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Resumo

The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.

Resumo

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.

Introdução

A barreira de fluido cerebrospinal de sangue (BCSFB) é um dos três locais de barreira entre o sangue e o cérebro um. Seu correlato morfológicas são as células epiteliais do plexo coróide (CP) de 2,3, um convoluta-endotelial epitelial, que é fortemente vascularizado e localizado nos ventrículos do cérebro. A CP serve para produzir o fluido cerebrospinal (CSF), bem como para separar o último do sangue. A fim de conseguir a função de barreira, as células epiteliais CP mostram uma actividade pinocitótica baixo, expressar transportadores específicos, e estão densamente ligadas por uma rede contínua de junções apertadas (TJS) 2,3.

Células do plexo coróide do papiloma humano (HIBCPP), derivados a partir de um plexo coróide do papiloma maligno de uma japonesa 4, foram utilizados para construir um modelo funcional em vitro da BCSFB. HIBCPP células mostram um par de características de um BCSFB funcional, tal como a formação de TJfios, o desenvolvimento de um potencial de membrana transepitelial alta que pode ser determinado como a resistência eléctrica transepitelial (TEER), e permeabilidades menores para macromoléculas. Além disso, as células HIBCPP expressar transportadores característicos, que podem servir para regular o micro ambiente iónico, e mostram apical / basolateral 5,6,7 polaridade.

O BCSFB foi mostrado funcionar como um local de entrada para agentes patogénicos (bactérias, vírus, e fungos) no sistema nervoso central (SNC) 8. A invasão de agentes patogénicos, incluindo Neisseria meningitidis (N. meningitidis), uma bactéria Gram-negativa, podem causar doenças graves, como a meningite. A prova de que ele ultrapassa a barreira epitelial de protecção do CP é suportado por observações histopatológicas em pacientes com doença meningocócica exibindo aumento da quantidade de meningococos nos vasos e as células epiteliais 9,10 CP. Para ganhar a entrada em células hospedeiras bacteria muitas vezes mecanismos de endocitose sequestrar, que são mediados ou desencadeada pelos receptores de superfície específicos localizados nas células hospedeiras. Uma vez que as interacções dos agentes patogénicos com estes receptores pode ser espécies modelos 11, específicos dos animais só pode ser consultado em medida restrita. A linha celular HIBCPP proporciona a oportunidade de estudar o processo de invasão, bem como os mecanismos moleculares subjacentes em um sistema modelo humano. Empregando inserções de cultura de células nos permite analisar as interacções dos agentes patogénicos com células hospedeiras de dois lados celulares distintas. Muitas bactérias, incluindo N. meningitidis, são fortemente sujeito ao impacto da gravidade durante ensaios de infecção. Para optimizar a interacção dos agentes patogénicos com as células HIBCPP durante os ensaios, as bactérias são inicialmente adicionado para dentro do compartimento superior do sistema de cartucho filtrante de cultura de células. Para permitir que a infecção do lado apical ou do lado basolateral da célula, respectivamente, duas variações do sistema in vitro têm sido ESTAestabe-: No sistema standard HIBCPP células são semeadas para dentro do compartimento superior do elemento filtrante, simulando a situação quando os microrganismos estão localizados no lado-CSF a e entrar em contacto com o lado apical das células (Figura 1 A, C). Em contraste, usando as células HIBCPP num sistema de inserção de cultura de células de filtro invertido reflecte as condições quando as bactérias tenham entrado no fluxo sanguíneo. Microorganismos difundir no sangue e encontro CP células epiteliais do lado basolateral (Figura 1B e D). Digno de nota, neste sistema modelo, foi demonstrado que as bactérias invadem as células HIBCPP numa forma polar especificamente de 5,7 lado basolateral da célula.

Subsequentemente à infecção do CP, os agentes patogénicos podem ser invadidos reconhecido pelo sistema imune inato através de ligação a receptores de reconhecimento de padrões (SRRS). membros bem descritas de PRRS pertencem à família dos receptores de tipo Toll (TLR). pode TLRs bind para estruturas características de microorganismos infecciosos, que são padrões moleculares associados a agentes patogénicos denominado (PAMPs). A ligação dos receptores leva à activação da célula hospedeira cascatas de sinalização que provocam a expressão de citocinas e quimiocinas 12, que por sua vez estimulam a transmigração de células imunes em todo o BCSFB 13,14. Tem sido demonstrado que as células HIBCPP expressar vários TLRs ao nível do mRNA e que a infecção com N. meningitidis resulta na secreção de várias citocinas e quimiocinas, incluindo CXCL1-3, IL6, IL8 e TNFa 15,16.

Aqui, nós descrevemos o cultivo e infecção da linha celular humana HIBCPP num sistema de inserção de cultura de célula invertido que imita o BCSFB. Este sistema modelo permite estudar as interacções dos agentes patogénicos com o lado da célula in vivo, relevante basolateral, bem como a subsequente resposta celular.

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Protocolo

1. Prepare Cultura celular filtro Incorporações nas células Sementeira HIBCPP em um sistema invertido Modelo

  1. Pré-aquecido DMEM / F12 (HAM) suplementado com 5 ug / ml de insulina, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 10% de soro fetal de vitelo (FCS).
  2. Use fórceps estéreis para colocar 0,33 cm² inserções de filtro de cultura de células da área de crescimento com um tamanho de poro de 3 um de cabeça para baixo em uma placa de 12 poços (Figura 1E).
  3. Encha meio para dentro do compartimento inferior do cartucho do filtro de cultura de células (cerca de 3 ml) e 100 ul de topo do elemento do filtro. Inundar a placa, bem como o compartimento inferior com forma. Aspirar o meio excessiva de tal maneira que o compartimento inferior do inserto filtro fica cheio (Figura 1E).
    Nota: Recomenda-se a utilização de uma pipeta sorológica para esta etapa.
  4. Cubra placa de 12 poços, com a tampa e transferir as inserções de filtro preparados de cultura de células para a incubadora, a 37 ° C,5% de CO 2 até adição de células.

2. Cultivo e Passaging de células HIBCPP

  1. Prepare DMEM / F12 (HAM) suplementado com 5 ug / mL, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 10% de FCS.
  2. Pré-quente médio e PBS em banho-maria C 37 °. médio aspirado da garrafa. Adicionar 10 ml de PBS ao balão e redemoinho. Repita este passo uma vez.
  3. Adicionar 3 ml de 0,25% de tripsina-EDTA para o balão e redemoinho. Colocar na incubadora, a 37 ° C, 5% de CO 2.
  4. Após aproximadamente 20 min retirar o balão da incubadora. Certifique-se de que as células são destacadas do fundo do frasco e apresentar uma forma redonda quando pesquisados ​​com o microscópio.
    Nota: As células não separe completamente uma da outra e são muitas vezes encontrados em aglomerados. Recomenda-se usar as células-se à passagem 38.
  5. Para parar tripsinização adicione 17 ml de meio. Volte a suspender as células por pipetagem cima e para baixo e transferir a suspensãopara um tubo de 50 ml. Centrifugar a 50 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
  6. Ressuspender as células num volume apropriado de meio e contar as células utilizando um hemocitómetro.
    Nota: A concentração de células ressuspensas HIBCPP deve ser de 1 x 10 6 células / ml. Para a manutenção de células HIBCPP sugere-se a transferir uma quantidade de 1-6 x 10 6 células em 10 ml de meio para um frasco de T75-. Mudança do meio cada segundo dia.

3. Sementeira Cultura de Células invertido filtro inserções com células HIBCPP

  1. No topo de cada elemento do filtro invertido (isto é, o lado inferior do filtro) adicionar 80 ul de suspensão de células (isto é. 8 x 4 10 células) (Figura 1E).
    Nota: Certifique-se de que as células são distribuídas uniformemente na suspensão invertendo o tubo antes da semeadura.
  2. Cobrir as inserções de filtro de cultura de células inoculada com a tampa da placa de 12 poços e transferência para a incubadora, a 37 ° C, 5% CO 2.
  3. No primeiro dia, preencher 1 ml de meio em poços de uma placa de 24 poços. Levantar as inserções de filtro de cultura de células usando uma pinça para fora da placa de 12 poços, descartar a forma interior, por sua vez as inserções de filtro e colocá-los no padrão de orientação na placa de 24 poços preparados (Figura 1E).
  4. Colocar as células em meio fresco a cada segundo dia. Preparar 24 cavidades com meio fresco e transferir as inserções de filtro a ele. Preencha inserções com 0,5 ml de meio fresco. Verifique TEER todos os dias, como descrito no ponto 4.
  5. Quando os valores de TEER HIBCPP de células semeadas em inserções de cultura celular for superior a 70 Ω x cm (cerca de 4 dias após a sementeira), em seguida, continuar a cultura de células em meio contendo 1% de FCS e 5 ug / ml de insulina. Prepare a placas de 24 cavidades com 1 ml de meio para cada poço. Transferir inserções de filtro para os recipientes preparados e meio de permuta no compartimento superior.
    Nota: Esta retirada soro após confluência leva à formação deum potencial de membrana superior.
  6. médio aspirado do compartimento do filtro, transferir para o bem preparado e encher com 500 � de meio. Repita este passo uma vez. Coloque as células durante a noite na incubadora, a 37 ° C, 5% de CO 2.

4. Medição da resistência elétrica transepitelial (TEER)

  1. Mergulhar as pontas dos eléctrodos da voltohmmeter tecido epitelial durante 15 min em etanol a 80%. Transferir voltohmmeter sob o capô e deixá-eletrodo seco por um momento. Coloque eléctrodo no respectivo meio de cultura utilizado para as células por mais 15 minutos para equilibrar.
  2. Realizar medições ao posicionar o braço mais longo do eléctrodo de modo que toque o fundo do compartimento inferior de cada vez, colocar o braço mais curto no compartimento de cartucho do filtro.
    Nota: Os valores de resistência de elementos filtrantes de cultura de células sem células em meio deve ser usado como valores em branco ((valor medido (Ω) - valor em branco (Ω)) x filtrosuperfície (isto é, 0,33 cm)).
  3. Após a medição Coloque o eletrodo de volta para 80% de etanol para 15 min. Armazenar em um tubo seco.

5. Determinação do paracelular Permeabilidade

  1. Dissolve-se 1 g de FITC-inulina em 200 ml de meio de cultura suplementado com 5 ng / ml de insulina 1% de FCS. Aplicar 50? G / ml da solução para dentro do compartimento do filtro superior antes da infecção das células.
  2. Após a infecção recolher amostras de meio do poço inferior para determinar a quantidade de inulina passada do compartimento do filtro através da camada de células.
  3. Prepara-se uma solução padrão de FITC-inulina e executar 1: 2 diluições, 10 vezes (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% e 0%) . Determinar a fluorescência por medição de todas as amostras em leitor de microplacas.

6. Preparação de bactérias para a infecção de células HIBCPP numa cultura de células de filtro Inserções

  1. Um dia antes do experimento, raspar tele N. congelada meningitidis estirpes fora de uma glicerol-estoque e raia para fora em Agar Chocolate com Vitox. Crescer durante a noite na incubadora, a 37 ° C, com 5% de CO 2.
  2. Extrair 20-30 colónias a partir da cultura durante a noite e transferir para um tubo contendo 8 ml Proteose Peptona meio suplementado com 0,042% de NaHCO 3, 0,01 M de MgCl2 e 1% Polyvitex.
  3. Agitar as bactérias durante 1,25 h a 220 rpm, 37 ° C. Sedimentar as bactérias por centrifugação a 2684 g durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento bacteriano com meio isento de soro de 8 ml. Vortex para assegurar uma suspensão uniforme.
  4. Para determinar a densidade da cultura, medida uma diluição de 1:10 a uma densidade óptica (OD) de 600 nm. Ajustar a suspensão bacteriana para uma DO 600 de 0,1.
    Nota: Esta suspensão contém aproximadamente. 1 x 10 8 UFC / ml.
  5. Para confirmar a concentração de células bacterianas, dilui-se a suspensão por passos (01:10) até umdiluição de 10 ~ 5 e placa em placas de agar de chocolate.
    Nota: diluições em série similares precisam ser executadas para calcular curvas de crescimento bacteriano.

7. A infecção de células HIBCPP em inserções de filtro cultura de células e determinação da invasão bacteriana por imunofluorescência Duplo

  1. Após continuar a cultura de células em meio contendo 1% de FCS e 5 ug / ml de insulina, as células medir todos os dias utilizando um voltohmmeter tecido epitelial. Se as células atingiram um TEER de cerca de 500 Ω x cm², realizar a infecção.
  2. Infectar as células com a suspensão bacteriana preparada a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10. loja as células infectadas na incubadora, a 37 ° C, com 5% de CO 2 durante o período de tempo indicado.
    Nota: O MOI pode ser calculado tendo em conta o número de células por inserção do filtro de cultura de células em confluência (1,21 X 10 6 células / cm2).
  3. Pare o Infectião por lavagem três vezes com meio isento de soro de 500 ul (SFM) contendo albumina de soro bovino 1% (BSA) aplicada ao compartimento do filtro, de 1 ml para o compartimento inferior.
  4. Bloquear com 500 ul de SFM contendo 1% de BSA em tampão de compartimento do filtro e 1 ml no compartimento inferior durante 20 min a temperatura ambiente para evitar a aderência de anticorpos para locais de ligação não específicos.
  5. Incubar com 100 uL de anticorpo primário anti N. meningtidis α-OMP (1: 200) no compartimento de filtro e 500 ul no compartimento inferior durante 20 min à temperatura ambiente.
    Nota: Se for necessário, a concentração de anticorpo deve ser titulada.
  6. Lavam-se as células por aspiração a forma do compartimento do filtro, transferir o elemento filtrante a uma SFM bem com 1 mL preparada contendo 1% de BSA e encher o compartimento de filtro esvaziado com SFM 500 ul contendo 1% de BSA. Repita esta etapa duas vezes.
  7. Fixar as células com 500 uL de 4% de formaldeído no compa filtrortment, 1 ml no compartimento inferior durante 10 min à temperatura ambiente.
  8. Lavam-se as células por aspiração a forma do compartimento do filtro, transferir o elemento filtrante para um poço preparado com 1 ml de PBS e encher o compartimento de filtro esvaziado com 500 ul de PBS. Repita este passo uma vez.
    Nota: As amostras podem ser armazenadas durante a noite em PBS a 4 ° C.
  9. cultura de células fixadas corte filtra das inserções e lava-se com 250 ul de PBS contendo BSA a 1%. Incubar as células durante 15 minutos à temperatura ambiente com 250 ul marcado fluorescente (comprimento de onda de excitação 594 nm) derivado do anticorpo de galinha anti-coelho (1: 500) para corar bactérias extracelulares.
    Nota: Se for necessário, a concentração de anticorpo deve ser titulada.
  10. Permeabilizar as células com 250 ul de PBS contendo 1% de BSA e 0,5% de Triton X-100 durante 1 hora à temperatura ambiente. Lave as células três vezes com 250 ul de PBS contendo BSA a 1%.
  11. Incubar com 250 uL de anticorpo primário anti N. meningitidis α-OMP (1: 200) durante 30 minutos para corar bactérias extra e intracelulares. Lave as células três vezes com 250 ul de PBS contendo BSA a 1%.
  12. Aplicar 250 ul de marcação fluorescente (comprimento de onda de excitação de 488 nm) anticorpo secundário (1: 500), marcado fluorescente (comprimento de onda de excitação de 660 nm) faloidina (1: 250) e 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) dicloridrato de ( 1: 50000) durante 1 h à temperatura ambiente para corar bactérias intracelulares e extra-, citoesqueleto de actina e núcleos.
    Nota: Se for necessário, a concentração de anticorpo deve ser titulada.
  13. Lave as células três vezes com 250 ul de PBS contendo BSA a 1%. Incorporar as células em meio e armazenar a 4 ° C de montagem até à sua análise por meio de microscópio.
  14. Determinar o número de bactérias invadidas por campo predefinido. Faça isso por meio da contagem de 20 campos por membrana de filtro. Calcula-se a percentagem de bactérias invadidas.
    Nota: multiplicar a contagem bacteriana média dos 20 campos microscópicos com um coeffic áreatário. O resultado exprime a quantidade de bactérias totais presentes em uma inserção de cultura de células de filtro de 0,33 cm. Dividir este valor pela quantidade de bactérias cultivadas em meios durante a duração da infecção.

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Resultados

Aqui, descrevemos a cultura e infecção das células HIBCPP num sistema de inserção de cultura de célula invertida. Este modelo nos permite estudar os mecanismos de invasão e as vias de sinalização molecular subjacente a partir do lado da célula basolateral, reproduzindo uma situação fisiológica de bactérias divulgação e entrar nas células epiteliais através da corrente sanguínea (Figura 1).

A...

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Discussão

As células epiteliais do CP formar o BCSFB que separa o CSF a partir do sangue 2,3. Recentemente, estabeleceu a linha de células HIBCPP como um modelo humano funcional do BCSFB. As células apresentam funções de barreira importantes da BCSFB in vitro, incluindo o desenvolvimento de um potencial de membrana elevada, uma baixa permeabilidade de macromoléculas, bem como a presença de filamentos contínuos de TJs 5. As proteínas TJ contribuir para uma polaridade apical / basolateral das...

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Divulgações

The authors have nothing to disclose.

Agradecimentos

The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200-056
4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI)Life TechnologiesD1306
12-well platesStarlabCC7682-7512
24-well platesStarlabCC7682-7524
Anti Neisseria meningitidis α-OMPThis antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany)
Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit)InvitrogenA21441
Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit)InvitrogenA21442
Alexa Fluor 660 PhalloidinInvitrogenA22285
Bovine serum albumine (BSA)Calbiochem12659
Chocolate agar platesBiomerieux43109
Cytochalasin DSigmaC8273
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPESGibco31330-095
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o PhenolredGibco11039-047
Dimethyl sulfoxideSigmaD2650
Fetal calf serum (FCS)Life Technologies10270106
FITC-InulinSigmaF3272
InsulinSigma19278
MgCl2Sigma2393
NaHCO3Sigma55761
PBS + Mg + CaGibco14040-174
Penicillin/StreptomycinMP Biomedicals1670049
PolyvitexBiomerieux55651
Proteose peptoneBD211684
Serum-free mediumGibco10902-096
Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µmGreiner662630
Tissue culture flask 75 cm² red cap sterileGreiner658175
Triton X-100SigmaT8787
Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrodeMilliporeMERSSTX00

Referências

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