Avaliação do resultado principal em um modelo suíno de Infarto Agudo do Miocárdio

Resumo

avaliação fiável e exacta resultado é a chave para a tradução de terapias pré-clínicos para o tratamento clínico. O presente artigo descreve como avaliar três parâmetros de resultado primário clinicamente relevantes de desempenho cardíaco e danos em um modelo de infarto do miocárdio porco aguda.

Resumo

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are therefore required to confine cardiac damage, promote survival and reduce the disease burden of heart failure. Large animal experiments are an essential part in the translational process from experimental to clinical therapies. To optimize clinical translation, robust and representative outcome measures are mandatory. The present manuscript aims to address this need by describing the assessment of three clinically relevant outcome modalities in a pig acute myocardial infarction (AMI) model: infarct size in relation to area at risk (IS/AAR) staining, 3-dimensional transesophageal echocardiography (TEE) and admittance-based pressure-volume (PV) loops. Infarct size is the main determinant driving the transition from AMI to heart failure and can be quantified by IS/AAR staining. Echocardiography is a reliable and robust tool in the assessment of global and regional cardiac function in clinical cardiology. Here, a method for three-dimensional transesophageal echocardiography (3D-TEE) in pigs is provided. Extensive insight into cardiac performance can be obtained by admittance-based pressure-volume (PV) loops, including intrinsic parameters of myocardial function that are pre- and afterload independent. Combined with a clinically feasible experimental study protocol, these outcome measures provide researchers with essential information to determine whether novel therapeutic strategies could yield promising targets for future testing in clinical studies.

Introdução

Insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida (ICFER) é responsável por cerca de 50% de todos os casos de insuficiência cardíaca, afetando aproximadamente 1 - 2% das pessoas no mundo ocidental ^1. Sua causa mais comum é infarto agudo do miocárdio (IAM). Como a mortalidade aguda após IAM tem diminuído significativamente devido ao aumento da sensibilização e melhoria das opções de tratamento, a ênfase foi deslocada para a sua seqüelas crônicas; o ser mais proeminente ICDS ^2,3. Juntamente com o aumento de custos de cuidados de saúde ^4, a crescente epidemia de insuficiência cardíaca sublinha a necessidade de novas terapias e diagnósticos, que pode ser estudado num modelo suíno altamente translacional de remodelação adverso após AMI, como descrito anteriormente ^5.

Ambos, determinantes (por exemplo, a dimensão do enfarte) e avaliações funcionais (por exemplo, ecocardiografia) de remodelação adverso são muitas vezes utilizados para testes de eficácia de novos agentes terapêuticos, indicando a necessidade de relmétodos iable e relativamente barato. O objetivo do presente trabalho é o de atender a essa necessidade através da introdução de medidas importantes e confiáveis ​​resultados nos ensaios de eficácia em um modelo suíno de infarto agudo do miocárdio. Estes incluem o tamanho do enfarte (IS) em relação à área em risco (AAR), o ecocardiograma transesofágico 3D (3D-TEE) e da aquisição de loop pressão-volume detalhada baseada admissão (PV).

Tamanho do infarto é o principal determinante da remodelação adversa e sobrevivência após AMI ^6. Embora a reperfusão oportuna de miocárdio isquêmico pode salvar cardiomiócitos reversível feridos e limitar o tamanho do infarto, o próprio reperfusão provoca danos adicionais através da geração de estresse oxidativo e uma resposta inflamatória desproporcional (lesão de isquemia-reperfusão (IRI)) ^7. Assim, IRI tem sido identificada como um alvo terapêutico promissor. A capacidade de novas terapias para diminuir o tamanho do infarto é quantificada por avaliar o tamanho do infarto em relaçãopara a área em risco (TAA). AAR quantificação é obrigatória para corrigir a variabilidade inter-individual na anatomia coronária de modelos animais, como AAR maior leva a um tamanho do infarto absoluta maior. Desde o tamanho do enfarte está directamente relacionada com o desempenho cardíaco e da contratilidade do miocárdio, as variações na AAR pode influenciar estudar medidas de resultados, independentemente de modalidades de tratamento ^8.

Tridimensional ecocardiografia transesofágica (3D-TEE) é um método barato seguro, confiável e, mais importante, clinicamente aplicável para medir a função cardíaca não-invasiva. Considerando ecocardiografia transtorácica (ETT) imagens estão limitados a vista 2D longo paraesternal e eixo curto em suínos ^9, 3D-TEE pode ser usado para obter imagens em 3 dimensões completas do ventrículo esquerdo. Portanto, ele não requer aproximações matemáticas de ventrículo esquerdo (VE) volumes, tais como ^a regra ¹⁰ do Simpson modificado. Este último fica aquém do corrrectamente estimar volumes do VE após LV remodelação, devido à falta de geometria cilíndrica ^11. Além disso, 3D-T é preferível sobre a ecocardiografia epicárdico como ele não requer intervenções cirúrgicas, que têm sido observados para exercer efeitos cardioprotectores no presente modelo ^12. Embora o uso de 2D-T para a avaliação da função miocárdica foi descrito antes ^13,14, limitações quanto geometria ventricular são semelhantes aos observados em 2D-ETT e dependem do grau de remodelação do VE. Assim, quanto maior for o enfarte (e, portanto, maior é a probabilidade de falha do coração), as medições de 2D mais prováveis ​​se tornar defeituosa por suposições incorrectas geométricas e quanto maior for a necessidade de técnicas em 3D.

No entanto, a maioria das modalidades de imagem são limitados em sua capacidade de avaliar propriedades funcionais intrínsecas do miocárdio. PV loops de fornecer tais informações adicionais relevantes ea sua aquisição é, portanto,descrito em detalhe abaixo.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Medical Center Utrecht (Utrecht, Holanda) e em conformidade com o "Guia para o cuidado e uso de animais de laboratório".

NOTA: O protocolo para realizar uma oclusão balão de tórax fechado não é parte do manuscrito corrente e é descrita em detalhe noutro local ^5. Em suma, suínos (60 - 70 kg) são submetidos a 75 min oclusão com balão transluminal da porção média da artéria descendente anterior esquerda (LAD).

Ambos, tridimensional ecocardiografia transesofágica (3D-TEE) e medições de loop pressão-volume (PV) pode ser realizada no início do estudo, de curto prazo e de longo prazo follow-up. Note-se que estas medidas não são considerados fiáveis ​​nas primeiras horas após o infarto do miocárdio devido a arritmias frequentes nesta fase. tamanho do infarto (IS) ea área em risco (AAR) medidas são preferably avaliada no seguimento de curto prazo (24-72 horas) ^15,16, uma vez que mudanças na microcirculação e secundário afinamento cicatriz do miocárdio culminar em resultados menos confiáveis. tamanho do enfarte coloração é realizada usando cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) (CUIDADO, irritante), que é considerado altamente reprodutível e relativamente barato. TTC é um pó branco que se dissolve em solução salina colorlessly. Ao entrar em contacto com várias desidrogenases, é convertido para uma cor vermelho tijolo. Desse modo, ele discrimina entre viável (vermelho) e tecido miocárdico mortos (branco). Para uma visão geral, tanto a determinação do tamanho do infarto invasivo e não-invasivo, os leitores são direcionados para uma revisão abrangente sobre este assunto ^17.

A Figura 1 mostra a linha do tempo, incluindo anestesia, preparo cirúrgico e avaliações de resultados primários utilizados neste estudo.

1. Medicação e Anestesia

1. Certifique-se que o animal não comer oubeber durante pelo menos 5 horas antes do procedimento. Pré-tratamento, anestesia e protocolos de tratamento de dor pós-operatórias foram descritas em detalhe noutro local ^5.
2. Em resumo, no dia anterior à cirurgia um remendo buprenorfine (5 ug / hora) é aplicado à pele que está activo durante sete dias para limitar a dor pós-operatória. No dia da cirurgia, os porcos sedar por injecção intramuscular de 0,4 mg / kg de midazolam, 10 mg / kg de cetamina e 0,014 mg / kg de atropina. Esperar por cerca de 10 - 15 min. Inserir um 18 G cânula em uma das veias da orelha e administrar 5 mg / kg de tiopental de sódio para induzir a anestesia.
3. Entubar o porco usando um tubo endotraqueal (tamanho 8.5 para suínos de 60 - 70 kg). Se necessário, execute balão de ventilação (freqüência de 12 / min) e transportar o porco para a sala de operações.
4. Após a chegada na sala de cirurgia, iniciar ventilação com pressão positiva mecânica com FiO ₂ de 0,50, 10 ml / kg volume corrente e uma frequência de 12 / min usando contínuagravação de capnografia.
5. Comece a anestesia equilibrada por infusão intravenosa contínua de uma combinação de midazolam (0,5 mg / kg / h), sufentanil (2,5 ug / kg / h) e de pancurónio (0,1 mg / kg / h).
6. Confirmar anestesia testando o reflexo corneal e acompanhamento do padrão de respiração (por exemplo, a respiração espontânea em combinação com ventilação mecânica indica anestesia incompleta). Use vet pomada sobre os olhos para evitar a secura enquanto o animal está sob anestesia.

2. 3D ecocardiografia transesofágica (ETE)

1. Para permitir o monitoramento da frequência cardíaca e aquisição de dados, conectar o animal ao 5 leva ECG na máquina ecocardiografia.
2. Colocar o animal na posição de lateral direito. Certifique-se a sonda é em linha reta e flexível na ponta por desbloquear a peça operacional.
3. Abra a boca do porco e insira cuidadosamente a sonda eco no esôfago. Se necessário, use um laringoscópio para visualização. Tenha cuidado para evitar acabar na bolsa faríngea anatômica normal, parecida com divertículo de um Zenker ^18.
4. Inserir a sonda de 50 - 60 cm (medida a partir da ponta do focinho). Lentamente girar a sonda e flexionar a cabeça para uma posição ântero-lateral esquerdo para visualizar o coração (Figura 2A - B). Certifique-se de todas as paredes são claramente visíveis.
5. Use a opção "volume máximo 3D" no visor da máquina ecocardiografia para exibir duas imagens perpendiculares do ventrículo esquerdo, como mostrado na Figura 2C -. D Em seguida, maximizar a largura setor que está sendo adquirido, selecionando "FV Opt Volume". Pausa ventilação por temporariamente desligar a ventilação mecânica e pressione "Adquirir" para obter medições de volume completo.
6. Após a aquisição de eco, certifique-se a ponta é flexível por desbloquear a peça operacional. Em seguida, retire lentamente a sonda do animal.
   NOTA: Não deixe the animais sem vigilância até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
7. Realizar a análise off-line com software validado como descrito anteriormente ^19.

3. Pressão-volume-base Admittance loop de aquisição

1. Pré-lavagem as pontas de detecção do cateter de admissão 7 M de tetra-polar em 0,9% de solução salina (a temperatura ambiente até 37 ° C) durante um mínimo de 20 minutos para assegurar a hidratação adequada e mínimo deriva da pressão da linha de base durante a experiência ^{de 20.}
2. Administrar a medicação e anestesia conforme descrito na seção 1.
3. Execute preparação cirúrgica e obter acesso vascular, como descrito anteriormente ^5.
   1. Em suma, fazer a barba e limpar o pescoço. Desinfectar a área cirúrgica com iodo 2% e cobrir as partes não-estéreis dos suínos, com campos cirúrgicos estéreis.
   2. Façouma incisão média no pescoço para expor a artéria carótida e a veia jugular interna. Inserir um F bainha 8 para dentro da artéria carótida e uma bainha F 9 na veia jugular.
4. Inserir um cateter de Swan-Ganz (SG) através da bainha 9 M na veia jugular e encostá-lo numa artéria pulmonar pequena inflando o balão na ponta do cateter. Após colocação adequada da parte periférica do pulmão, esvaziar o balão. Ligue o SG para um dispositivo de saída cardíaca externa.
5. Anexar uma seringa de 20 mL contendo 0,9% de soro fisiológico estéril para o orifício de injecção que se conecta ao lúmen com a desembocadura mais proximal. Medir o débito cardíaco por infusão rápida de 5 ml de solução salina a 0,9% (temperatura ambiente) e obter taxas de coração para calcular o volume sistólico (SV). Repita este procedimento três vezes e calcular o SV média.
   NOTA: O débito cardíaco é (automaticamente) calculada usando a equação de termodiluição Stewart-Hamilton e baseia-se em mudanças de temperatura noartéria pulmonar após a infusão de temperatura ambiente salina ^21.
6. Remover o cateter SG. Inserir um cateter Fogarty 8 F através da bainha 9 M na veia jugular e posicioná-la na veia cava inferior.
7. Calibrar o sinal de pressão do cateter ciclo PV utilizando o botão "Fine" "Course" e, enquanto a ponta permanece em 0,9% de solução salina. Em seguida, insira o SV medido no sistema.
8. Avançar o cateter ciclo PV através do F bainha 8 na artéria carótida e centrar a ponta do ventrículo esquerdo (VE) sob fluoroscopia.
9. Selecione o maior adequadamente colocado segmentos traçando o sinal de condutância cru contra o sinal de pressão. Certifique-se de que as alças de pressão-condutância são de forma de retângulo. Fase sinal é esperado para mostrar um traçado sinusal, com valores entre 3 e 5 graus. Pausa ventilação e executar uma linha de base digitalizar para converter condutância de Volume.
   1. Aceite os dados de base porpressionando "Continuar" quando os sinais são estáveis (sem arritmias), a frequência cardíaca é igual a / condutância diastólica final (ED) ECG ou batimentos cardíacos pressão derivada e sistólico final (ES) são adequadamente detectado pelo sistema ^20.
      NOTA: O último pode ser verificada através da representação gráfica do sinal de condutância em bruto contra o sinal de pressão e comparando os valores de condutância ES / ED derivadas da linha de base para digitalizar condutância em tempo real. Se algum dos requisitos acima não for cumprida, repita o procedimento.
10. Adquirir loops de pressão-volume da linha de base, gravando 10 - 12 batimentos consecutivos durante apneia, fazendo uma pausa de ventilação.
11. Inflar o cateter Fogarty sob orientação fluoroscópica para reduzir a pré-carga e gravar 10 - 12 batimentos consecutivos como descrito acima. Certifique-se a pressão sanguínea sistólica permanece> 60 mmHg e não há arritmias interferir com as medições.
12. Retirar os cateteres de loop Fogarty e PV. Mantenha a gravação Pressur arteriale antes e durante a remoção do cateter ciclo PV para permitir corrigir o desvio de pressão (isto é, ex vivo, antes e depois do procedimento de linha de base diferença de pressão).
    NOTA: Não deixe o animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
13. Realizar a análise off-line de medições geométricas e parâmetros funcionais com software validado ^22.

4. área em risco (AAR) e tamanho do infarto (IS) Quantificação

1. Dissolve-se 1,00 g de azul de Evans ⁽²³ CUIDADO, tóxica) em 50 ml de 0,9% de solução salina, encher duas seringas de 50 ml de bloqueio Luer com 20 ml e 30 ml de 2% de solução de azul de Evans, respectivamente, e manter a temperatura ambiente.
   NOTA: Trabalho em um exaustor e vestir uma máscara de pó para limitar a exposição às poeiras perigosos e de uso de luvas e óculos de protecção para evitar o contacto frpele e olhos om.
2. Tomando precauções semelhantes, dissolve-se 1% de 2,3,5-trifenil-tetrazoliumchloride (TTC) (CUIDADO, irritante) em 37 ° C 0,9% de solução salina e manter a 37 ° C.
3. Cirurgicamente preparar o animal para obter acesso vascular para ambas as artérias carótidas. Executar uma esternotomia para permitir a visualização direta do efeito do in vivo Evans infusão de azul ^5.
4. Inserir um 7 F e 8 F introdutor na respectiva artéria carótida. Alternativamente, insira ambas as bainhas introdutor de uma artéria carótida única ou usar uma das artérias femorais para um dos dois cateteres-guia.
5. Conectar dois Y-conectores padrão para a 7 F JL4 e um 8 F JL4 cateter guia respectivamente. Para uma abordagem femoral, use uma JR4 para a artéria coronária direita (ACD) e um JL4 para a artéria coronária esquerda (ACME). Ligue uma torneira de três vias adicional com extensão de 10 cm a ambos os conectores Y.
6. Administrar 100 IU / kg de heparina. Posicione o ca guiando 8 F JL4cath no óstio do TCE por meio de uma de duas bainhas introdutoras.
7. Usando um "fio-guia 0,014, avançar um cateter de dilatação coronária através do cateter LCMA e posicionar o balão no local onde a oclusão coronária foi realizada durante a indução MI. Não infle ainda.
8. Posicionar o segundo cateter guia 8 F JL4 no óstio da RCA através da segunda bainha do introdutor.
9. Realizar uma angiografia coronária (CAG) através da infusão de agente de contraste sob fluoroscopia para confirmar o posicionamento correto de ambos os cateteres-guia eo balão nas artérias coronárias, utilizando anteroposterior e Lao 30 ° vistas.
10. Conecte os dois de 50 ml seringas contendo 30 ml (ACME) e 20 ml (RCA) 2% Evans azuis para as respectivas torneiras de três vias ligados aos conectores Y sobre os cateteres orientadores.
11. Inflar o balão e confirmar a oclusão da artéria coronária pela CAG. Somente quando o balão blocos completamente a passagem de qualquer agente de contraste, injetar Evans d azulvos por meio de ambos os cateteres guia (5 ml / s), enquanto que o balão é insuflado.
12. Imediatamente após a conclusão da infusão de azul de Evans, induzir a fibrilação ventricular, colocando uma pilha de 9 V na parte não enfartada do coração.
13. Faça uma incisão na veia cava para liberar a pressão e certificar-se de uma unidade de sucção está disponível para permitir a drenagem de sangue.
14. Desinflar o balão, recolhê-lo em conjunto com ambos os cateteres orientadores e explante coração dissecando as membranas circundantes. Um corte transversal através dos grandes vasos (ou seja, aorta, artéria pulmonar / veias) permite a explantação completa. Lavar rapidamente no sangue e corante supérfluo na superfície exterior e nas cavidades cardíacas utilizando-se 0,9% de solução salina.
15. Dissecar cuidadosamente o ventrículo esquerdo e fazer cortes em 5 de 10 mm de espessura iguais a partir do vértice à base, em um plano paralelo ao atrioventricular (AV) groove.
16. Fotografar ambos os lados de todos os cinco fatias separadamente sob condições de luz ambiente,como um possível corante azul de Evans lavagem pode ocorrer no passo subsequente. Para a calibração, certifique-se um governante está presente na imagem.
17. Incubar durante 10 min em solução de TTC a 1% a 37 ° C, transformando-os em torno de secções depois de 5 min de igualdade de coloração.
18. Mais uma vez, fotografar ambos os lados de todos os cinco fatias separadamente sob condições de luz ambiente e certificar-se de um governante é visualizado na imagem para a calibração.
19. Pesar todas as fatias. Use software adequado para as análises ^5. Ao usar ImageJ (versão 1.47), clique no botão "Reta". Agora, desenhe uma linha reta com uma distância conhecida usando a régua na imagem (por exemplo, 5 cm). Clique em "Analisar" -> "Definir escala" e digite a distância na caixa "distância conhecida". Este procedimento permite a calibração de distância em pixels para unidades SI de comprimento.
20. Usando o botão "Polígono seleções", selecione a área total que corresponde ao miocárdio LV no presente imidade, clique em "Analisar" -> "Measure" para adquirir medições. Execute este procedimento para ambos os lados de cada fatia de miocárdio, e média por fatia.
    1. Multiplicar pelo peso da fatia proporcional ao peso total de todos os cinco fatias e a média destas medições para todas as fatias.
21. Realizar medições semelhantes para a área em risco (AAR) e tamanho do infarto (IS). Divide IS / AAR, AAR / LV e IS / LV e multiplicar por 100% para obter respectivas avaliações de resultados ^5.

Resultados

3D ecocardiografia transesofágica

3D ecocardiografia transesofágica (3D-T) pode ser utilizado para a avaliação da função cardíaca global. Após AMI, a função cardíaca global, difere de valores basais saudáveis. Em particular, a fração de ejeção ventricular esquerda (FEVE) diminui de 59 ± 4% para 37 ± 6% após uma semana de reperfusão (n = 10) (GPJ van Hout, 2015). Um aumento no volume s...

Discussão

Remodelação cardíaca é amplamente dependendo do tamanho do infarto do miocárdio e a qualidade de infarto do miocárdio reparar ^6,26. Para avaliar o ex de uma forma padronizada, a presente manuscrito fornece um método de elegante de infusão in vivo de azul de Evans combinadas ex vivo com TTC coloração, o qual foi validado e utilizado extensivamente ^8,16,27,28. Este método permite a quantificação da área em risco (TAA) e o tamanho do enfarte em relação ao TAA ^16....

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-dimensional Transesophageal Echocardiography
iE33 ultrasound device	Philips	-
X7-2t transducer	Philips	-
Aquasonic® 100 ultrasound transmission gel	Parker Laboratories Inc.	01-34	Alternative product can be used
Battery handle type C (laryngoscope handle)	Riester	12303
Ri-Standard Miller blade MIL 4 (laryngoscope blade)	Riester	12225
Qlab 10.0 (3DQ Advanced) analysis software	Philips	-
Name	Company	Catalog Number	Comments
Pressure-volume loop acquisition
Cardiac defibrillator	Philips
0.9% Saline	Braun
8 F Percutaneous Sheath Introducer Set	Arrow	CP-08803	Alternative product can be used
9 F Radifocus® Introducer II Standard Kit	Terumo	RS*A90K10SQ	Alternative product can be used
8 F Fogarty catheter	Edward Life Sciences	62080814F	Alternative product can be used
7 F Criticath™ SP5107H TD catheter (Swan-Ganz)	Becton Dickinson (BD)	680078	Alternative product can be used
Ultraview SL Patient Monitor and Invasive Command Module (external cardiac output device)	Spacelabs Healthcare	91387	Alternative product can be used
ADVantage system™	Transonic SciSense	-
7 F Tetra-polar admittance catheter (7.0 VSL Pigtail / no lumen)	Transonic SciSense	-
Multi-channel acquisition system (Iworx 404)	Iworx	-
Labscribe V2.0 analysis software	Iworx	-	Alternative product can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments
Infarct size / area-at-risk quantification
Diathermy	-		Alternative product can be used
Lebsch knife	-		Alternative product can be used
Hammer	-		Alternative product can be used
Bone marrow wax	Syneture		Alternative product can be used
Klinkenberg scissors	-		Alternative product can be used
Retractor	-		Alternative product can be used
Surgical scissors	-
7 F Percutaneous Sheath Introducer Set	Arrow	CP-08703	Alternative product can be used
8 F Percutaneous Sheath Introducer Set	Arrow	CP-08803	Alternative product can be used
7 F JL4 guiding catheter	Boston Scientific	H749 34357-662	Alternative product can be used
8 F JL4 guiding catheter	Boston Scientific	H749 34358-662	Alternative product can be used
COPILOT Bleedback Control Valves	Abbott Vascular	1003331	Alternative product can be used
BD Connecta™	Franklin Lakes	394995	Alternative product can be used
Contrast agent	Telebrix
Persuader 9 Steerable Guidewire 9 (0.014", 180 cm, straight tip), hydrophilic coating	Medtronic Inc.	9PSDR180HS	Alternative product can be used
SAPPHIRE™ Coronary Dilatation Catheter (PTCA balloon suitable for the size of the particular coronary artery (2.75 - 3.25 mm))	OrbusNeich	103-3015	Alternative product can be used
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129-100G	Toxic. Alternative product can be used
2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride (TTC)	Sigma-Aldrich	T8877-100G	Irritant. Alternative product can be used
9 V Battery	-	-
Ruler	-	-
Photocamera	Sony	-
ImageJ	National Institutes of Health	-	Alternative product can be used