Um Protocolo de Avaliação Funcional da Whole-Protein saturação mutagênese Bibliotecas Utilizando-High Throughput Sequencing

Michael Allen Stiffler; Subu K Subramanian; Victor H Salinas; Rama Ranganathan

doi:10.3791/54119

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Neste Artigo

Resumo
Resumo
Introdução
Protocolo
Resultados
Discussão
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Materiais
Referências
Reimpressões e Permissões

Resumo

Nós apresentamos um protocolo para a avaliação funcional de bibliotecas de um único site saturação mutagênese abrangentes de proteínas utilizando sequenciamento de alto rendimento. É importante ressaltar que essa abordagem usa pares de primers ortogonais multiplex construção da biblioteca e sequenciamento. Os resultados representativos utilizando TEM-1 β-lactamase seleccionado a uma dosagem clinicamente relevante de ampicilina são fornecidos.

Resumo

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 β-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to β-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

Introdução

A mutagénese foi longa empregues no laboratório para estudar as propriedades de sistemas biológicos e a sua evolução, e para produzir proteínas mutantes ou organismos com funções melhoradas ou novos. Embora as primeiras abordagens invocado métodos que produzem mutações aleatórias em organismos, o advento da tecnologia de DNA recombinante permitiu aos investigadores a introduzir alterações seleccione a ADN de um modo específico do local, isto é., Mutagénese dirigida ao local ^1,2. Com as técnicas actuais, tipicamente utilizando oligonucleótidos mutagénicos numa reacção em cadeia da polimerase (PCR), é relativamente fácil de criar e avaliar um pequen....