 inflamatória doença do intestino. Lesão intestinal IR, isquemia mesentérica especialmente grave, é uma doença potencialmente fatal, resultando em morbidade e mortalidade ^3.

Embora pouco compreendida, isquemia-reperfusão (IR) lesão é pensada para ser associada com mudanças na flora intestinal, bem como a produção de espécies de oxigénio reactivas e citocinas inflamatórias e quimiocinas ^1,4-6. Isto leva a activação de ambos emNate e mecanismos imunes adaptativas que promovem a inflamação e lesão tecidual ^1,7,8.

Os modelos animais são fundamentais para a compreensão dos mecanismos de lesão IR, uma vez que permitem fácil gain- e perda de função experimentos genéticos. Vários modelos animais de IR foram desenvolvidos que incluem a oclusão vascular completa, isquemia baixo fluxo, e segmentado oclusão vascular (resumidos num recente revisão abrangente ^9). A isquemia intestinal provocada por uma oclusão vascular completa da artéria mesentérica superior (SMA) é um modelo simples e utilizada de IR em grandes animais roedores e ^9-11. No entanto, diferentes áreas do intestino ter susceptibilidade diferente a uma lesão. Além disso, a diversidade de anestésicos, analgésicos, as técnicas de oclusão da artéria, bem como inconsistência na duração das lesões de isquemia e recuperação resultado em graus variáveis ​​de lesão confundir o nosso entendimento da biologia do IR através de vários Studies. A Tabela 1 mostra estas inconsistências nos estudos IR murino. A maior desvantagem de usar o tempo de isquemia mais curtos (30-45 min) tem como alvo a janela de recuperação sobre a qual podem ser observadas diferenças discerníveis entre casos e controles. lesão leve para o epitélio pode ser resolvido de uma hora após a reperfusão, portanto especializada métricas patológicos pode ser necessário para encontrar diferenças de restituição epitelial. Em contraste, danos excessivos, como visto por 100 min de lesão isquémica pode resultar na denudement completa do epitélio, em que a restituição não é mais possível, aumentando a taxa de mortalidade, e o tempo de recuperação. Portanto, aqui nós descrevemos o procedimento detalhado de IR intestinal em camundongos que resulta em lesão reprodutível sem mortalidade para incentivar a padronização da técnica em todo o nosso campo. Este modelo de lesão intestinal de IR podem ser utilizados para estudar os mecanismos celulares e moleculares da lesão e da regeneração.

Protocolo

Os estudos em animais foram realizados de acordo com o Instituto Nacional de Saúde e orientações foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee da Trudeau Institute. 8-12 semanas de idade C57BL / 6 murganhos foram utilizados para o estudo.

1. Preparação para a cirurgia

1. Preparar e esterilizar instrumentos cirúrgicos.
2. Prepare sistema de anestesia com base em isoflurano com cone do nariz, e uma almofada aquecida. Certifique-se de almofada aquecida não está superaquecido (<39 ºC).
3. Certifique-se de que a eliminação de gás isofluorano recipiente é posicionado correctamente para garantir as portas de escape, na parte inferior do recipiente não estão bloqueadas ou oclusa em qualquer maneira. Pesar de gás eliminação canister antes do procedimento e peso documento sobre canister. Deite fora a embalagem quando o peso recipiente for superior a 50 g de peso acumulado (~ 12 horas).

2. Anestesia

1. Anestesiar rato com 3% de isoflurano numa câmara de indução (1 L / minO _2).
   1. Avaliar a profundidade da anestesia por uma incapacidade de permanecer em pé, perda de movimento intencional voluntário, perda de reflexo de piscar, relaxamento muscular e perda de resposta ao reflexo de estimulação (dedo do pé ou pitada cauda com uma pressão firme).
   2. Avaliar a frequência respiratória e padrão observando parede torácica e movimentos abdominais. Sob anestesia ideal, a taxa de respiração deve ser ~ 55-65 respirações por min.
   3. Retirar do rato da câmara de indução e rapidamente raspar a área do abdômen do mouse.
2. Para evitar a dessecação da córnea, colocar pomada oftálmica branda nos olhos.
3. Coloque o mouse sobre a almofada aquecida e conectá-lo via cone do nariz para o sistema de anestesia. Certifique-se de membrana cone do nariz do látex se encaixa firmemente sobre a cabeça do mouse e não há vazamento de isoflurano.
4. Reduzir a taxa de isoflurano a 1,5%, e injectar buprenorfina (0,1 mg / kg) e cetamina (10 mg / kg) por via subcutânea a evitar wind-up da dor-cascata.
5. limpe the a pele da área de operação, com uma mecha de algodão estéril embebido em solução cirúrgica Betadine seguido por 70% de etanol.

3. Cirurgia

1. Faça uma linha de meados 3-5 cm laparotomia com uma tesoura de operação. área de atuação tampa com almofada anti-aderente estéril umedecido com solução salina. Isolar ceco e íleo e expor a artéria mesentérica superior utilizando zaragatoas de algodão humedecido em solução salina.
2. Para facilitar o clipe de aplicar, fazer pequenos cortes no mesentério em torno da artéria mesentérica superior usando iris finas scissors.To fazer isso, levante cuidadosamente o intestino com uma pinça de vestir e cortar mesentério em ambos os lados da artéria mesentérica superior na posição clipe desejado (Figura 1A). Em seguida, adicionar algumas gotas de solução salina estéril para a área do grampo posição desejada antes de aplicação de clipes.
   Nota: Para realizar a cirurgia sham, siga o procedimento cirúrgico até ao passo 3.2. Não aplicar clipes. Em vez disso, manter o tecido húmido por acrescentou s quenteAline como descrito em 3.6, durante 1 h. Depois, siga para o passo 4.1,
3. Ocluir as primeiras ramificações ordem da artéria mesentérica superior com clipes microvasculares (70 g) utilizando uma força de aplicador de pinças para criar uma região de 5-7 cm do íleo isquémica adjacente ao ceco (Figura 1B). Embora a posição dos vasos é conservadora, pode haver ligeiras variações entre ratos (ver exemplos na Figura 1). Portanto, 2 ou 3 clipes são geralmente necessária (ver a localização dos clipes na Figura 1A, D, E, setas pretas).
   Nota: Use grampos de navios de qualidade elevada. clipes de alta pressão pode danificar os vasos e impedir a regeneração enquanto clipes de baixa pressão (<30 g) não pode bloquear completamente o fluxo sanguíneo.
4. Bloquear o fluxo de sangue colateral através do intestino utilizando dois clipes microvasculares através vasos (40 g vigor), demarcando a região do intestino isquêmico (Figura 1). Oclusão de vasos colaterais é necessária paraimpedir o fornecimento de sangue dos vasos sanguíneos adjacentes (ver a localização dos clipes na Figura 1A, D, E, setas verdes).
5. Opcional: Adicionar solução de heparina (6 USP unidades / ml), para impedir a coagulação do sangue. Gota a gota, adicionar 0,5 ml de solução de heparina para o intestino isolado.
6. Wet almofada anti-aderente delicados toalhetes estéreis com solução salina pré-aquecido a 37 ° C e aplicar à área cirúrgica. Certifique-se que toalhetes permanece molhada durante todo o procedimento.
7. Manter a isquemia durante 60 minutos utilizando 1-1,5% anestesia com isoflurano todo. Se procedimento de isquemia é realizado corretamente, a região isquêmica mudará para vinho de cor vermelha em aproximadamente 30 min. Note-se que os vasos sanguíneos distais para a posição de grampo são aumentados durante a isquemia (Figura 1, painéis direitos), indicando oclusão bem sucedida.
8. acompanhar de perto o mouse durante a fase de isquemia. Continuar a aplicar uma solução salina para a almofada não-aderente que cobre o local da cirurgia.
9. Marcaas margens da área isquémica através de pipetagem 20 ul de Gill`s 3 hematoxilina no tecido para facilitar a colheita do tecido isquémico e tecido saudável adjacente a partir do mesmo rato para comparação (Figura 1E, painel da direita).

4. A reperfusão Stage

1. No final da isquemia adicionar algumas gotas de solução salina na zona do grampo e suavemente remover clipes microvasculares com aplicador de agrafo. Em seguida, empurre cuidadosamente o intestino volta para a cavidade abdominal com solução salina umedecido dicas de algodão. Remover almofada anti-aderente e fechar a parede abdominal e a pele usando 9 mm agrafos de aço inoxidável. Se reperfusão é realizado mais do que 3 horas, usar uma sutura Vicryl absorvível para fechar a parede abdominal antes de aplicação de clipes para feridas na pele.
2. Manter ratinhos em uma gaiola limpa aquecida para a quantidade desejada de tempo (30 min, 60 min, 120 min, ou 180 min) para a fase de reperfusão.
3. Verifique animais, pelo menos a cada 30 min para assegurar a estabilidade.

5. Necropsia e Colheita de Intestino Delgado

1. Eutanásia ratos por overdose de _CO2, seguido por deslocamento cervical no tempo desejado após a reperfusão.
2. Abra cavidade abdominal e recolher o tecido intestinal isquémica, para posterior análise. Colheita tecido normal saudável adjacente ao tecido lesionado como um controlo interno para a conta para qualquer reação sistêmica à lesão.
   Nota: Este controle é mais apropriado do que o falso operado camundongos de controle porque os ratos sujeitos a operação simulada não sejam objecto de uma reação sistêmica à lesão induzida pelo IR.
3. Lavar o conteúdo intestinal utilizando 30 ml seringa com agulha gavage anexo preenchido com solução salina e depois cortar o intestino longitudinalmente. Se é necessária uma amostra de intestino para análise da expressão do gene, um fragmento cortado longitudinalmente 1,5 milímetros, e utilizar a parte restante para análise histológica.
4. Para análise histológica, preparar um rocambole usando um par de fórceps para rolar a intestine.
5. Para manter a forma enrolada, colocar as peças de intestino entre almofadas de espuma de biópsia em cassetes de tecido (Figura 2). Coloque as cassetes em formalina a 10% tamponada.
6. Corrigir o tecido em formalina durante pelo menos 24 h. Substituir formalina com 70% de etanol durante mais 24 horas adicionais. tecido loja em etanol 70% indefinidamente à temperatura ambiente.
7. Incorporar-se em parafina, cortadas secções de 5 | iM e mancha com hematoxilina e eosina utilizando um protocolo padrão (Figura 3).

6. Scoring

1. Pontuação da lesão de isquemia-reperfusão murino como resumido na Tabela 2. Escolha um método de pontuação apropriada.
2. Opcional: Dividir o campo de visão em quatro secções visto que a gravidade da lesão varia ao longo da secção.
3. Calcule a média das notas de cada seção da pontuação obtida cegamente.
4. Comparar o grau do tecido lesado entre casos e controle, bem como a the ilesa tecido utilizando um teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste de comparações múltiplas de um Dunn.

Resultados

Nós optimizada do protocolo experimental de cirurgia de IV para se obter lesão induzida IR reprodutível do íleo em ratos. Os resultados representativos são demonstradas nesta secção.

A Figura 1 mostra exemplos de posição clips microvasculares para induzir isquemia do íleo. setas pretas mostram a posição dos principais clipes de oclusão primeiros ramos da ordem de artéria mesentérica superior. se...

Discussão

O desenvolvimento de modelos de rato de lesão IR intestinal têm melhorado muito a compreensão dos mecanismos de lesão tecidual e ajudado no desenvolvimento de potenciais estratégias terapêuticas para minimizar danos nos tecidos ^7,9,11,34. Os passos críticos deste protocolo é o posicionamento adequado dos clipes microvasculares, timing correto da isquemia e histológica adequada avaliação da lesão IR.

A duração da isquemia é crítico para a subsequente lesão do epit?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heated Pad	Sunbeam	E12107-819	Alternative: Braintree Scientific heated pad
Table top research anesthesia Machine	Vasco	UCAP 0001-0000171	Alternative: Parkland Scientific, V3000PS
Nose Cone	Parkland Scientific	ARES500
Scavenger canister and replacement cartridge	Parkland Scientific	80000, 80120
Induction Chamber	Surgivet	V711802
Isoflurane	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-10	Controlled substance, contact IACUC
Animal clipper	Oster	Oster Golden A5 078005-050-003
Ophthalmic ointment	Webster	8804604
Buprenorphine	McKesson	562766	Controlled substance,contact IACUC
Ketaset (Ketamine HCl)	Pfizer	NADA 45-290	Controlled substance, contact IACUC
Cotton tips	Puritan medical products	806-WC	Autoclave before use
Betadine	Purdue Products	67618-150-17	10% Povidone-Iodine
Sterile saline solution	Aspen	46066-807-60	Adjust to room temperature before use
IR rodent thermometer	BIOSEB	BIO-IRB153
Micro vascular clips, 70 g	Roboz Surgical	RS5424, RS5435	Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion
Micro vascular clips, 40 g	Roboz Surgical	RS6472	Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion
Clip applying forceps	World Precision Instruments	14189	Alternative: Roboz #RS-5410 or  #RS-5440
Gill's 3 hematoxylin	Thermo Scientific	14-390-17
Surgical staples, Reflex 9 mm	Cell Point Scientific	201-1000
Autoclip applier	Beckton Dickinson	427630
Byopsy foam pad	Simport	M476-1
Tissue cassette	Fisher Healthcare	15182701A	Histosette II combination lid and base
10% buffered formalin	Fisher Scientific	245-684
Surgical iris scissors	World Precision Instruments	501263-G SC	Alternative: Roboz RS6816
Operating scissors	World Precision Instruments	501219-G	Alternative: Roboz RS6814
Dressing forceps	Roboz Surgical	RS-5228, RS-8122	Alternative: World Precision Instruments 1519-G
Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg	Sigma	2106
Reflex wound clip removing forceps	Roboz Surgical	RS-9263	Alternative: World Precision Instruments: 500347
Mice C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Stock No 0664
Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile	Coviden	1050
Fisherbrand transfer pipets	Fischer Scientific	13-711-5AM	Use pipets to dropwise add saline