Um Modelo de enzimas e Cultura de Células-Tronco Neural Serum-livre para EMT Investigation Adequado para Drug Discovery

Resumo

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.

Resumo

Epitelial para mesenquimal (EMT) descreve o processo de epitélio transdifferentiating em mesênquima. EMT é um processo fundamental durante o desenvolvimento embrionário que também ocorre frequentemente em glioblastoma, o tumor cerebral maligno mais frequente. EMT também tem sido observado em vários carcinomas fora do cérebro, incluindo o cancro da mama, cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro gástrico. EMT está centralmente ligada a malignidade por promoção da migração, invasão e formação de metástases. Os mecanismos de indução de EMT não são completamente compreendidos. Aqui, descrevemos um sistema in vitro para o isolamento padronizada de células estaminais neurais corticais (NCCC) e subsequente EMT-indução. Este sistema oferece a flexibilidade para usar tanto as células individuais ou cultura explante. Neste sistema, rato ou ratinho embrionárias NSC prosencéfalo são cultivadas num meio definido, isento de soro e enzimas. As NSC expressa Olig2 e SOX10, dois factores de transcrição observada em oligodendroccélulas precursoras yte (OPCs). Usando este sistema, as interacções entre FGF, BMP- e TGFp-sinalização envolvendo Zeb1, Zeb2, e Twist2 foram observados onde o TGFp-activação melhorado significativamente a migração de células, sugerindo um sinérgico / TGFp-interacção BMP-. Os resultados apontam para uma rede de FGF, BMP- e TGF-sinalização de estar envolvido na indução e manutenção EMT. Este sistema de modelo é relevante para investigar in vitro EMT. É rentável e mostra alta reprodutibilidade. Além disso, permite a comparação de diferentes compostos no que diz respeito às suas respostas de migração (medição quantitativa distância), e rastreio de alto rendimento de compostos que inibem ou aumentam EMT (medição qualitativa). O modelo é, portanto, bem adequado para testar bibliotecas de drogas para as substâncias que afectam a EMT.

Introdução

Durante vários estágios do desenvolvimento embrionário, células epiteliais perdem a sua forte aderência entre si (por exemplo, junções apertadas) e adquirir um fenótipo migratória em um processo chamado epitelial para mesenquimal (EMT) ^1. EMT é necessário para a formação de tipos de células adicionais, tais como as células da crista neural mesenquimais, uma população que segrega do neuroepitélio ^2. EMT não é apenas essencial durante a fase embrionária, mas também necessária em fases posteriores da vida adulta para manter os processos fisiológicos no organismo adulto, como a cicatrização de feridas ³ e sistema nervoso central de regeneração (CNS) em lesões desmielinizantes ^4.

Tumores epiteliais são conhecidos para reativar EMT como uma etapa de iniciação para a migração, invasão e metástase, levando a progressão do câncer de ^1,3. EMT está de facto ligado centralmente a uma forte ^1,3 migração. Os passos de c celularesonditioning, iniciando, sofrendo e manutenção de EMT não são totalmente compreendidos e necessitam de uma investigação mais aprofundada.

Aqui, um padronizado sistema modelo in vitro baseado em EMT NSC, com factores de crescimento definidos e meios (sem soro e sem o uso de enzima) é apresentada. Este sistema modelo é de relevância para os cientistas que trabalham em EMT. O caracol, Zeb e torção famílias de proteínas têm sido mostrados para ser crítico para EMT tanto em desenvolvimento e ^uma doença. O caracol, Zeb e torção famílias também estão envolvidos no sistema apresentado. O sistema baseia-se numa região específica do cérebro anterior que, normalmente, não sofre EMT proporcionando uma vantagem particular para o estudo dos acontecimentos iniciais de indução durante EMT.

O sistema modelo poderia potencialmente ser aplicada ao estudo de EMT em epitélios fora do SNC, uma vez que os indutores EMT-chave, tais como o caracol, Zeb e proteínas torção, também são encontradas durante EMT em sistemas de tecido fora do SNC. Este modelo sistema permite o isolamento padronizado de NSCs a partir do córtex em desenvolvimento a estudar características de células-tronco em geral e EMT em particular. Usando este sistema, foram isoladas as NSC, EMT induzida e estudada a migração subsequente sob o efeito de FGF2 e BMP4. Observamos que FGF e interage BMP-sinalizando com TGF-sinalização para promover a migração celular, validando o sistema modelo.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais seguiram o 'Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório' (publicação NIH, ^8ª edição, 2011) e foram aprovados pela Comissão Bem-Estar Animal da Basileia (Diretrizes suíços para o Cuidado e Uso de Animais). Por estas orientações do protocolo animal é considerado de "menor animais gravidade grade".

1. Preparação de meio de expansão

Nota: O trabalho em condições assépticas como padrão para cultura de tecidos.

1. Tomar dois tubos de 15 ml, e adicionam-se 5 mL de L-glutamina livre de DMEM / F12 (1: 1) a partir de um frasco de meio de 500 ml em cada um dos dois tubos de 15 ml. Para o primeiro tubo de 15 ml, adicionar 50 mg de apo-transf errina, putrescina 50 ul de estoque 1 M (concentração final 0,1 mM) e 30 ul de selénio de sódio a 500 uM de stock (concentração final 30 nM).
   1. Filtrar através de um filtro de seringa de 0,2 um para dentro da garrafa de DMEM / F12 originais.
2. Para o segundo tubo de 15 ml, adicionar 12,5 mg de insulina. Adicionar6 - 9 gotas de NaOH 1M. Vortex para dissolver completamente insulina. Filtrar através de um filtro de seringa de 0,2 um para dentro da garrafa de DMEM / F12 originais.
   Nota: O NaOH é tóxico e corrosivo. Use luvas, casaco e óculos de segurança.
3. Adicionar 5 ml de penicilina (10000 unidades / ml) / estreptomicina (10.000 ug / mL) / anfotericina B (25 ug / mL) para o frasco de meio DMEM / F12.
4. Adicionar 5 ml de estoque de 200 mM de L-glutamina descongelado de fresco ou oligopéptidos contendo glutamina (200 mM de L-alanil-L-glutamina dipeptídeo) para o frasco de meio DMEM / F12.
5. Agite bem. Preparar 50 ml de alíquotas.
   Nota: meio de expansão pode ser armazenado durante pelo menos 2 semanas a 4 ° C. tubos de alíquota mostrar menos mudanças de pH em relação ao meio mantidos em garrafas de 500 ml.

2. Preparação de Passaging Médio

1. Para 1 l ^de Ca ^{2 +} - ^{+ 2} e Mg HBSS livre de meios de comunicação, adicionar 990,85 mg de glucose (concentração final 5 mM) e 840,10 mg _{de NaHCO3} (10 mM de concentração final). Ajustar o pH para 7,3 com HCl (estoque 1 M). Filtrar esterilizar com filtro de 0,2 um e fazer 50 ml alíquotas.
   Nota: O meio de passagem podem ser armazenadas durante pelo menos 4 semanas a 4 ° C.

3. Preparação de Fatores de Crescimento

1. Prepare estéril 1x PBS com 1% de BSA (PBS-BSA), isoladamente ou com ácido clorídrico (HCl) a 4 mM (PBS-BSA-HCl).
   Cuidado: HCl é corrosivo e tóxico e requer medidas especiais de segurança (casacos, óculos, luvas, Hood).
2. Dissolve-se 10 ug / ml do crescimento humana de fibroblastos recombinante Factor de 2 (rhFGF2) em PBS-BSA (10 ng / ml concentração final), 10 ug / ml de recombinante humano de proteína do osso morfogenética 4 (rhBMP4) em PBS-BSA (10 ng / mL de concentração final concentração), e 20 ug / ml de factor de crescimento transformante humano recombinante p 1 (rhTGFβ1) em PBS-BSA-HCl (40 ng / ml concentração final).
   1. Não filtrar esterilizar. Preparar alíquotas.
      Nota: aliquotas de factor de crescimento pode ser armazenado a-20 ° C durante pelo menos 2 anos.

4. Revestimento de Cultura Celular Pratos

1. Dissolve-se 1875 mg de poli-L-ornitina (PLO) em 500 ml de _H2O destilada para preparar um estoque PLO 250x. Filtrar esterilizar utilizando um filtro de seringa de 0,2 um e fazer alíquotas de 2 ml.
   Nota: Estas aliquotas podem ser guardadas a -20 ° C durante pelo menos 2 anos.
2. Dissolve-se 1 mg de fibronectina bovina em 1 ml _estéril-H2O destilada para preparar a 1.000x da fibronectina. Não vortex, pois isso pode coagular a proteína pegajosa. Agitar suavemente com a mão por 10 min.
   1. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente com agitação ocasional. Verifique se há dissolução completa. Aquece-se a solução para menos do que 37 ° C para a dissolução completa de fibronectina. Não filtrar-esterilizar.
      Nota: A solução pode ser armazenada a 4 ° C durante até 6 meses.
3. Use pratos pré-tratados com plasma de plástico de cultura de células (de 100 mm ou outros tamanhos conforme necessário parao experimento). Para avaliar a migração, utilizar 35 mm pratos com 500 mm de grade. Incubar durante a noite pratos com 2 ml de 1x PLO durante 12 h a 37 ° C numa incubadora de _CO2 a 5% de cultura de tecidos. Lavar duas vezes com 2 ml de PBS 1x.
4. Adicionar 2 ml de 1x fibronectina (/ ml de concentração final 1 ug) e incubar os pratos durante um mínimo de 12 h a 37 ° C numa incubadora de _CO2 a 5%. Remover fibronectina apenas antes do plaqueamento das células.
   Nota: A fibronectina pratos revestidas podem ser armazenadas durante pelo menos 2 semanas a 37 ° C.

5. Padronizado Dissecção e Preparação do subventricular Zona cortical (SVZ)

1. Obter rato embrionário dia 14.5 (E14.5, Sprague-Dawley) e E13.5 rato (C57BL / 6) embriões por cronometrado-acasalamento. Acasalar animais a partir das 18:00 até às 08:00 da manhã seguinte. Meio-dia após o dia de acasalamento é considerado E0.5.
2. Anestesiar o animal prenhe com 5% de isoflurano eo fluxo de oxigênio de 0,8 L / min. Verifique resposta por compressão pata com Diss afiadaforceps exão. Decapitar o animal. Evite CO ₂ asfixia como CO ₂ afeta tronco recuperação celular.
3. Recuperar embriões por cesariana.
   1. Coloque o animal em decúbito dorsal e desinfectar a pele com etanol 70%. Use uma pinça cirúrgica e tesoura para fazer incisão na pele em forma de V de cerca de 8 cm no abdômen inferior acima do útero. Inciso só a pele com pele, mantendo paredes musculares intactas.
   2. Use uma pinça frescas e uma tesoura para inciso os músculos e parede muscular abdominal para entrar no peritônio.
   3. Identificar o útero no peritônio posterior inferior. Remover o útero por uma separação nítida dos tecidos circundantes.
   4. Lave o útero com embriões com estéril 1x PBS e coloque em gelada 1x PBS.
   5. Use uma tesoura de ponta fina para abrir as paredes uterinas para liberar embrião embrião sob um microscópio de dissecção (3X ampliação, Figura 1B). Utilizar um par de fórceps para remover as cascas embrionárias ( Figura 1B). Manter os embriões em meio de expansão no gelo.
   6. Verificar o estágio de desenvolvimento correcta por parte do Atlas do Desenvolvimento Rat Nervous System ^5. O tamanho correcto do embrião é mostrado na Figura 1B.
   7. Verificar idade corrigir ainda mais pela presença da formação de dígitos começando no membro anterior de rato (FL) tal como ilustrado na Figura 1A.
      Nota: O membro posterior (HL) que ainda não mostram separação dígitos (Figura 1B).
4. Para dissecção, transferir embriões para pratos de Petri não revestidos preenchidos com gelo-frio 1x PBS. Realizar dissecção sob um microscópio de dissecção estéreo (3X a ampliação de 20x) usando uma pinça fina autoclavados.
   Nota: As placas de Petri impedir a fixação de tecido à superfície do prato, como pode acontecer com pratos de cultura de células com revestimento de plasma. agulhas fio de tungstênio afiadas ou similares também são úteis para determinadas etapas de dissecção.
5. Retire a pele da cabeça e do crânio começando no intersection do telencéfalo desenvolvimento (TEL) e diencéfalo (DI) (Figura 1B) puxando simultaneamente anteriormente e posteriormente com duas pinças, a fim de ter acesso ao tubo neural em desenvolvimento (Figura 1C).
6. Identificar o rombencéfalo-limite mesencéfalo (MHB, cabeça da seta preta na figura 1B-D), que separa o mesencéfalo (MES) do rhombencephalon. Cortar o rombencéfalo apenas igual ou inferior ao de MHB (Figura 1D, seta triangular).
   Nota: O espaço subcutâneo adicional no MHB facilita a remoção da pele sem prejudicar o tubo neural.
7. Cortar a ligação entre o telencéfalo / diencéfalo na base do crânio com o esqueleto facial (Figura 1E). Isso resulta em um bloco contendo o telencéfalo, diencéfalo e mesencéfalo (TEL-di-MES) (Figuras 1F-H).
8. Transferir o bloco TEL-DI-MES em meio de expansão em gelo. Mantenha-o completEly coberto de meio de expansão em um prato de Petri não revestido. Manter o bloco no mesencéfalo com um par de pinças para evitar tocar no telencéfalo que contém o SVZ cortical com NSC.
9. Repita os passos 5,5-5,8 com todos os embriões (Figura 1F-H).
10. Transferir um TEL-di-MES bloquear em fresco gelada 1x PBS. O corte ao longo da linha ponteada no mesencéfalo anterior (Figura 1F-H), separando o mesencéfalo diencéfalo de a, como mostrado na Figura 1I.
11. Separa-se a DI da TEL por corte ao longo das linhas tracejadas na Figura 1F. Ver telencéfalo isolado na Figura 1J.
12. Dividir os dois hemisférios telencefálicas, cortando ao longo da linha ponteada na Figura 1J. Isto resulta em dois hemisférios separados tal como ilustrado na Figura 1K.
    Nota: O hemisfério esquerdo é ampliada na Figura 1D.
13. Identificar o grupo medialeminências lionic (MGE, Figura 2A; *) e eminências ganglionares laterais (LGE, Figura 2A; +) visível através do futuro interventriculare Forame.
    1. Utilizando uma pinça ou agulha, dissecar ao longo de uma linha reta na intersecção entre a MGE e LGE eo córtex anterior (ant-CTX, Figura 2B). Cortar uma linha reta através do córtex, hipocampo (quadril) e do plexo coróide (CP). Esta separa o córtex anterior incluindo o bolbo olfactivo (OB) das sumidades ganglionares (GE, figuras 2B, C).
14. Corte uma segunda linha reta no cruzamento da eminência ganglionar caudal (CGE, Figura 2C, D) e do córtex posterior (Figura 2C), novamente cortando córtex, hipocampo e plexo coróide.
15. Alisar o telencéfalo. Remover completamente o pólo posterior e do bulbo olfatório (Figura 2D). Identificara bainha cortical contendo o hipocampo e o plexo coróide (Figura 2C), tal como definido anteriormente ^6,7.
    Nota: O hipocampo tem um neuroepitélio mais fino do que o córtex. A CP contém vasos vermelhos.
    1. Separa-se a bainha cortical do córtex, deixando o tamanho do córtex idêntico ao tamanho das sumidades ganglionares (Figura 2D). Isto resulta num bloqueio do córtex (o tecido alvo) e as proeminências ganglionares (GE, Figura 2D).
16. Virar o bloco córtex-GE com (interior) lateral do ventrículo para a superfície do prato.
    Nota: A superfície exterior do hemisfério terá de enfrentar o experimentador (Figura 2E). Na superfície exterior são as meninges contendo vasos sanguíneos (Figura 2E).
    1. Pin a GE para a superfície do prato com a mão esquerda e descascar as meninges fora com um par de fórceps na mão direita (dominante) (Figura 2F ).
       Nota: Este é o passo tecnicamente mais exigente porque as meninges aderir fortemente ao córtex. A separação das meninges do córtex é facilitada por uma linha de corte completamente linear (não recortada) em passos 5.13.1 e 5,14.
17. Repita os passos de 5,12-5,16 para o outro hemisfério e todos os embriões. Cortar o córtex ao longo da LGE em uma distância de metade do diâmetro principal do LGE (Figura 2G, 2H). O córtex dissecados se estende por uma área de 1,2 mm x 2,4 milímetros (Figura 2H) e inclui a camada de SVZ / germinal com as NSC.

6. Preparação de culturas de explantes

1. Cortar o córtex em explantes de menos do que 400 um de diâmetro (Figura 2I). Use uma grade de 400 mm (Recurso Figura 1) posicionado abaixo da dissecção de Petri para a referência (Figura 2H e 2I). Transferir todos os explantes em um prato fresco Petri com gelo-comeio de expansão ld.
2. Remover a fibronectina a partir de uma placa de cultura de tecido (passo 4.4). Deixe-o secar. Adicionar 1 ml de meio de expansão fria para o centro do prato de 35 mm, com dimensão de grelha de 10 mm x 10 mm (Figura 3). Permitir que o meio, para formar uma gota esférica (Figura 3).
3. Inserir até 8 explantes para o centro da gota. Os explantes deve ser idealmente localizado no grid, com distância de pelo menos 3 mm entre si para a análise de migração (ver secção 8).
4. Incubar a placa durante cerca de 1 h numa incubadora de cultura de células (37 ° C, 21% de O _2, CO 5% ₂₎ para fixação dos explantes. Permitir que os explantes para se estabelecer e aderir à superfície revestida com fibronectina. Não agite o prato, uma vez que os explantes podem soltar e sair do centro da grade ideal.
5. Após 1 h de incubação (37 ° C, 21% de _O2, 5% de CO _2), encher-se o prato para um volume total de 2 ml de meio de expansão mais o crescimento fatores ou substâncias de interesse para testar e incubar.
   Nota: Nenhum digestão enzimática, nem soro ou centrifugação são necessários para a preparação dos explantes. Isto é óptimo para a integridade da célula.

7. Preparação de NSC Cultura única célula

1. Aqueça expansão e médio passaging a 37 ° C.
2. Transferir os pedaços de córtex dissecados (a partir do passo 5.17) para um tubo de 15 ml com meio de expansão fria (tubo A). Centrifugar os pedaços de córtex durante 5 min a 1200 x g. Aspirar o sobrenadante. Adicionar meio de expansão pré-aquecido de 200 ul para ressuspender as peças do córtex.
3. Adicionar 700 ul de meio de passagem em pré-aquecido para o tubo de 15 mL com uma ponta de P1,000 (tubo A). Delicadamente ressuspender o sedimento. Colocar a ponta na parte inferior do tubo de 15 ml. Devagar e com cuidado dissociar os pedaços de tecido pela sucção três vezes com a ponta P1,000.
   Nota: Passaging forma promove a separação de células e é necessário para evitar a utilização de enzimas.
4. Permitir que o tubo para se sentar por 30 a 60 segundos para maiores (mais pesado) peças sem dissociar a acertar na parte inferior. células dissociadas individuais permanecerão no sobrenadante. Transferir cerca de 700 ul do sobrenadante para um tubo de 15 ml fresco (tubo B).
5. Repita os passos 7.3 e 7.4 para dissociar os pedaços maiores.
6. Repita os passos 7.3 e 7.4 uma segunda vez para dissociar os pedaços maiores. Transferir todo o sobrenadante para o tubo de 15 ml fresco (tubo B).
7. Adicionar meio de expansão de um volume total de 5 ml. Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Avaliar as células mortas por coloração azul-tripan.
   Nota: Pequenas NSC tolerar os passos 7.2 a 7.6 melhores do que as células maiores. A partir de 10 embriões esperar cerca de 4 x 10 ⁶ células com as células mortas 10%.
8. Para a expansão da NSC, placa 1,5 x 10 ⁶ culas por placa de 10 cm de cultura de tecidos revestidas com f ibronectina em um volume de 8 ml de meio de expansão. Para a expansão standard, adicionar 8 mL de estoque 1.000x rhFGF2. Adicionar 8 mL rhFGF2 todos os dias e me mudardia a cada dois dias.
   Nota: O córtex nesta fase de desenvolvimento contem uma maioria de NSC e apenas uma minoria de células diferenciadas. As células minoritários diferenciadas não respondem ao rhFGF2-tratamento e morrem durante a expansão da cultura.
9. Passagem expandida NSC a 60% de confluência.
   1. Para NSCs passagem, remova o meio de expansão. Lavar as células rapidamente três vezes com meio 5 ml Passaging. Espera 2-4 min. Sem Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +} as células lentamente separar da superfície, o arredondamento para cima. Verifique descolamento das células ao microscópio de fase. Esperar mais alguns minutos, se necessário, até o descolamento visuais de superfície é observado.
      Nota: as células individuais vai separar completamente, mas a maioria das células continuarão a aderir à superfície do prato. A duração necessária para descolamento é dependente da duração do revestimento de fibronectina. Um revestimento de fibronectina de curta duração (12 horas ou menos) resulta em separação celular mais rápido. Para as experiências mais longos (>; 1 semana) de revestimento de f ibronectina mais do que 24 horas é recomendado.
10. Usar uma pipeta de 10 ml para separar suavemente as células a partir da superfície. Recolhe-se o meio de passagens em 5 ml de células e transferi-lo para um tubo fresco de 15 mL. Repita com um adicional de 5 ml de meio passaging.
11. Dissociar as células no tubo de 15 ml por pipetagem para cima e para baixo três vezes, colocando a pipeta de 10 ml, no fundo do tubo. Girar o tubo durante 15 minutos a 1200 xg à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 2 ml de meio de expansão. Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Use azul trypan para avaliar as células mortas.
    Nota: Após a expansão a 60% de confluência, esperar 4 - 5 x 10 ⁶ células com uma contagem de células mortas em torno de 10%.
12. Placa 8 x 10 ⁵ células por placa de 10 cm para passagens adicionais.

8. Avaliação de Migração

1. Para avaliação da migração, isolar explantes de acordo com a Seção 5. Semente os explantes em35 pratos de grade mm. Uma hora após o plaqueamento, adicione FGF2 (rhFGF2). Coloque os pratos em uma incubadora a 37 ° C durante 2 dias.
   Nota: Para a fixação explante ideal, evitar mover os pratos.
2. Remova o meio de 1.000 ponta ul. Adicionar 2 ml de meio de expansão por 1000 ponta ul começando no círculo interior (Figura 3). Isto reduz a tensão superficial em explantes.
3. Adicionar factores de crescimento isoladamente ou em combinação, conforme necessário para a experiência. Use BMP4 / TGF-p1 controle FGF2 / como positivo. Nota: Nesta experiência, 2 ul de FGF2 por mm prato de 35, 2 ul BMP4 e 4 ul de TGF-p1 foram adicionados sozinhos e em combinação (Figura 5).
   1. Adicionar elementos adicionais e / ou substâncias testáveis. Manter pratos novamente intocado durante 2 dias a 37 ° C.
4. Tirar fotografias de explantes em um microscópio invertido.
   Nota: explantes vivos produzir melhores imagens de contraste de fase do que as células fixas. Ambos podem ser usados.
5. para a migraçãoavaliação, usar um software gráfico que permite medições de pixel (por exemplo, Fiji ^8).
6. Medir a grade prato de 500 uM distância em pixels e usá-lo como referência interna.
7. Definir o centro do explante como ponto de partida a migração. Medir a distância entre o centro do explante e o grupo mais exterior de 10 células.
   Nota: Todas as células migram para longe centrifugamente a partir do explante. Eles formam espontaneamente uma folha na periferia, nas circunstâncias testadas (Figura 5).

9. Avaliação Invasion

1. Prepare cultura de tecidos placas de 24 poços revestidas com fibronectina de acordo com a Seção Protocol 4.
2. Coloque 300 mL de meio de expansão quente para o topo poço de câmaras de invasão celular. Incubar as câmaras durante 30 min a 37 ° C e 5% de CO _2.
3. Remover o meio de expansão do poço superior e colocar a câmara de Boyden na placa de 24 poços revestidas.
4. Adicionar 500 ul de meio de expansão quente, com 0,5 l de rhFGF2 e rhBMP4 0,5 ul para o fundo também.
5. NSCs passagem e contam como descrito na Seção 7. Passages 1 a 4 são adequados.
6. Placa de 5 x 10 ⁵ células em um volume de 300 ul de meio de expansão quente com 0,3 ul de rhFGF2 e 0,3 ul de rhBMP4 no topo do poço de câmara de Boyden.
7. Cultura as NSCs semeados durante 24 horas.
8. Adicionar factores adicionais e / ou substâncias testáveis ​​para a câmara de cultura e as células durante mais 48 h.
   Nota: Se as células são invasivas, que vai passar a partir do topo bem através da camada de membrana basal para o fundo do poço. células invasivas vai agarrar a parte inferior da câmara de Boyden.
9. Seguir o protocolo fornecido pelo fabricante. Use cotonetes (incluído no estojo de ensaio de invasão) para remover as células não invasivas no poço superior por limpeza duas vezes.
10. Remover o meio dos poços e adicionar meio de expansão 500 ul comuma mancha da membrana do plasma para as células vivas e com o corante nuclear DAPI para os poços.
11. Incubar durante 10 min a 37 ° C e 5% de CO _2.
    Nota: Os corantes vai integrar-se na membrana e o núcleo das células invasivas, respectivamente, para óptima visualização ^8. Opção: Omitir corante membrana plasmática se imunocitoquímica multicolor é planejado.
12. Remover o meio com os corantes e lavar duas vezes com meio de expansão. Visualizar e contar as células invasoras com um microscópio de fluorescência invertido, como demonstrado anteriormente ^8.
    Nota: Alguns células invasoras podem ter separado da parte inferior da câmara e caíram à superfície do poço abaixo, onde eles aderem à superfície revestida. Para análise completa incluem as células na superfície do poço.
13. Remover o meio e fixar as células em gelo frio fresco PFA a 4% durante 10 min. Lavar 3x com PBS 1x. Realizar imunocitoquímica das células invasivas, como anteriormente descrito ^8-10.

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Resultados

Este sistema modelo de EMT baseia-se no isolamento normalizado de NSC tanto como células individuais ou como explantes a partir de uma região específica do tubo neural em desenvolvimento, o córtex central (Figuras 1 e 2). Para a avaliação quantitativa, os explantes foram semeadas à direita no centro de uma placa de cultura de 500 mm de grelha (Figura 3). Os explantes do córtex central, foram primeiro expostas a FGF2 durante dois ...

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Discussão

Neste estudo um sistema padronizado para análise EMT NSCs utilizando é descrito (resumido na Suplementar Figura 3). A padronização garante a reprodutibilidade (Tabela 1 e 2). As NSC são derivadas do córtex em desenvolvimento, um tecido que normalmente não sofre EMT. Isto é de vantagem para a análise dos primeiros passos no EMT. passos iniciais na EMT não pode ser adequadamente estudado em células tumorais que se acumularam mudanças genéticas e pode já adoptadas caracterís...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BMP4, rhBMP4	RnD Systems	314-BP-01M
Bovine pancreas insulin	Sigma	I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay	Cell Biolabs	CBA-110	24 well plate system
Cell culture dish with grid	Ibidi 500 mm dish, 35 mm	80156
CellMask Orange	Life Technologies	C10045	Plasma membrane dye, use at 1:1,000.
DAPI	LifeTechnologies	D1306	Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.
DMEM/F12 1:1 medium bottle	Gibco Invitrogen	21331-020
FGF2, rhFGF2	RnD Systems	233-FB-01M
Fibronectine, bovine	Sigma	F4759
Glutamax supplement	Gibco Invitrogen	35050-061
Graphics software with pixel measurement feature	Fiji	fiji.sc/Fiji	version 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS media	Sigma	H9394
Human apo-Transferrin	Sigma	T1147	Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.
L-glutamine	Gibco Invitrogen	25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibody	Genetex	GTX26142	Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody	Provided by Hirohide Takebayash	Personal stock	Use at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Penicillin/Streptomycin/Fungizone	Gibco Invitrogen	15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody	Acris	DM3614P	Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100
Poly-L-ornithine	Sigma	P3655
Putrescine	Sigma	P5780	Skin and eye irritant. Appropriate protection required.
Sodium selenite	Sigma	S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody	Millipore Chemicon	AB5774	Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
TGFb1, rhTGFb1	RnD Systems	240-B-010
Uncoated Petri dishes	Falcon Corning	351029