Um Guia para Estruturado iluminação TIRF microscopia de alta velocidade com várias cores

Resumo

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

Resumo

imaging super-resolução óptica com microscopia de iluminação estruturada (SIM) é uma tecnologia-chave para a visualização de processos a nível molecular na ciências biomédicas e químicas. Embora os sistemas SIM comerciais estão disponíveis, os sistemas que são projetados em laboratório pode superar sistemas comerciais, este último normalmente concebidos para facilidade de uso e aplicações de uso geral, tanto em termos de fidelidade de imagem e velocidade. Este artigo apresenta um guia detalhado para a construção de um sistema SIM que utiliza iluminação reflexão interna total (TIR) ​​e é capaz de imagem em até 10 Hz em três cores em uma resolução chegando a 100 nm. Devido à combinação de SIM e TIRF, o sistema proporciona um melhor contraste de imagem do que as tecnologias rivais. Para atingir estas especificações, vários elementos ópticos são utilizados para permitir controle automatizado sobre a estrutura de estado de polarização e espacial da luz de iluminação para todos wav excitação disponíveiselengths. Detalhes completos sobre a implementação de hardware e controle são dadas para conseguir a sincronização entre a geração de luz de excitação teste padrão, comprimento de onda, estado de polarização, e controle da câmera com ênfase na obtenção de taxa de quadros máxima de aquisição. Um protocolo passo-a-passo para o alinhamento e a calibração do sistema é apresentado e a melhoria resolução alcançável é validado em amostras de teste ideal. A capacidade de imagiologia super-resolução de taxa de vídeo é demonstrada com células vivas.

Introdução

Ao longo da última meia década, a microscopia de super-resolução amadureceu e mudou-se de laboratórios ópticos especializados para as mãos do biólogo. Existem soluções microscópio comerciais para os três principais variantes para alcançar óptico super-resolução: microscopia molécula localização única (SMLM), estimulado microscopia de esgotamento de emissão (STED), e microscopia de iluminação estruturada (SIM) ^1,2. SMLM tais como microscopia fotoativados localização (PALM) e microscopia óptica reconstrução estocástico (STORM) têm sido as técnicas mais populares, em grande parte devido à simplicidade da configuração óptica e a promessa de alta resolução espacial, prontamente abaixo de 20 nm. No entanto microscopia de super-resolução via única molécula de localização vem com uma intrínseca trade-off: o atingível resolução espacial é dependente de acumular um número suficiente de localizações fluoróforo individuais, limitando assim a resolução temporal. processo dinâmico de imagemES em células vivas, por conseguinte, torna-se problemático como uma amostra deve adequadamente o movimento da estrutura de interesse para evitar artefactos de movimento ao mesmo tempo que a aquisição de acontecimentos de localização suficientes em que o tempo para reconstruir uma imagem. A fim de atender a esses requisitos, demonstrações ao vivo SMLM celular têm obtido o necessário aumento das taxas de fluoróforo photoswitching, aumentando muito o poder de excitação, e isso leva por sua vez a fototoxicidade e estresse oxidativo, limitando assim o tempo de sobrevivência de amostra e relevância biológica ^3.

A clara vantagem de STED sobre ambos SIM e SMLM é que ele pode imagem com super-resolução em amostras de espessura, por exemplo resolução lateral de cerca de 60 nm foi conseguida em fatias de cérebro organotípicas em profundidades de até 120 mm ^4. Imagiologia em tais profundidades com implementações objetivos únicos de SMLM ou SIM é inviável, mas torna-se possível com qualquer folha de luz única molécula ou estrutura folha de luz microscopy ^5. -Taxa de Vídeo STED também tem sido demonstradas e utilizadas para mapear a mobilidade das vesículas sinápticas, embora até agora este tem sido limitada a imagiologia de pequenos campos de visão ^6.

Para aplicações em biologia celular e reacções auto-montagem moleculares ^{7 - 12} que exigem imagens com alta resolução temporal ao longo de muitos pontos de tempo, microscopia de iluminação estruturada (SIM) pode ser bem adequada, uma vez que não é dependente das propriedades fotofísicas de um marcador fluorescente particular, sondar. Apesar dessa vantagem inerente do SIM, até agora a sua utilização tem sido principalmente confinada à imagem latente células fixas ou processos lentos. Isto é devido às limitações dos sistemas de SIM comercialmente disponíveis: a taxa de quadros aquisição destes instrumentos foi limitada pela velocidade de rotação das grades utilizadas para gerar os padrões de iluminação sinusoidais necessários, bem como a manutenção da polarização óptica. A mais nova geração de SIM comercialinstrumentos são capazes de imagem rápido, mas eles são proibitivamente caro para todos, mas as instalações de imagiologia centrais.

Este protocolo apresenta um guia para a construção de um sistema flexível SIM para imagiologia de processos rápidos em amostras finas e perto da superfície basal de células vivas. Emprega total de fluorescência de reflexão interna (TIRF) para gerar um padrão de iluminação que penetra no mais profundo do que cerca de 150 nm na amostra ^13, que reduz drasticamente o fora de sinal de fundo do foco. A idéia de combinar SIM com TIRF é quase tão antiga como SIM-se ^14, mas não foi realizado experimentalmente antes de 2006 ^15. A primeira in vivo imagens obtidas com TIRF-SIM foram relatados em 2009 ¹⁶ atingindo taxas de quadro de 11 Hz para visualizar tubulina e kinesin dinâmica, e dois sistemas TIRF-SIM cores foram apresentados ^17,18. Mais recentemente, uma guia para a construção e utilização de uma única cor de dois feixes s SIMistema foi apresentado com frame-rate de até 18 Hz ^19,20.

O set-up aqui apresentado é capaz de imagem de super-resolução SIM a 20 Hz em três cores, dois dos quais podem ser operados em TIRF-SIM. Todo o sistema é construído em torno de um corpo do microscópio invertido e usa uma fase de tradução XY motorizada com um palco z-atuado piezo. Para gerar os padrões de excitação sinusoidal necessários para TIRF-SIM, o sistema apresentado utiliza um modulador de luz espacial ferroeléctrica (SLM). padrões binários de grelha são mostradas na SLM e as ordens de difracção de ± 1 resultantes são filtrados, e retransmitida focado no anel TIR da lente objectiva. Os deslocamentos e as rotações dos gradeamentos de fase necessários são aplicadas mudando a imagem exibida SLM. Este protocolo descreve como construir e alinhar um tal caminho de excitação, detalha o alinhamento do caminho de emissão, e apresenta amostras de ensaio para garantir um alinhamento óptimo. É também des os secretários questões e desafios específicos para alta velocidade TIRF-SIM em matéria de controlo de polarização e sincronização de componentes.

Considerações de design e Restrições

Antes de montar o sistema TIRF-SIM apresentados neste protocolo, existem várias restrições de design a considerar que determinam a escolha de componentes ópticos. Todas as abreviaturas de componentes ópticos referem à Figura 1.

Spatial Luz modulador (SLM)

A ferroelétrico SLM binário é utilizado nesta configuração, uma vez que é capaz de comutação padrão de sub-milissegundo. SLMs nemáticos em tons de cinza podem ser usados, mas estes oferecem bastante reduzido os tempos de comutação. Cada ligado ou desligado do pixel binário numa fase SLM vai conferir deslocamento para a frente de onda plana incidente, quer uma fase π ou 0, por conseguinte, se um padrão de grelha periódica é exibido na SLM ele irá operar como uma grade de difracção de fase.

ent "> reflexão interna total (TIR)

Para atingir TIR e produzir um campo evanescente, o ângulo de incidência dos feixes de excitação na interface vidro-amostra deve ser maior do que o ângulo crítico . Isso define o ângulo mínimo incidente necessário, e, portanto, também o espaçamento máximo, ou período, do padrão de iluminação evanescente. O ângulo máximo de incidente (O ângulo de aceitação) é limitado pela abertura numérica (NA) da lente objectiva, que pode ser calculada a partir da definição . Isto determina o padrão de espaçamento mínimo realizável de acordo com a fórmula Abbe que liga NA e comprimento de onda para o padrão de espaçamento mínimo . Na prática, uma imersão em óleo 1,49 NA TIRF objectivo produz um ângulo de incidência máximo de cerca de 79 ° e um período mínimo de padrão na amostra de 164 nm, utilizando um comprimento de onda de excitação de 488 nm. Estes dois ângulos definem um anel em volta da abertura da objectiva sobre os quais o instrumento atinge TIR iluminação (ou seja. O anel TIR), e em que os focos duas excitação deve ser posicionado com precisão e precisamente rodado para gerar cada padrão de iluminação.

Reconstrução de imagens TIRF-SIM exige a aquisição de um mínimo de três deslocamentos de fase por rotação padrão, portanto, o período padrão de SLM deve ser divisível por 3 (ver Figura 1). Por exemplo, um período de 9 pixels para iluminação 488 nm e 12 pixels para 640 nm iluminação. Para uma discussão abrangente de design padrão SLM, incluindo otimização de sub-pixel de padrão de espaçamento usando grades de cisalhamento, Ver o trabalho anterior de Kner et al. ¹⁶ e Lu-Walther et al. ²⁰ A posição dos dois focos de excitação deve estar dentro do anel TIR para todos os comprimentos de onda, no entanto, o ângulo de difracção dos ± 1 ordens da SLM é de comprimento de onda dependente. Para SIM padrão, imagem multicolor pode ser obtida através da optimização do período de reticulação para o comprimento de onda mais longo, e tolerar uma perda de desempenho para os canais mais curtos. Para TIRF-SIM no entanto, optimizando para um comprimento de onda significa que o outro comprimento de onda deixa de focos dentro do anel são TIR. Por exemplo, utilizando um período de reticulação de 9 pixels é suficiente para proporcionar TIRF para 488 nm, como os focos são a 95% do diâmetro da abertura para trás e para dentro do anel TIR, mas para 640 nm, este período seria posicionar o focos fora a abertura. Por esta razão diferentes espaçamentos padrão de pixel deve ser utilizado para cada comprimento de onda de excitação.

O alinhamento do caminho de excitação TIRF-SIMé extremamente sensível a pequenas mudanças na posição do espelho dicróico (DM4 na Figura 1) no corpo do microscópio, muito mais assim do que no SIM convencional. Utilização de uma torreta rotativa cubo de filtro não é recomendado, em vez disso usar um único, espelho dicróico multi-banda, que é mantido numa posição fixa e concebidos especificamente para os comprimentos de onda de excitação utilizados. É essencial que apenas a maior qualidade espelhos dicróicos são utilizados. Estes exigem substratos grossos de pelo menos 3 mm, e são muitas vezes designado como "plano de imagem" pelos fabricantes. Todos os outros substratos levar a aberração intolerável e degradação da imagem em TIRF-SIM.

Controle de polarização

Para alcançar TIRF-SIM é essencial rodar o estado de polarização da luz de excitação, em sincronia com o padrão de iluminação de modo a que ele permanece azimutais polarizada no plano da pupila objectivo em relação ao eixo óptico (isto é,. s-polarizada). O alinhamento das ópticas de controlo de polarização dependerá do elemento óptico específico empregue, por exemplo uma célula de Pockels ^21, ou uma placa de meia onda em uma etapa de rotação motorizada ^22. Neste protocolo um retardador variável de cristal líquido personalizado (LCVR) é usado, projetado para fornecer de onda completa (2π) retardance sobre a faixa de comprimento de onda 488-640 nm, uma vez que permite a comutação rápida (~ ms). Se usar um retardador de cristal líquido é essencial a utilização de um componente de alta qualidade: componentes padrão geralmente não são suficientemente estáveis ​​para dar um retardamento constante ao longo da duração do tempo de exposição da câmara que leva a uma desfocagem para fora do padrão de iluminação e de baixo contraste de modulação . retardadores de cristal líquido são também fortemente dependente da temperatura e exigem construído no controle de temperatura.

sincronização

Os lasers deve ser sincronizado com o SLM. SLMs ferroelétricos binários são equilibrados internamente por switching entre um estado ligado e desligado do estado. Os pixels só agem placas como meio de onda em qualquer seu estado ligado ou desligado, mas não durante o tempo entre quadros de comutação. Portanto, os lasers só deve ser ligado durante estados on / off através do LED Activar sinal do SLM para evitar uma redução em contraste padrão devido ao estado intermediário dos pixels. Um modulador acústico-óptico (OMA) pode, alternativamente, ser utilizado como um obturador rápido, se os lasers não podem ser modulados digitalmente.

Escolha de lentes

Com base nestes constrangimentos, o demagnification necessária do plano SLM sobre o plano da amostra para produzir os padrões de iluminação pretendida pode ser determinada. Isto permite o cálculo das distâncias focais de duas lentes L3 e L4 no telescópio relé imagem e a lente de excitação condensador L5. Neste sistema um / imersão em óleo 1.49NA lente objectiva 100X é usado com 488 nm de excitação e 640 nm, consequentemente, utiliza comprimentos focais de 300 e 140 milímetrospara L4, L3, e 300 mm de L5, dando um total de demagnification 357X, equivalente a um tamanho de pixel de 38 nm SLM no plano da amostra. Usando esta combinação de lentes, SLM ralar para 9 períodos de iluminação 488 nm e 12 pixels para dar 640 nm padrão de espaçamentos 172 e 229 nm para a amostra, que corresponde a ângulos de incidência de 70 ° e 67 ° respectivamente. Para uma interface de água de vidro, o ângulo crítico é de 61 °, e é independente do comprimento de onda, por conseguinte, estes dois espaçamentos padrão permitir excitação TIRF para ambos os comprimentos de onda. Uma lente objectiva equipado com um colar de correcção é útil para a correcção das aberrações esféricas introduzidos por variações na espessura da lamela, ou se a operar a 37 ° C.

Reconstrução imagem

Uma vez que os dados em bruto SIM tenha sido adquirido, é uma questão de esforço computacional para gerar imagens de super-resolvido em um processo de duas etapas. Em primeiro lugar, o padrão de iluminação tem de ser determinado paracada imagem e em segundo lugar, os componentes do espectro SIM deve ser separada e recombinadas de forma adequada como para dobrar o suporte OTF eficaz (ver Figura 6, inserções).

O conhecimento preciso dos padrões de iluminação projectados é primordial, como os componentes de frequência super-resolvido tem que ser não misturados com a maior precisão possível para evitar artefactos causados ​​por as partes residuais de componentes sobrepostos. Nós determinamos o padrão de iluminação parâmetros a posteriori a partir dos dados de imagem em bruto seguindo o procedimento introduzido por Gustafsson et al. ²³ Em suma, um conjunto de parâmetros de iluminação que descreve uma senóide bidimensional normalizada tem de ser encontrado para cada um dos padrões de excitação :

por este meio e descrever o contraste da franja e do padrão na fase inicial de cada imagem individual m respectivamente. Os componentes do vector de onda, e , Só mudam com orientações diferentes do padrão e pode ser assumida em contrário constante. Para determinar grosseiramente as componentes do vector de onda uma correlação cruzada dos espectros de imagem em bruto é realizada, o que é refinada através da aplicação de deslocamentos subpixel a uma das imagens interligado a optimizar a sobreposição. Isto é feito através de multiplicação de espaço-Real gradientes de fase que induzem uma mudança subpixel na frefre--espaço. Note-se que é útil ter uma boa estimativa da onda-vectores antes da estimativa real padrão e esta pode ser encontrada por imagiologia de uma camada de cordão fluorescente.

Como o passo de fase entre os padrões é deslocado , Ou seja. , A separação de componentes de frequência pode ser realizada por uma transformada de Fourier ao longo do eixo "fase". A fase mundial e o contraste franja pode então ser determinada usando regressão linear complexa de diferentes componentes. Os componentes individuais separadas são então combinadas através de um filtro de Wiener generalizado. Para uma descrição detalhada de ambos extração de parâmetros e implementação do filtro de Wiener generalizado nos referimos o leitor a Gustafssonet al. ^23, onde o mesmo algoritmo é utilizado.

Protocolo

1. Organização e Alinhamento do Caminho de Excitação

1. Marcar as posições dos componentes da mesa óptica (veja a Figura 1 para uma visão geral da configuração óptica). Separa-se o objectivo, as lentes de L3, L4, L5, e SLM cada por a soma dos seus respectivos comprimentos focais de tal forma que a superfície da SLM será retransmitida para o plano focal da objectiva.
2. Insira multi-edge espelho dicróico DM4 para a torre cubo de filtro do corpo do microscópio.
3. Insira o segundo DM3 espelho dicróico em um "espelho cinética 1 quadrado montar e posicionar-se uma distância focal de distância da lente condensadora L5.
   Nota: Este projeto caminho de excitação incorpora dois dicróicas idêntica espelha DM3 e DM4 que são tomadas a partir do mesmo lote de produção para garantir propriedades ópticas idênticas. O espelho dicróico (DM4) está posicionado de tal modo que os eixos S- e P- são comutados em comparação com o dicróico localizado no microscópio (DM3) cancelando assim qualquerelipticidade polarização introduzida pelo seu birrefringência (Figura 1). Esta compensação funciona igualmente bem para cada comprimento de onda de iluminação. Este passo é essencial para manter alto contraste de modulação.
4. Antes de inserir lentes para o caminho de excitação, definir com precisão o eixo óptico para o sistema.
   1. Remover a lente objectiva (OB) da torreta e, em vez do parafuso em uma ferramenta de alinhamento. Esta consiste de um sistema de gaiola de comprimento óptico 500 milímetros com dois discos de alinhamento em ambas as extremidades.
   2. Utilizar a DM3 espelho dicróico e um espelho de alinhamento temporária posicionado no local mais tarde aproximada da SLM para dirigir um feixe de referência a partir do laser colimado 1 através do centro dos furos nos dois discos de alinhamento. Dirigir o feixe de laser 1 para o espelho temporária, tal como representado na Figura 1 por meio de três espelhos e espelho dicróico DM2. O espelho temporária na posição SLM deve ser perto de perpendicular ao eixo óptico.
      Nota: O uso de laser 1, como o feixe de referência, tal como os outros lasers podem ser alinhados, subsequentemente, uma vez que o percurso de excitação está no lugar.
   3. Remover a ferramenta de alinhamento uma vez que o eixo óptico grosso tem sido determined.Insert uma íris no caminho do feixe antes da sua entrada no corpo microscopia e centrá-la no feixe. Anexar um pedaço de cartão branco com um pequeno furo centrado no iris.Reinsert a lente objetiva (OB).
      Nota: O feixe sair do objectivo será agora altamente divergente, mas haverá uma reflexão muito fraco a partir da superfície traseira da lente que será visível no cartão branco. Todas as lentes, mesmo se eles são anti-reflexão revestido, terá fracas reflexões para trás que podem ser utilizados para garantir o alinhamento coaxial. Se o feixe é exactamente perpendicular à lente, em seguida, a reflexão de volta irá voltar através do centro da íris
   4. Fazer ajustes iterativos angulares para os dois espelhos (DM3 e espelho de alinhamento na posição SLM) para centrar a reflexão de volta noo cartão com o feixe de entrada. Temporariamente remover a lente objetiva (OB) e marcar o ponto de laser no teto para criar uma posição de referência.
   5. Inserir um par de íris à altura do feixe de referência ao longo dos furos roscados da tabela. O raio deve ser paralela à superfície da mesa óptica. O eixo óptico é agora definido.
5. Insira a lente condensadora (L5) cerca de um comprimento focal longe do objectivo. Montar este lente sobre um conjunto estágio de translação linear a translação ao longo da direcção do feixe de referência.
6. Ajustar a posição da lente condensador e ângulo de tal modo que o feixe de deixar o objectivo é colimado e atinge o ponto de referência no teto. Verifique se a lente é perpendicular ao feixe de novo verificar a reflexão de volta com a íris e cartão branco. Retire a lente objetiva (OB) e inserir a segunda lente do telescópio de retransmissão de imagem (L4).
   Nota: Garantir a colimação adequada e não-deflexão do serAM é facilitada quando existe um número par de lentes no caminho do feixe.
7. Ajuste a posição eo ângulo dessa lente usando uma fase de tradução linear para manter collimation e assegurar o feixe de referência ainda atinge o ponto marcado no teto.
8. Substituir a lente objetiva (OB) e insira a primeira lente do telescópio (L3). Ajustar a posição e o ângulo desta lente para assegurar colimação e não deflexão, como descrito nos passos anteriores.
9. Montar o chip SLM em um cardan de montagem que fornece rotação sem tradução em torno do centro da superfície do chip.
   Nota: O desenho de montagem específica depende da SLM utilizado. Se o SLM é fornecido sem uma montagem, que deve ser fixo a uma chapa de alumínio personalizado maquinadas, que é então ligado a uma lente de montagem cardan.
10. Com as lentes alinhadas, inserir o SLM no lugar do espelho. Ajustar a posição da SLM de tal modo que o feixe de referência situa-se no centro do chip SLM, e ajustar o umGLE de tal modo que o feixe passa através das duas lentes de retransmissão (L3 e L4). Verificar que o feixe de referência ainda está centrada no local marcado.
11. Expandir e colimar o feixe de referência usando um expansor de feixe de Kepler.
    1. Montar as duas lentes (L1 e L2) em um sistema de gaiola para facilidade de ajuste.
    2. Centro do sistema de gaiola no feixe de referência, removendo as lentes e substituí-los com as íris.
    3. Insira as duas lentes e ajustar a posição axial L2 para colimar o feixe expandido usando um interferômetro de corte. L2 deverá ser uma distância focal longe da superfície da SLM.
    4. Verifique se o feixe expandido ainda é colimada após as duas lentes de retransmissão L3 e L4. Use o interferômetro de corte logo após DM3 para verificar se há collimation.
12. Uma vez que o percurso de excitação ter sido alinhada para um único comprimento de onda, os outros pares dois lasers para o caminho do feixe. Steer cada feixe através de duas íris centradas no caminho de excitação usandoo feixe combinando espelhos dicróicos (DM1 e DM2).

2. Alinhamento da Polarização Rotator

1. Montar o LCVR com o seu eixo rápido a 45 ° com a polarização incidente.
2. ângulo de sintonia fina polarização do feixe incidente ao LCVR usando uma placa de meia onda acromático (HWP), inserindo o HWP e LCVR entre polarizadores cruzados. Gire o HWP para minimizar a potência transmitida.
   Nota: A fim de actuar como um rotador polarização variável, o eixo rápido de o retardador de cristal líquido (LCVR) deve ser precisamente alinhado em 45 ° para o feixe incidente de polarização vertical. O LCVR está fisicamente montada a 45 °, mas isto é apenas uma aproximação grosseira. A HWP é usado para assegurar o alinhamento perfeito de 45 ° da polarização incidente em relação ao eixo rápido LCVR. A placa de quarto de onda (QWP) converte a polarização elíptico inclinado induzida pela LCVR de volta para a polarização linear em um ângulo controlado pela tensão aplicada^24.
3. Insira o QWP após a LCVR e gire-a para alinhar o seu eixo lento para a polarização de entrada, minimizando a potência transmitida entre polarizadores cruzados.

3. Alinhamento do Caminho Emission

1. Grosseiramente posicionar a câmera usando um micrómetro e luz transmitida.
   1. Concentre-se no retículo usando as oculares de microscópio e fixar a lente objetiva nesta posição.
   2. Cerca de centralizar a câmera e mover a posição da câmera para trazer a imagem do retículo em foco observando a imagem na tela.
      Nota: Se uma roda de filtro externo é utilizado em seguida, o cubo de filtro não irá conter um filtro de emissão, por conseguinte, as oculares não deve ser usado quando os lasers estão ligados.
2. Finamente ajustar a posição da câmera usando uma amostra talão fluorescente.
   1. Prepare uma monocamada de partículas fluorescentes por espalhar uma gota de 100 esferas multicolor nm em uma lamela # 1.5. Deixar para dry para adsorver as contas para a lamela e então re-mergulhe em água.
   2. Colocar a amostra talão para o objectivo com óleo de imersão. Finamente ajustar a posição da câmara de tal modo que a camada de cordão fluorescente está em foco. Não ajustar a posição da lente objetiva uma vez o foco foi encontrado.
      Observação: Uma vez que o SLM deve estar num plano conjugado ao plano da amostra, a posição da SLM, retransmitir lentes, e objectivo deve ser fixo. Para ajustar o foco, mova a amostra de modo axial em vez do objectivo usando um piezo z-stage.
3. Gerar os padrões de grade apropriados SIM binários como arquivos de bitmap.
   1. Para 2D / TIRF-SIM, gerar uma série de 9 imagens ralar binários: Orientações 3 padrão, cada um com 3 mudanças de fase igualmente espaçados. Gerar esses numericamente (usando MATLAB por exemplo) a partir de uma sinusóide 2D girado com um desvio de fase aplicada, em seguida, limiarizar para produzir uma imagem binária. Veja Suplementar arquivos de código para o exemplo de código.
   2. para alignmenfins t, também gerar padrões de grelha que foram windowed por uma pequena abertura circular para cada um dos 3 orientações, conforme mostrado na Figura 2. As grelhas de alinhamento janeladas não precisa de ser disparado externamente, mas pode ser comutado manualmente pelo utilizador através do software do SLM.
      Nota: Veja as referências para uma discussão sobre os ângulos de rotação ideal e um exemplo de grade de padrão de código de geração de ^16,20.
4. Carregar as imagens bitmap para o SLM usando o software do fabricante (por exemplo MetroCon).
   1. Carregue o software de controle de SLM e clique em "Conectar".
   2. Na aba "Repertório", clique em "Load" para abrir o arquivo repertório e verificar o número de Correr ordens contidas no arquivo. No arquivo de exemplo repertório dado há cinco ordens em execução.
   3. Clique em "Enviar para o Conselho de Administração" para carregar o arquivo repertório do SLM.
   4. Aguarde até que as imagens bitmap para carregar umnd para o dispositivo seja reiniciado automaticamente.
      Nota: Um arquivo repertório exemplo, que contém imagens bitmap ralar e um arquivo que define a ordem, é incluído como um arquivo de código suplementar. O arquivo ".repz" podem ser abertas usando software compactador de arquivos ZIP.
5. Exibir um alinhamento com janelas ralar na SLM para a primeira orientação (por exemplo 0 °).
   1. No software de controle SLM, selecione a guia "Status", digite o número da ordem de marcha (no caso de o arquivo de exemplo, isso é Spelordning "1").
   2. Clique em "Selecionar" para alterar a ordem de marcha para a grade de alinhamento.
      Nota: Isto irá iluminar uma pequena região circular no plano da amostra. Se a superfície da SLM é correctamente conjugados com o plano da amostra, em seguida, as extremidades desta região será acentuadamente em foco. O padrão de grade irá produzir várias ordens de difração no foco do L3: o reflexo de ordem zero do backplane reflexo daSLM, a -1 e +1 ordens correspondentes à grelha, e ordens mais elevadas também mais fracos que surgem a partir de difracção de elementos internos específicos para o dispositivo SLM (por ex. A fiação de reflexões internas dos pixels e as irregularidades nos bordos SLM pixel) . Todos mas os -1 e +1 pedidos devem ser filtrados.
6. Inserir uma máscara espacial (SM) montado em um X, Y fase no caminho do feixe na posição focal do L3, e traduzir a sua posição com respeito ao eixo óptico de modo a que apenas os primeiros pedidos desejados são transmitidos. Directamente após o filtro espacial, apenas duas vigas circulares será visível.
   Nota: A máscara espacial é fabricado por perfuração 6 furos em folha de alumínio usando uma agulha. Os furos devem ser grandes o suficiente para passar os primeiros feixes de ordem para todos os comprimentos de onda do laser. Uma análise detalhada da máscara espacial são apresentadas na referência ^20.
7. Mostrar a próxima orientação da grade de alinhamento (60 °, correndo ordem 2) e novamenteassegurar que apenas os primeiros pedidos são deixe através da máscara espacial, ajustando a sua posição, se necessário.
8. Repita o procedimento para a orientação final (120 °, correndo ordem 3).
9. Verifique a imagem da camada de cordão fluorescente na câmara. Se os dois feixes circulares não são de sobreposição, como representado na Figura 2, em seguida, reposicionar o plano da amostra por forma iterativa o ajuste da posição da lente da objectiva e da câmara.
10. Ajuste a posição objetiva para sobrepor os dois feixes que trará a imagem fora de foco. Reposicionar a câmera para trazer a imagem de volta ao foco e afinar o objectivo no caso dois círculos ainda são visíveis. Repita este processo até que as duas vigas se sobrepõem e uma única região circular está em foco.
11. Uma vez que a posição do plano da amostra foi definido, manter a posição objectivo fixado.
12. Para confirmar iluminação TIRF, imagem de uma solução corante fluorescente, por exemplo, para um comprimento de onda de excitação 488 nm, usar uma solução de 1081; M rodamina 6G.
    1. Levar a amostra de corante em foco. Se os dois feixes são incidente no ângulo correcto TIRF, em seguida, as moléculas individuais serão visíveis sem fundo elevado, e os bordos da abertura circular estará em foco. Veja a Figura 2B-D para exemplos de vigas TIRF alinhados e desalinhados.
    2. Apresentar cada orientação das grades janeladas por sua vez, e assegurar que todas as três orientações de fornecer iluminação TIRF e que os dois feixes se sobreponham no plano da amostra. Ajuste fino à posição das vigas pode ser feita ajustando espelho dicróico DM3.
       Nota: Embora diferentes comprimentos de onda são focados em posições ligeiramente diferentes devido a aberração cromática axial, isto não é crítico e pode ser corrigido através da aplicação de uma constante Z-deslocamento para a posição da amostra antes da excitação com o segundo comprimento de onda.

4. Sistema de sincronização e Calibração

1. Colocar o grânulo monocamada samplo sobre o objectivo e trazer em foco.
2. Programar o SLM utilizando o seu software de controle para exibir cada uma das imagens de deslocamento 3 de fase, por sua vez, para a primeira orientação padrão (0 °).
   1. Usando o software de controle de SLM, mude para Spelordning 4 do exemplo repertório.
   2. Configurar a câmera utilizando o seu software de aquisição (por exemplo HCImage) para a saída de dois sinais: um positivo e um sinal TTL gatilho negativo durante o período de exposição global. No software da câmera, em "Câmera Propriedades Avançadas", definir saída de disparo de tipo 1 e 2 para "Exposição", e saída de disparo Polaridade 1 e 2 para "positivo" e "negativo", respectivamente.
   3. Ligue a saída 1 e 2 da câmera para o "Trigger" e entradas em "Finish" da SLM respectivamente, utilizando cabos coaxiais. O SLM é agora sincronizado com a câmera.
3. Adquirir uma série de 3 imagens.
   1. No painel "Sequence", selecione &# 34; Hard Disk Record "como o tipo de digitalização e defina a contagem de quadros a 3.
   2. Clique em "Iniciar" para adquirir 3 quadros. O padrão SLM vai mudar a cada exposição. As contas fluorescentes na imagem aparecerá a piscar on e off entre cada uma das 3 imagens. A quantidade de um piscar é lida a partir do contraste de modulação do padrão de iluminação sinusoidal.
4. Rodar a polarização do laser de excitação com a LCVR usando software personalizado, a fim de alcançar polarização azimutal e, por conseguinte, o maior contraste de modulação para a orientação dada padrão.
   1. Carregue o software de calibração LCVR.
   2. Digite 0 e 8, para o mínimo eo máximo de tensão, respectivamente.
   3. Clique em "Varrer LCVR Voltage" para rodar a polarização.
      Nota: A retardância LCVR é uma função da temperatura e pode derivar do dia-a-dia, mesmo com controlo de temperatura. Neste passo, a polarização azimutal óptima é encontrada empiricamente por Sweeping a tensão aplicada entre a tensão máxima e mínima que tem o efeito de rodar a polarização incidente na amostra. O contraste de modulação é calculada para cada tensão ²⁵ e a tensão que atinge contraste de pico é utilizado nos passos seguintes.
   4. Aguarde o processo de calibração para ser concluída, e anote a tensão medida.
5. Repita este processo de calibração para os restantes duas orientações padrão (60 ° e 120 °) e cada um dos comprimentos de onda de excitação.
6. Sincronizar a exposição da câmera com a LCVR, lasers, roda de filtros de emissão e piezo z-stage ^26. Para realizar isto, utilizar uma placa de aquisição de dados de alta velocidade (DAQ) como a fonte do relógio mestre para o sistema, e o uso do SLM LED sinal de Permitir a saída para modular os lasers (ver Figura 3B).
   Nota: A aplicação específica depende dos componentes utilizados, mas a utilização de uma placa de aquisição de dados de alta velocidade para tri digitaisgger sincronização e controlo do LCVR usando uma tensão analógica, controlado por software, é recomendado. O software de controle utilizado neste protocolo está disponível mediante solicitação.
7. Devido a aberração cromática axial, para cada comprimento de onda, também se aplicam a z-deslocamento para o estágio da amostra.
   1. Determinar o deslocamento experimentalmente, concentrando-se em uma amostra monocamada multicolor talão no primeiro comprimento de onda (por exemplo. 488 nm), em seguida, mudar para a segunda (ex. 640 nm). As contas agora será fora de foco.
   2. Reorientar as contas e medir a mudança de posição z que era necessário. Este deslocamento pode então ser aplicada ao piezo-Z estágio cada vez que o comprimento de onda de excitação é alterada.
8. Usando o software de controle de SLM, mude a ordem de marcha SLM à série completa de 9 imagens ralar binários necessários para TIRF-SIM. Este é Spelordning 0 no exemplo repertório.
9. Usando o software de controle de câmera, adquirem 9 imagens da amostra talão.
   1. No painel "Sequence" do software da câmera, selecione "Hard Disk Record" como o tipo de digitalização e alterar a contagem de quadros a 9.
   2. Clique em "Iniciar" para adquirir imagens.
   3. Salve as imagens adquiridas como arquivos TIFF, selecionando "TIFF" como o tipo de imagem no "Save Buffered imagens" janela e clique em OK.
10. Reconstruir uma imagem de super-resolução das imagens TIFF matérias-usando software comercial ou personalizado para validar a melhoria da resolução sobre TIRF padrão.
    Nota: Para o nosso microscópio que usar o código de reconstrução personalizado desenvolvido tanto em casa e pelo Dr. Lin Shao ^27.

Resultados

Multicolor diâmetro 100 nm partículas fluorescentes foram fotografadas para comparar TIRF padrão para TIRF-SIM e quantificar a melhoria atingível na resolução lateral (Figura 4A - B). Reconstrução de quadros de matérias em imagens de super-resolução foi realizada utilizando algoritmos padrão conforme descrito na literatura ^27,28. Pode ser visto que TIRF-SIM tem, significativamente mais elevado em comparação com resolução lateral TIRF. A função de dispersão (PSF) de um microscópio é bem aproximada pela imagem de um único sub-cordão de difracção fluorescente tamanho, por conseguinte, a PSF e a resolução pode ser quantificada por encaixe funções gaussianas 2D a esferas individuais para cada comprimento de onda. A resolução do microscópio estimada com base no valor médio da metade do valor máximo largura total (FWHM) é de 89 nm e 116 nm para 488 nm e 640 TIRF-SIM, respectivamente (Figura 4C). Isto corresponde a uma de duas vezes Improvimento na resolução lateral para ambos os comprimentos de onda em comparação com o caso limitada de difração teórica. Fibrilas amilóides fluorescente etiquetado também são uma amostra de teste excelente para demonstrar resolução duplicou (Figura 4D). Fibrilas amilóides foram formados in vitro por incubação de β-amilóide marcado com 10% de corantes derivados de rodamina (excitação a 488 nm) durante 1 semana e, posteriormente, de imagem com TIRF-SIM. Ver a referência ¹² para obter mais informações.

Estruturas subcelulares com alto contraste, como emGFP marcado microtúbulos (Figura 5B, G) ou LifeAct-GFP (Figura 5D) são ideais para geração de imagens TIRF-SIM e produzir imagens de super-resolução de alto contraste. imagiologia TIRF-SIM, utilizando a configuração pormenorizada no presente protocolo permite a observação de uma sub-população de microtúbulos localizados na vizinhança do córtex das células basais, e a polimerização de microtúbulos e despolimerização pode be visto ao longo do tempo (animadas Figura 1). Nem todas as amostras são passíveis de imagem com TIRF-SIM, em particular amostras, de baixo contraste sem estruturas discretas. As células que expressam GFP citosólica falta de informação de alta resolução, além de nas bordas da membrana plasmática (Figura 5F, H e Animated Figura 2) e são, portanto, abaixo do ideal para imagens TIRF-SIM, como as reconstruções resultantes são imagens essencialmente TIRF cobertas com artefatos. Em tais amostras, o aumento em contraste pode muitas vezes ser atribuída à etapa de desconvolução do algoritmo de reconstrução.

alto contraste de modulação é essencial para a imagem latente SIM sucesso. A transformada de Fourier da imagem reconstruída permite a visualização da função de transferência óptica SIM (OTF) (Figura 6A, inserção). Sem maximizar o contraste de modulação para cada orientação azimutal polar, assegurandozação com um rotador de polarização, há muito pouca modulação da informação de alta resolução na amostra que conduz a uma baixa relação de sinal-para-ruído nas bandas de passagem do SIM. Algoritmos de reconstrução que utilizam a abordagem filtro de Wiener padrão simplesmente amplificam o ruído nas faixas de passagem SIM e produzir uma imagem que é essencialmente uma imagem TIRF padrão coberta com hexagonal (ou "favo de mel") tocando artefatos (Figura 6A, painel da direita). Um aperfeiçoamento possível poderia ser a utilização de iterativos ^29,30 ou ^31,32 cegos algoritmos de reconstrução para reduzir estes artefactos, dependendo do tipo de amostra. Recomendamos o uso do plug-in ImageJ SIMCHECK para verificar a qualidade dos dados SIM antes e após a reconstrução ^33.

Figura 1:. Estrutura do Setup Multicolor TIRF-SIM O TIRF-SIM microscope consiste em três partes principais, a unidade de gerao de feixe, a unidade padrão de projecção, e a unidade de detecção. Na unidade de geração de feixe, três lasers diferentes estão alinhados no mesmo caminho do feixe através de espelhos dicróicos (DM1 e DM2) e dirigido por quatro elementos ópticos para controle de polarização. Em primeiro lugar, um polarizador (P) assegura a pureza do estado de polarização linear de cada um dos feixes de laser. Os três elementos ópticos que se seguem são necessários para rodar a polarização de um modo rápido, automatizado, como descrito em detalhe no texto. Posteriormente, duas lentes (L1 e L2) em uma configuração telescópio expandir o feixe para coincidir com a superfície activa do modulador de luz espacial (SLM) e são difractada em três beamlets por projectadas padrões de grelha binários do SLM (exemplos são mostrados nas telhas 1- 9). O estado de polarização da luz de iluminação em relação ao padrão SLM é mostrado como uma seta. Um segundo telescópio (L3 e L4) de-amplia o padrão e oferece acesso a thplano E de Fourier do padrão SLM. Neste plano de uma máscara espacial (SM) é usado para filtrar o componente central e outros componentes indesejados de difracção da estrutura pixelizada do SLM e a sua cablagem interna. Antes que os dois feixes restantes são focados para o plano focal posterior da objectiva (OB), através da lente condensadora (L5), dois espelhos dicróicos (DM3 e DM4) estão incluídos na configuração. DM4 actua como um espelho dicróico convencional em microscopia de fluorescência para iluminação separada da luz de emissão. No entanto, este espelho inevitavelmente induz elipticidade no estado de polarização da luz de iluminação, que pode ser compensada por DM3, um espelho dicróico de preferência do mesmo lote DM4. A imersão em óleo TIRF objectivo tem uma grande NA suficiente para lançar diretamente duas ondas contra-propagação para a lamela que se refletem totalmente e dar origem a um campo evanescente estruturado na lamela. A amostra é montada sobre um estágio de translação xyz. A detecção é perfORMED através do mesmo DM4 objetiva e na transmissão, além de um adicional de filtragem por filtros de emissão de banda, montado em uma roda de filtro controlado por computador (PFE). Finalmente, a imagem é projetada em uma câmera scmos pela lente tubo de microscópio interna (L6). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2:. Alinhamento de sobreposição de Vigas (A) Um padrão de grade SLM janelas com uma abertura circular é útil para o alinhamento. Se dois feixes não sobrepostos são visíveis na câmara (esquerdo), em seguida, a posição do plano da amostra tem de ser reposicionada ajustando iterativamente as posições axiais da lente objectiva e a câmara para dar um único ponto de iluminação circular (direita). As vigas devem se sobrepor em order para produzir o padrão de excitação sinusoidal necessário para TIRF-SIM. Se as vigas não se sobrepõem totalmente esta reduz o campo de visão sobre o qual o padrão de interferência é formado. (B e C) O ângulo preciso de incidência dos feixes é importante para TIRF-SIM. Se o ângulo for incorrecta, um dos feixes não será no ângulo necessário para TIRF e esta é facilmente visível quando a imagem de um solução de corante fluorescente. Um feixe tem um ângulo de incidência maior do que o ângulo crítico que produz o local circular, e o outro não, o que leva à faixa brilhante no lado esquerdo da imagem em (B). (D) ajustar o ângulo do espelho DM3 assegura ambos os feixes estão incidente no mesmo ângulo, e este pode ser validado por desfocagem do objectivo: se estiver correctamente alinhado, a projecção XZ de uma pilha de Z de uma amostra de corante fluorescente deve mostrar duas simetricamente intersectando vigas com fundo insignificante naconcentrar. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3:. Sincronização dependências dos diferentes componentes do sistema (A) para aquisição SIM rápido, a sincronização dos componentes do sistema usando uma solução baseada em hardware é essencial. (B) uma placa de aquisição de dados (DAQ) deve ser utilizada como um gatilho mestre. Um sinal TTL a partir da placa DAQ é enviado para a entrada externa scmos e usadas para desencadear a exposição da câmara. A câmara de saída de exposição global, em seguida, acciona o SLM para exibir um padrão de grelha, e SLM LED Activar saída é utilizada para modular digitalmente o laser de excitação de tal modo que o laser só é emissores quando os pixels são SLM no estado "ligado". Após a exposição está complete, a câmara de saída Exposição Global é usado para fazer avançar o padrão de SLM para a próxima fase reticulada ou ângulo. A placa DAQ também gera uma tensão analógica para o controlador de LCVR para controlar o estado de polarização linear do feixe de iluminação. Esta voltagem é ligada após a aquisição das imagens de fase 3 para cada ângulo do padrão. Após a aquisição de 9 imagens para um único comprimento de onda, a placa DAQ emite um sinal para o controlador de roda de filtros de emissão, e muda para o próximo comprimento de onda. A placa DAQ também se aplica a-z deslocamento para a amostra emitindo uma tensão analógica para o controlador z-stage piezo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: TIRF-SIM de imagem de amostras de 100 nm Multicolor grânulos e fluorescência Labelled amilóide fibrilas. (A e B) Comparação de TIRF padrão em comparação com reconstruções TIRF-SIM para 488 nm e 640 nm de excitação. (C) Histograma de meia-máxima de largura total (FWHM) de Gaussian cabe às esferas TIRF-SIM que mostram a melhoria resolução esperada. (D) TIRF contra TIRF-SIM de fibrilas de p-amilóides marcadas com rodamina 10% de corante derivado (excitação a 488 nm). Barras de escala = 1 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5:. TIRF-SIM células vivas Comparação da TIRF convencional e TIRF-SIM de imagens (A), B microtúbulos (emGFP-tubulina) em uma célula HEK293, (C, D ) actina filamentosa (LifeAct-GFP) em uma célula COS-7 e (E, F) de GFP citosólica de uma célula HEK293. Imagens em B e F são momentos isolados dos filmes. Áreas em caixa são mostrados ampliada em (G, H). Barras de escala = 3 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6:. Influência de polarização Rotator em reconstruída Bead Imagens (A), sem a utilização de um rotor de polarização, tal como um LCVR, a relação sinal-para-ruído nas bandas de passagem SIM é baixa, o que resulta em artefactos hexagonais característicos no SIM reconstruída imagens (direita), (B) em 2D-SIM, os padrões de iluminação estruturados são diretamente visíveis na Fouriertransformar as imagens em bruto (esquerda, freqüência espacial de excitação realçado) como caem dentro do raio do apoio OTF emissão, no entanto, em TIRF-SIM, eles estão fora do suporte OTF e, portanto, não visível (à direita). Neste caso, o contraste de modulação padrão deve ser avaliada através de uma monocamada talão escassa, conforme descrito no protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7:. Spatial Luz modulador baseado Pattern Generation permite a implementação de outras modalidades de imagem, como Multifocal SIM (A) Em MSIM, um reticulado de quadrados pointsdisplayed na SLM (inserção) produz uma rede de difracção de focos limitados no plano da imagem. Uma fina camada de baixa concentração rodamina 6G é imaginada para visua Lize os focos. O padrão é traduzido através da amostra (B) e a imagem crua z-stack adquirida é reconstruído para gerar uma imagem com reduzida fora-de-foco de luz (C). Barras de escala = 5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Animated Figura 1:. Time Series Filme de EmGFP-tubulina em uma célula HEK293 rápida polimerização e despolimerização de emGFP marcado microtúbulos pode ser observado usando TIRF-SIM. Imagens obtidas utilizando 50 ms de tempo de exposição por quadro cru (450 ms por fotograma SIM) espaçados em intervalos de 0,5 seg. O tempo de exposição utilizado foi limitada pela luminosidade do fluoróforo, não por a velocidade da máquina ou SLM. 3988movie1.mov "target =" _ blank "> Clique aqui para ver este vídeo.

Animated Figura 2:. Time Series Filme de citosólico GFP em uma célula HEK293 As amostras com baixo contraste como este não são amostras ideal para imagens TIRF-SIM. fluxo retrógrado membrana pode ser visto nas imagens TIRF mas não TIRF-SIM não fornece qualquer informação adicional para além de nas bordas das células. Imagens TIRF-SIM foram adquiridos utilizando 50 ms tempo de exposição por quadro cru (450 ms por fotograma SIM) em intervalos de 5 segundos. Por favor clique aqui para ver este vídeo.

Suplementar arquivo de código: file repertório Exemplo SLM (48449_300us_1-bit_Balanced.seq3).d / 53988 / 48449_300us_1-bit_Balanced.seq3 "> Por favor, clique aqui para fazer o download deste arquivo.

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Suplementar arquivo de código:. Arquivo repertório Exemplo SLM (TIRF-SIM_example.rep) Por favor, clique aqui para fazer o download deste arquivo.

Suplementar arquivo de código:. Exemplo código de geração grade (1 de 2) (generate_gratings.m) Por favor, clique aqui para fazer o download deste arquivo.

Suplementar arquivo de código: Exemplo de código ralar geração (2 de 2) (circular_mask.m).= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53988/circular_mask.m"> Por favor, clique aqui para fazer o download deste arquivo.

Suplementar arquivo de código:. O código de exemplo para calcular o contraste de modulação (calculate_contrast.m) Por favor, clique aqui para fazer o download deste arquivo.

Discussão

sistemas Custom-Built TIRF-SIM, tais como a configuração detalhado neste protocolo são capazes de imagem de super-resolução multicolor em alta velocidade em comparação com microscópios comercialmente disponíveis. A vantagem inerente de SIM, como uma técnica de super-resolução é que a resolução temporal não é limitada pelos fotofísica do fluoróforo, em comparação com outros métodos tais como microscopia de molécula única localização (SMLM) ou métodos de verificação de pontos, tais como microscopia de depleção de emissão estimulada ( STED). Ao contrário dessas outras técnicas, SIM não requer fluoróforos foto induzida ou esgotáveis ​​modo imagem multicolor é simples. sistemas TIRF-SIM não, tais como a óptica de seccionamento SIM e multifocal SIM geralmente pode conseguir melhorar a resolução de 1,7 vezes ou menos, na prática, ao contrário do factor de 2 a melhoria aqui relatado, e sistemas comerciais são também muitas vezes mais lenta e menos flexível do que o sistema apresentado neste protocolo.

"> As duas principais dificuldades na aplicação desta técnica são, em primeiro lugar a necessidade de posicionamento preciso das seis vigas SIM dentro da zona TIR de abertura costas do objetivo, que requer um tempo trabalhoso e demorado procedimento de alinhamento óptico. Em segundo lugar, para produzir alto contraste padrão na amostra, a rotação de polarização é essencial. para sistemas de baixa nA 2D-SIM, rotação de polarização pode ser evitado pela escolha cuidadosa da orientação de polarização linear, mas isso torna-se impossível para TIRF ^SIM-25. para imagem multicolor de alta velocidade, eletro- controle de polarização óptica é necessário e isso aumenta a complexidade e o custo do sistema.

Limitações da técnica

TIRF-SIM, como TIRF convencional, é, naturalmente, limitada a observação de estruturas e processos localizados na membrana celular basal, que pode ser iluminada por a profundidade de penetração de 150-200 nm do campo evanescente biológicos. EnquantoSIM é frequentemente citado como sendo menos photodamaging de células do que qualquer um ou STED SMLM, duplicação resolução lateral ainda faz aumentar o número necessário de fótons por, pelo menos, 4 vezes em comparação com ⁵ TIRF microscopia convencional. Para geração de imagens em altas taxas de quadros com tempos de exposições curtas, este aumento de fótons exige uso de aumento da intensidade de iluminação. Embora qualquer fluoróforo pode ser usado para geração de imagens de amostras SIM móveis fixos ou lentos, proteínas fluorescentes de alto brilho ou próxima geração de corantes sintéticos com fotoestabilidade melhorada são recomendados para imagens de células vivas.

Embora esta aplicação é capaz de imagiologia de uma única cor em taxas de quadros SIM em excesso de 20 Hz, a imagem multicolor no sistema apresentado é limitada pelo tempo de comutação do filtro de emissão de roda motorizada. Devido ao grande tamanho do chip câmara scmos, o uso de um filtro de emissão de banda múltipla e separadoras de imagem óptica seria possível e permitir i simultâneamaging com múltiplos comprimentos de onda, sem qualquer penalidade na velocidade. Outra possibilidade seria a alternância das diferentes lasers de excitação e usar um filtro de entalhe de banda múltipla para rejeitar a luz de excitação. O uso de um SLM ferroeléctrica binário nesta aplicação também não é óptima. A eficiência de difracção de tal SLM é muito baixo, então a maior parte da luz incidente é no reflexo de ordem zero, que é filtrado para fora por a máscara espacial. Para aplicações que exigem muito altas taxas de quadros, a velocidade de imagem é, portanto, limitada pelo poder dos diodos de laser de saída. O SLM também introduz algumas elipticidade na polarização para comprimentos de onda de distância do comprimento de onda de 550 nm projeto onde os pixels não funcionam placas meia onda como ideais. Embora isso poderia ser compensado através da utilização de uma LCVR adicional, a solução ideal pode ser o uso de um dispositivo de micro-espelho digitais (DMD) como um gerador de padrão.

possíveis modificações

O prese configuraçãonted aqui é flexível e mais facilmente modificado do que os instrumentos comerciais para que outras modalidades de imagem, tais como 3D-SIM, rápida 2D-SIM, SIM multifocal (MSIM) e SIM não-linear (NL-SIM) podem ser implementadas ^21,34,35.

2D-SIM pode ser bem adequado para imagiologia relativamente plana, move-se rapidamente estruturas, tais como o retículo endoplasmático periférica. O ER periférica é mais profundo dentro da célula que pode ser iluminado usando um campo evanescente TIRF, mas devido à sua estrutura plana pode ser fotografada usando padrão 2D-SIM com insignificante fundo fora de foco. Além disso, o uso de melhores algoritmos de reconstrução de corte ópticas para suprimir fora-de-foco de luz estender o uso do 2D-SIM para opticamente amostras de espessura, embora onde duplicação resolução axial não é necessária ^21.

Em MSIM, a amostra é iluminada por uma rede esparsa de excitação focos ^36. Esta modalidade pode ser implementado simplesmente removendo a máscara espacial (SM) E substituindo-o por um polarizador. O SLM agora funciona como um modulador de amplitude. As grelhas SIM binários exibidos na SLM pode ser substituído por uma estrutura de pontos em 2D, com o tamanho dos pontos escolhidos para ser igual ao tamanho de um foco de difracção limitada no plano de imagem. Na Figura 7A, uma estrutura de 4 x 4 quadrados do pixel é exibido na SLM (inset) que quando demagnified sobre a amostra gera focos de difracção limitada de 150 x 150 mm, tendo em conta o tamanho do pixel SLM física de 13,62 | im. Os focos de excitação pode ser então traduzida pela mudança do padrão da rede em SLM e isto é repetido várias vezes a fim de iluminar a totalidade do campo de visão. As imagens são adquiridas para cada posição do padrão traduzida e a pilha é pós-processados ​​para produzir uma imagem reconstruída com uma melhor resolução de até um fator de e reduziu fora-de-foco de luz em comparação com a imagem widefield equivalente30. Esta modalidade pode ser útil para imagiologia de amostras grossas, densos para os quais SIM padrão é inadequado, por exemplo, estruturas de baixo contraste, tais como os glóbulos vermelhos corados (Figura 7C), embora o tempo de aquisição é aumentada, devido ao grande número de quadros de matérias- requerido por campo de visão (neste caso n = 168).

Finalmente, a configuração pode ser modificada para permitir que seja alta-NA linear TIRF-SIM ou activação modelado não linear SIM (PA NL-SIM), tal como apresentado recentemente por Li et al., Através da utilização de uma 1,7 objectivo ou a adição de ultra NA de um laser de 405 nm fotoativação e otimização cuidadosa dos SLM padrões ralar ^35.

Aplicações futuras

SIM ainda é uma técnica rápida evolução e muitas aplicações nas ciências da vida será habilitado no futuro. A velocidade, resolução e melhorias de contraste da técnica e a capacidade de utilizar padrão fluor�oros mean que, para bioimaging, SIM está definido para substituir muitos sistemas de microscopia convencional, tais como plataformas de campo confocal e largas. sistemas SIM comerciais já estão disponíveis hoje, com especificações técnicas pendentes, no entanto, eles estão além do alcance financeiro de muitos laboratórios de pesquisa, e, crucialmente, eles são inflexíveis de ser modificado e desenvolvido para implementar as mais recentes desenvolvimentos da investigação no campo. Eles também não têm a capacidade essencial para 'ser adaptado para o experimento na mão', muitas vezes um gargalo crítico na corte pesquisa de ciências biológicas borda. O sistema descrito aqui será particularmente adequado para estudar processos dinâmicos perto da superfície da célula, para estudos in vitro de sistemas bicamada reconstituídos, para estudar a química de superfície nos materiais e ciências físicas, por exemplo. de materiais 2D, e muitas outras aplicações.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
488 nm laser	Toptica	iBeam SMART	with digital modulation
561 nm laser	Coherent	OBIS LS	with digital modulation
640 nm laser	Cobolt	MLD	with digital modulation
Long-pass dichroic mirrors	Thorlabs		for combining excitation beams
Quad band dichroic mirror	Chroma	ZT405/488/561/640rpc	3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube
Quad band dichroic mirror	Chroma	ZT405/488/561/640rpc	From same batch as above, 25 x 25 mm
1" square kinematic mount	Edmund Optics	58-860
Glan-Taylor calcite polarizers	Thorlabs	GT5-A	For alignment of LCVR
Glan-Taylor mount	Thorlabs	SM05PM5
Achromatic half wave plate	Thorlabs	AHWP05M-600	400-800 nm
Rotation cage mount	Thorlabs	CRM1/M	For HWP
Liquid Crystal Variable Retarder	Meadowlark Optics	SWIFT	Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm.
LCVR controller	Meadowlark Optics	D3060HV	Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders
Achromatic quarter wave plate	Meadowlark Optics	AQM-100-0545
Rotation cage mount	Thorlabs	CRM1P/M	For QWP
10 mm achromatic doublet	Thorlabs	AC080-010-A-ML	For beam expander
200 mm achromatic doublet	Thorlabs	AC254-200-A-ML	For beam expander
Cage XY Translators	Thorlabs	CXY1
Ferroelectric spatial light modulator	Forth Dimension Displays	M0787-00249	SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1,280 x 1,024 pixels, with driver board
SLM mounting frame	Forth Dimension Displays	M0787-10014	Fixed to custom built aluminium mount
Ø50.8 mm Gimbal Mirror Mount	Thorlabs	GM200/M	For SLM mounting
Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform	Thorlabs	XYR1/M	For SLM mounting
Rail carrier	Newport	M-PRC-3	For SLM mounting
Precision Optical Rail	Newport	PRL-6	For SLM mounting
300 mm achromatic doublet lens	Qioptiq	G322 273 322	f = 300 mm, 31.5 mm diameter
140 mm achromatic doublet lens	Qioptiq	G322 239 322	f = 140 mm, 31.5 mm diameter
Precision XY Translation Mounts	Thorlabs	LM2XY
Lens Mounting Adapters	Thorlabs	SM2AD32	For mounting 31.5 mm lenses in 2" mounts
Translation stages	Comar	12XT65	Dovetail, side drive
XY Translator with Differential Drives	Thorlabs	ST1XY-D/M	for spatial filter
Rotation cage mount	Thorlabs	CRM1/M	for spatial filter
300 mm achromatic doublet	Thorlabs	AC508-300-A-ML	Excitation tube lens
Automated XY stage with Z-piezo top plate	ASI	PZ-2150-XYFT-PZ-IX71	with MS-2000 controller
Inverted microscope frame	Olympus	IX-71
Objective lens	Olympus	UAPON100XOTIRF	100X/1.49NA
High speed filter wheel	Prior Scientific	HF110A	with Prior ProScan III controller
Bandpass emission filters	Semrock	FF01-525/30, FF01-676/29
sCMOS camera	Hamamatsu	ORCA Flash v4.0
Stage top incubator	OKO Lab	H301-K-FRAME	For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers
Stainless steel optical posts	Thorlabs	TR series	for mounting optical components
Post holders	Thorlabs	PH series	for mounting optical components
Kinematic mirror mounts	Thorlabs	KM100	for mounting 1" mirrors
Shearing interferometer	Thorlabs	SI100
100 nm fluorescent microspheres	Life Technologies	T-7279	Tetraspeck
Rhodamine 6G	Sigma Aldrich	83697-250MG
8 well glass bottom dishes	ibidi	80827	with #1.5 coverglass
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass	Thermo Fisher Scientific	155409	with #1.5 coverglass
0.01 mm microscope reticle slide	EMS	68039-22
CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher Scientific	C10613