Fenotípica e análise funcional de células reguladoras T ativadas isolados de ratinhos infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica crônica

Resumo

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (T_reg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the T_reg cells.

Resumo

As células T reguladoras _(Treg), que expressam Foxp3 como um factor de transcrição, são subconjuntos de células T CD4 ^+. Células T _reg desempenham um papel crucial na tolerância imunitária e a manutenção da homeostasia através da regulação da resposta imunitária. A função primária de células T _REG é o de suprimir a proliferação de células T _(FEP) T efectoras e a produção de citocinas tais como IFN-γ, TNF-α, e IL-2. Tem sido demonstrado que a capacidade das células T _reg 'para inibir a função das células T _ef é aumentada durante a infecção persistente de agentes patogénicos e o desenvolvimento do cancro. Para esclarecer a função das células T _reg sob repouso ou inflamadas condições, uma variedade de ensaios in vitro utilizando células de supressão de _reg do mouse ou T humana foram concebidas. O principal objetivo deste estudo é desenvolver um método para comparar as diferenças de fenótipo e função supressora entre descanso e _reg T ativadascélulas. Para isolar as células T ativadas _reg, camundongos foram infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV) clone 13 (CL13), a tensão crônica de LCMV. Células T _reg isoladas a partir do baço de ratinhos infectados por LCMV-CL13 exibiu tanto o fenótipo activada e actividade supressora melhorada em comparação com as células em repouso _reg T isoladas a partir de ratinhos ingénuos. Aqui, descrevemos o protocolo básico para ex vivo análise de fenótipo para distinguir células T ativadas _reg de descansar células T _reg. Além disso, descreve-se um protocolo para a medição da actividade supressora de células T _reg totalmente activadas.

Introdução

As células T reguladoras (T _reg) expressam caixa de forkhead P3 (Foxp3) como um fator de transcrição para o seu desenvolvimento e função ^1. Além disso, as células _reg T expressam várias outras moléculas, tais como CD25 ^2, gene de linfócitos-activação 3 (LAG-3) ^3, tumor do receptor do factor de necrose induzida por glucocorticóides ^4, e citotóxica-T-linfócito proteína associada 4 (CTLA-4) ⁵ na sua superfície ou a região intracelular. Durante a infecção crónica com vários tipos de agentes patogénicos, tais como vírus, bactérias ^{6,7 8,9} e parasitas ^10-12, ou no curso de desenvolvimento de câncer ^13,14, as células T _reg tornar-se diferenciado em células ativadas, exibindo função supressora reforçada As células alvo efetoras CD4 ⁺ e CD8 ^+. Um número de estudos sugerem que as células T _reg expandido e de contribuir para os respons de células T CD8 ⁺ com deficiênciae durante amigo retrovírus (FV) infecção por ^15-17. As células _T-reg induzidas FV inibir IFN-γ ou expressão granzima B e reactividade citotóxica de células T CD8 ^{+ 15-17.} Além disso, num modelo de infecção pelo vírus herpes simplex, foi relatado que a depleção de células T CD4 ⁺ _reg CD25 ⁺ resultou na expansão das células T CD8 ⁺ específicas do vírus e lesões graves no tecido por infiltração de células T CD4 ⁺ imunopatogênicos ^18-20.

Os ratinhos infectados cronicamente com o clone 13 de estirpe do vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV CL13) ^21-24 têm sido amplamente utilizados para caracterizar o fenótipo e função de células T efectoras (T) e células _{eff reg} T durante a infecção crónica de vírus. Durante a infecção LCMV persistente, células _eff específico do vírus T progressivamente perdem a sua função efetora e tornar-se células esgotadas T (T _exh). Por outro lado, tcélulas _reg reforçar a sua capacidade de suprimir a resposta de células específicas do vírus T ^25. A diminuição da capacidade de funcionamento das células _eff T pode ser explicada por vários factores, tais como sobre-regulação de receptores inibitórios sobre células _eff T, função alterada das células apresentadoras de antigénio, da produção de citocinas imunorreguladoras, e frequência aumentada ou função aumentada de _reg t As células ^26. Entre os factores envolvidos na supressão de células T, a morte celular programada proteína-1 (DP-1) -expressing _EXH células T e células T _reg têm sido amplamente consideradas como características de persistência do antigénio e ambiente supressiva. Recentemente, relatou-se que o bloqueio da via de DP-1 e de ablação de células T _reg levar a função de células T aumentada e diminuição da carga virai durante a infecção crónica por LCMV ^27. Além disso, as células T _reg são activadas durante a infecção crónica de ratos com LCMV ^23,25 e sua função supressora é reforçada ^25. DP-1 é altamente expressa em células T _reg, bem como células T _{de escape,} e o nível de DP-1 expressa por células T _reg correlaciona-se com a força da sua função supressora de inibir a proliferação de células T ^25.

Aqui, nós descrevemos um método para comparar as características de células T activadas _reg isolados a partir de camundongos infectados com LCMV CL13 e as células T em repouso _reg isoladas a partir de ratinhos ingénuos. Além disso, vamos explicar uma série de processos para separar as células T activadas e _reg examinar o seu fenótipo ex vivo, bem como medir a sua actividade supressora in vitro.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Neste estudo, os ratos foram mantidos em uma instalação livre de patógenos específicos do Centro de Pesquisa Animal Yonsei Laboratory da Universidade de Yonsei. Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes Korean Food and Drug Administration usando protocolos aprovados pelo Comitê Internacional Animal Care e Uso do Centro de Pesquisa Animal Yonsei Laboratory da Universidade de Yonsei.

1. Preparação de Soluções

1. Preparar 2% de meio RPMI por diluição de soro fetal de bovino (FBS) a 2% e penicilina-estreptomicina a 1% em meio RPMI
2. Prepare meios RPMI completo. Para RPMI meios adicionar 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, 1% de L-glutamina, e 50 uM de 2-mercaptoetanol.
3. Prepare activadas por fluorescência separação de células de tampão (FACS). Para o fazer de modo salina, suplemento de fosfato tamponada (PBS) com 2% de FBS.
4. Preparar tampão de isolamento de células T. Para fazê-lo, complementar PBS com 2% de FBS e 2 mM de ethylenediaminetetraaácido cetic.

2. Isolamento de Linfócitos esplénico

1. Remover os baços de ratinhos ingénuos ou CL13 LCMV-infectadas, tal como descrito anteriormente ¹⁹ e colocá-los em 60 mm x 15 mm de placas de Petri contendo 10 ml de 2% de meio RPMI.
   Nota: Neste estudo experiências, de 5 a 6 semanas de idade C57B1L / 6J ratinhos fêmea receberam 2 x 10 ⁶ unidades formadoras de placas (pfu) do LCMV CL13 através de injecção intravenosa através da veia da cauda. Sacrificar os ratinhos no dia 16 pós-infecção (16 d pi) ^25. camundongos normais analisar ge-combinados foram no mesmo dia.
2. Coloque um filtro de células para um tubo de 50 ml e lavado com 2 ml de 2% de meio RPMI. Colocar o baço no filtro celular de 70 ^ m e moer usando o êmbolo de uma seringa. Lavar o filtro de células com 2 ml de 2% meio RPMI e removê-lo do tubo de 50 ml.
3. Encher o tubo com 2% de meio RPMI e centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender osedimento celular em 1 ml de tampão de lise ACK. Incubam-se as amostras à temperatura ambiente (TA) durante 5 min.
   NOTA: O volume de tampão de lise ACK indicado acima é para um baço. Ampliar o volume de conformidade para as amostras de baço agrupadas.
4. Encher o tubo com 2% de meio RPMI e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células a uma densidade de 1 x 10 ⁷ células / ml em meio RPMI completo.
   NOTA: Para a contagem de células vivas, células mancha com azul de tripano e contar apenas as células que não estão manchadas usando hemocitômetro viver.

3. A fenotipagem de Esplênica T convencional (T _conv) e células T _reg

NOTA: antes do isolamento das células T _reg, analisar o fenótipo dos linfócitos do baço isoladas a partir de murganhos naive ou infectadas por coloração das células com anticorpos diferentes e analisadas por citometria de fluxo.

1. Transferir 50 uL das células(5 x 10 ⁵ células) no total de linfócitos do baço em cada poço de uma nova placa de 96 poços de fundo em U e adicionar 150 ul de tampão de FACS por poço. Centrifuga-se a 300 xg durante 2 min a 4 ° C.
2. Descartar o sobrenadante. Agita-se a pelete de células e adicionar 200 ul de tampão de FACS por poço. Centrifuga-se a 300 xg durante 2 min a 4 ° C (2 vezes).
3. Prepara-se o cocktail de anticorpos para marcadores de superfície celular de coloração em 50 ul de tampão de FACS por poço com os seguintes anticorpos e reagentes. corante violeta anti-CD4, anti-CD25 corante verde, anti-DP-1 de corante violeta, anti-CD8-PerCP Cy5.5 corante reagente de detecção e viabilidade celular perto do infravermelho (IR) corante reactivo fluorescente.
   NOTA: Para analisar melhor o fenótipo de células T ativadas _reg, anti-CD103 ^23,25 podem ser adicionados para a coloração de superfície celular marcador.
4. Ressuspender o sedimento celular com 50 ul de coquetel de anticorpo por poço. Incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C. Lavar as células duas vezes comtampão FACS por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C.
5. Após o passo de lavagem final, decanta-se o sobrenadante e as células fixar durante 20 minutos no escuro a 4 ° C com 100 ul de tampão de fixação preparados de acordo com o protocolo do fabricante.
6. Lavar as células duas vezes com o tampão de lavagem permeabilização (preparado de acordo com o protocolo do fabricante) por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C.
7. Preparar a solução de anticorpos para a coloração intracelular Foxp3, e ressuspender o sedimento de células com 50 uL de solução de anticorpo anti-Foxp3.
   NOTA: Para analisar melhor os fenótipos dos _conv T e células T _reg, anti-CTLA podem ser adicionados nesta etapa.
8. Incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C e repetir o passo 3.6. Após o passo de lavagem final, ressuspender o sedimento celular em 200 uL de tampão de SCAF e analisar o fenótipo das células por citometria de fluxo ^25.
9. Portão da popula de células vivasção. Para a análise dos fenótipos de células T _conv durante a infecção LCMV CL13, examinar a frequência de Foxp3 ^- PD-1 ⁺ células entre as células CD4 ⁺ ou T CD8 ^+.
   NOTA: Com base nos resultados experimentais, a percentagem de Foxp3 ^- PD-1 ⁺ é mais do que 50% em populações de células CD4 ⁺ e CD8 ⁺ aos 16 d pi com LCMV CL13.
   1. Para analisar a freqüência e fenótipos de células T _reg, analisar as frequências de Foxp3 ⁺ ou Foxp3 ⁺ PD-1 ⁺ células entre as células T CD4 ^+.
      NOTA: Com base nos resultados experimentais, a percentagem de Foxp3 ⁺ ou ⁺ PD-1 ⁺ células Foxp3 é mais do que 20% da população de células T CD4 ^+, respectivamente.

4. Isolamento de células _reg CD4 ⁺ CD25 ⁺

NOTA: Os volumes de todos os reagentes indicados a seguir são para umao número inicial de células de 1 x 10 ⁷ esplenócitos totais.

1. Prepare as células como descrito na seção 2, utilizando camundongos cronicamente infectados ingênuas e LCMV. Lavam-se as células por adição de 10 ml de tampão de isolamento de células T. Centrifuga-se a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender completamente o sedimento celular em 40 ul de tampão.
2. Para o enriquecimento de células T CD4 ⁺ utilizando o sistema de separação magnética de células, adicionar 10 ul de coquetel de biotina-anticorpo e misturar bem. Incubar durante 10 min a 4 ° C.
3. Adicionar 30 ul de tampão, 20 ul de anti-biotina micro-esferas para marcação das células não-T CD4 ⁺ e 10 ul de anticorpo CD25-PE para marcação fluorescente de células CD25 ^+. Misturar bem e incubar durante 15 min no escuro.
4. Adicionar 2 ml de tampão e passar as células através de um filtro de 40 | iM de células para um novo tubo de 50 mL para remover os detritos celulares. Lavam-se as células por centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.Descartar o sobrenadante e ressuspender completamente o sedimento celular em 500 ul de tampão, a uma densidade de até 1,25 x 10 ⁸ células.
5. Aplicar as células na coluna e recolher as células não marcadas que passam através da coluna. Lava-se a coluna por adição de 2 ml de tampão e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender completamente as isoladas células T CD4 ⁺ em 90 ul de tampão.
6. Para a marcação magnética de células CD25 ^+, adicionar 10 ul de microesferas anti-PE, misturar bem e incubar durante 15 min no escuro a 4 ° C.
7. Adicionar 2 ml de tampão e lava-se as células por centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender completamente o sedimento celular em 500 ul de tampão, a uma densidade de até 1 x 10 ⁸ células.
8. Para enriquecer as células _reg CD4 ⁺ CD25 ⁺ T, se aplicam as células para a coluna para a selecção positiva, e lava-se a ColumN pela adição de 2 ml de tampão. Repetir a lavagem três vezes.
9. Quando a coluna está vazio após o passo de lavagem final, adicionar 1 ml de tampão para a coluna, e expulsar o magneticamente marcada CD4 ⁺ CD25 ⁺ usando o êmbolo.
10. Repita os passos de 4,8-4,9 para melhorar a pureza das células CD4 ⁺ _reg CD25 ⁺ isoladas. Lavam-se as células com tampão de SCAF por centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células isoladas _reg CD4 ⁺ CD25 ⁺ a uma concentração de 2 X 10 ⁶ células / ml em meio RPMI completo.
11. Para verificar a pureza das células isolado _reg-CD4 ⁺ CD25 ^+, utilizar 2 x 10 ⁵ células a partir de células totais os _reg isolado-CD4 ⁺ CD25 ^+. Corar as células com 50 uL de tampão de SCAF contendo anti-CD4-FITC e a viabilidade celular reagente de detecção IV próximo corante reactivo fluorescente.
    NOTA: CD25 já foi marcado com PE durante o isolamento.
12. Incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C. Lavam-se as células com tampão de SCAF por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C. Após a lavagem, ressuspender o sedimento celular em 100 uL de tampão de SCAF e verificar a pureza por citometria de fluxo.
13. Portão da população de células vivas. Para analisar a pureza das células T _reg, confirmar a percentagem de células CD4 ⁺ CD25 ^+.
    NOTA: Com base nos resultados experimentais, a percentagem de células CD4 ⁺ CD25 ⁺ purificadas entre as células é superior a cerca de 80%.

5. Isolamento de células T CD8 ⁺ e marcação de células T CD8 ⁺

NOTA: Os volumes de todos os reagentes indicados a seguir são para um número de células de partida de 1 X 10 ⁷ esplenócitos totais.

1. Prepare células como descrito na seção 2, utilizando camundongos normais. Lavam-se as células por adição de 10 ml de lustre isolamento de células Ter. Centrifuga-se a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante completamente, e ressuspender o sedimento celular em 40 ul de tampão.
2. Para o isolamento de células T CD8 ⁺ utilizando o sistema de separação magnética de células, adicionar 10 ul de coquetel de biotina-anticorpo para a marcação de células não-T CD8 ⁺ e misturar bem. Incubar durante 5 min a 4 ° C.
3. Adicionar 30 ul de tampão e 20 ul de microesferas anti-biotina. Misturar bem e incubar durante 10 min a 4 ° C.
4. Aplicar as células na coluna e recolher as células não marcadas que passam através da coluna. Lava-se a coluna por adição de 2 ml de tampão três vezes.
5. Centrifuga-se a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender completamente os isolados de células T CD8 ⁺ em 2 ml de tampão.
6. Para verificar a pureza das células isoladas, preparar 50 ul de solução de anticorpo em tampão de FACS. Ressuspender as 2 x 10 ⁵ células entre isolado CD8 ⁺ T celLS em 50 ul de solução de anticorpo.
   NOTA: Para preparar solução de anticorpo, adicione anti-CD8 FITC, e reagente de detecção de viabilidade celular (fluorescente near-IR corante reativo) em tampão FACS.
7. Incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C. Lavam-se as células com tampão de SCAF por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C. Após a lavagem, ressuspender o sedimento celular em 100 ul de tampão de FACS, e verificar a pureza das células por citometria de fluxo.
8. Portão da população de células vivas. Para controlar a pureza das células T CD8 ^+, confirmar a percentagem de células T CD8 ^+.
   NOTA: Com base nos resultados experimentais, a percentagem de células CD8 ⁺ purificadas é entre células ao longo de cerca de 90%.
9. Adicionar PBS para as células T CD8 ⁺ isoladas. Centrifuga-se a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante. Ressuspender as células T CD8 ⁺ isoladas a uma concentração de 1 x 10 ⁷ células / ml em PBS.
10. Para identificar o ce CD8 ⁺ Tlls para o ensaio de supressão in vitro, dilui-se a proliferação celular corante de rastreio violeta em PBS para obter uma concentração de 5 | iM à temperatura ambiente.
    NOTA: Os picos de excitação e de emissão aproximadas do corante de rastreio violeta proliferação de células utilizado no estudo são 405 e 450 nm, respectivamente.
11. Misture bem volumes iguais de proliferação celular corante de rastreio violeta (5 uM) e suspensão de células (1 x 10 ⁷ células / ml de células T CD8 ⁺⁾ em um tubo de 15 ml, e incuba-se a 20 min a 37 ° C. Vortex do tubo a cada 10 min.
12. Encher o tubo com frio meio RPMI completo, e deixar o tubo durante 10 minutos à TA. Centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante completamente, e voltar a suspender as células a uma concentração de 2 X 10 ⁶ células / ml com meio RPMI pré-aquecido completas. Incubam-se as células durante 15 minutos à TA.

6. Configurar o Ensaio In Vitro Supressão Usando CD4 ⁺ CD25 ⁺ T _{reg e células T CD8 ⁺}

1. Para preparar anti-CD3 / esferas revestidas com CD28, transferir o volume apropriado de contas magnéticas para um tubo de 15 ml (2,5 ul / 1 x 10 ⁵ células). Adicionar um volume igual de PBS e misturar. Lavar por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. Dilui-se a contas magnéticas em meio completo (50 uL / ​​poço).
2. Alíquota de 50 ul de células _reg CD4 ⁺ CD25 ⁺ por poço da placa de 96 poços de fundo em U (1 x 10 ⁵ células / poço). Adicionar 50 ul de células T CD8 ⁺ como resposta T _{(respectivamente} t) células por poço (1 x 10 ⁵ células / poço). Adicionar 50 ul de anti-CD3 / esferas revestidas com CD28 diluído em por poço.
   NOTA: Nesta etapa, etiqueta e configurar poços de controlo da seguinte forma: "Somente não estimulada de células CD8 ⁺ T" sem anti-CD3 / esferas revestidas com CD28; "Única célula T CD8 ^+" com anti-CD3 / CD28-esferas revestidas; Apenas "células T CD8 ⁺"Com anti-CD3 / esferas revestidas com CD28;". Cell _Reg t apenas "com anti-CD3-/ esferas revestidas com CD28 células _reg T pode ser diluída por meio completo e co-cultivadas com células T _resp numa proporção diferente de T células _resp: células T _reg (1: 0,25-1: 1).
3. Adicionar 50 ul ou volume adequado de suportes em todas as cavidades para o volume total de 200 ul. Cobrir a placa com uma folha e incubar numa incubadora de CO ₂ a 37 ° C durante 72 h.

7. Análise de T CD8 ⁺ de Proliferação Celular e Produção de citocinas a partir de células T CD8 ⁺

1. Para a análise de produção de citocinas, após 3 dias de cultura, separar o sobrenadante de cada poço para outra placa e executar ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA).
   NOTA: O sobrenadante pode ser dividido em alíquotas e armazenado a -70 ° C. Nesta experiência, placa revestida com anticorpo anti-ratinho de IFN-γ foi utilizado para detectar o IFN-γ acordo produçãoing com o protocolo do fabricante s. Para determinar a produção de IFN-γ de proliferação de células T CD8 ⁺ em um nível de uma única célula, coloração de citocinas intracelulares pode ser realizada.
2. Depois de separar o sobrenadante de cada poço, lavar a placa que contém as células com tampão de SCAF e centrifugar a 300 xg durante 2 min a 4 ° C (3 vezes).
3. Após a lavagem, desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento celular com 50 ul de mistura de anticorpos para a coloração de células T CD8 ⁺ proliferaram. Incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C.
   NOTA: Para preparar cocktail de anticorpos, adicione anti-CD4 FITC, anti-CD8 PerCP-Cy5.5 e reagente de detecção de viabilidade celular (fluorescente near-IR corante reativo) em tampão FACS.
   NOTA: Os anticorpos contra vários marcadores tais como CD44 ou CD69 podem ser combinados com outros anticorpos para confirmar a activação de células T CD8 ^+. Lembrar que as células T CD8 ⁺ que já foram rotulados com a proliferação de células de rastreamento violet corante no Passo 5,10.
4. Lavar duas vezes por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C. Após o passo de lavagem final, desprezar o sobrenadante, e fixar as células durante 20 minutos no escuro a 4 ° C com 100 ul de tampão de fixação.
5. Lavar duas vezes por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C. Ressuspender as células com 200 uL de tampão de SCAF e medir a proliferação de células T CD8 ⁺ marcadas com corante de violeta de seguimento de proliferação celular por citometria de fluxo.
   1. Portão de a população de células T CD8 ⁺ entre as células vivas. Medem-se as percentagens de células divididas e não divididas de acordo com a diluição do corante de rastreio violeta a proliferação celular e a diluição de células T CD8 ⁺ de acordo com a seguinte equação. % De Inibição = [(% de células T CD8 ⁺ proliferaram na ausência de células T _reg -% de células T CD8 ⁺ proliferaram na presença de células T _REG) / (% de células T CD8 ⁺ em proliferarama ausência de células T _REG)] x 100. Além disso analisar os dados usando o software de citometria de fluxo ^25.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Geramos camundongos com infecção pelo vírus persistente injetando-os com 2 x 10 ⁶ pfu de LCMV CL13 por via intravenosa. Para investigar as alterações fenotípicas em células _reg T e células T _conv durante a infecção crónica de vírus, linfócitos do baço obtidas a partir de ratinhos não afectados e infectados foram coradas com anticorpos diferentes e analisadas por citometria de fluxo. Aos 16 d pi, PD-1 foi regulada positivamente em ambos Foxp...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Embora apenas um pequeno número de células T _reg existir em ratos e seres humanos, é importante compreender a sua função que desempenham um papel crucial na regulação da resposta imunitária e manutenção da tolerância imunológica. Os números e supressivas funções de T _reg células aumenta durante uma infecção pelo vírus crônica ^15-20, bem como a progressão do câncer ^13,14. Isto é provavelmente devido à estimulação com antigénio continuou. Para avaliar ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
FITC Rat Anti-Mouse CD4	RM4-5	BD Biosciences	553047
Cytofix/Cytoperm		BD Biosciences	554714
U-Bottom Tissue Culture Plates		BD Biosciences	353077
Fixation buffer		BD Biosciences	554655
FITC Rat Anti-Mouse CD25	7D4	BD Biosciences	553072
Cell strainer, 70 mm		BD Biosciences	352350
Cell strainer, 40 mm		BD Biosciences	352340
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1)	29F.1A12	BioLegend	135217
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4	RM4-5	Biolegend	100547
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3	FJK-16s	eBioscience	17-5773
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set		eBioscience	00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a	53-6.7	eBiosicence	45-0081
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA		eBiosicence	BMS606
RPMI 1640		GE Life Sciences	SH30027
PBS (1x)		GE Life Sciences	SH30256
ACK Lysing Buffer		Gibco	A10492-01
L-Glutamine, 200 mM solution		Gibco	25030
Penicillin-Streptomycin, 10,000 U/ml		Gibco	10378-016
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit		Life technologies	L-34975
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse		Miltenyibiotec	130-104-075
CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse		Miltenyibiotec	130-091-041
MACS Separation Columns, LD columns		Miltenyibiotec	130-042-901
MACS Separation Columns, LS columns		Miltenyibiotec	130-042-401
EDTA, 0.5 M (pH 8.0)		Promega	V4231
2-Mercaptoethanol		Sigma Life Science	M7522
Fetal Bovine Serum		Thermo Fisher Scientific	SH30919.03
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit		Thermo Fisher Scientific	C34557
BD Canto II flowcytometer		BD Biosciences
Flowjo		TreeStar
Hematocytomer		Marienfeld superior