Implantação e Gravação do Wireless Eletrorretinograma e Visual Potencial Evocado em ratos conscientes

Resumo

Mostramos procedimentos de implantação e de gravação cirúrgicos para medir sinais eletrofisiológicos visuais do olho (eletrorretinograma) eo cérebro (potencial evocado visual) em ratos conscientes, que é mais análogo à condição humana, onde as gravações são realizadas sem confunde anestesia.

Resumo

O eletrorretinograma de campo total (ERG) e potencial evocado visual (VEP) são ferramentas úteis para avaliar retina e integridade via visual, tanto em laboratórios e ambientes clínicos. Atualmente, pré-clínicos medições ERG e VEP são realizados com anestesia para assegurar a colocação de eletrodos estáveis. No entanto, a presença de anestesia foi mostrado para contaminar respostas fisiológicas normais. Para superar estes confunde anestesia, desenvolvemos uma plataforma inovadora para ensaiar ERG e VEP em ratos conscientes. Eletrodos são implantados cirurgicamente sub-conjunctivally no olho para ensaiar o ERG e epidural sobre o córtex visual para medir a VEP. A gama de amplitude e sensibilidade / parâmetros de tempo são ensaiadas, tanto para o ERG e VEP a aumentar energias luminosas. Os sinais de ERG e VEP são mostrados para ser estável e repetível para, pelo menos, 4 semanas pós-implantação cirúrgica. Esta capacidade de gravar sinais de ERG e VEP sem anestesia confunde nas s pré-clínicosreparativos deve fornecer uma tradução superior aos dados clínicos.

Introdução

O ERG e VEP são minimamente invasivos em ferramentas in vivo para avaliar a integridade das vias da retina e visuais, respectivamente, tanto no laboratório e clínica. O full-campo do ERG produz uma forma de onda característico, que pode ser dividido em componentes diferentes, com cada elemento representando diferentes classes de células da retina ^1,2 percurso. O de campo total ERG forma de onda clássica consiste em um declive inicial negativa (a onda), que foi mostrado para representar fotorreceptor atividade pós exposição à luz ^2-4. A uma onda é seguido por uma forma de onda positiva substancial (b-ondas), que reflecte a actividade eléctrica da retina meio predominantemente, as células bipolares de ^ON-5-7. Além disso, pode-se variar a energia luminosa e inter-estímulo-intervalo para isolar cone de respostas haste ^8.

O flash VEP representa potenciais eléctricos do tronco cerebral e córtex visual em resposta à estimulação da retina luz^9,10. Esta forma de onda pode ser dividido em componentes precoce e tardio, com o componente precoce reflectindo uma actividade de neurónios da via retino-geniculo-estriado ^11-13 e representando a componente de final de processamento cortical realizada de várias lâminas V1 em ratos ^11,13. Portanto medição simultânea do ERG e VEP retorna avaliação abrangente das estruturas envolvidas na via visual.

Atualmente, a fim de gravar eletrofisiologia em animais, a anestesia é utilizada para permitir a colocação estável de eletrodos. Tem havido tentativas de medir ERG e VEP em ratos conscientes ^14-16 mas estes estudos utilizou uma configuração com fio, que pode ser complicado e pode levar ao estresse dos animais através da restrição da circulação de animais e comportamento natural ^17. Com os recentes avanços na tecnologia sem fio, incluindo maior miniaturização e vida útil da bateria, agora é possível implementar uma abordagem de telemetria para ERG umd gravação VEP, diminuindo o estresse associado com as gravações com fio e melhorar a viabilidade a longo prazo. Implantes estáveis ​​totalmente internalizadas de sondas de telemetria provaram ser bem sucedido para monitoramento crônica da temperatura, pressão arterial ^18, a atividade ^19, bem como eletroencefalograma ^20. Tais avanços na tecnologia também vai ajudar com repetibilidade e estabilidade das gravações conscientes, aumentando a utilidade da plataforma para estudos crônicos.

Protocolo

Declaração de ética: Experiências com animais foram conduzidos de acordo com o Código australiano para o Cuidado e Utilização de animais para fins científicos (2013). aprovação ética animal foi obtido a partir Comitê de Ética Animal da Universidade de Melbourne. Os materiais aqui são para experiências de laboratório apenas, e não destinados ao uso médico ou veterinário.

1. Os eléctrodos Preparando

Nota: Um transmissor três canais é usado para implantação cirúrgica que permite 2 ERG e gravação de 1 VEP a ser realizado simultaneamente. Os três ativa e três eletrodos inativos precisam ser pré-moldado em forma de anel antes da implantação, a fim de anexar ao olho. Para fins de identificação, o fabricante tenha fechado eletrodos ativos na metade branco, metade bainhas de plástico coloridos, enquanto eletrodos inativos são cobertos em bainhas de cor completos. O eletrodo terra (claro bainha de plástico) é deixado inalterado. Para todos electr ativos e inativosconduta odes os passos 1.1, 1.2, 1.3 e 1.7.

1. Destorcer o eletrodo de aço inoxidável de cadeia dupla com dois alicates de ponta fina.
2. Apare um dos cordões de aço inoxidável (aproximadamente a 1 cm da ponta), deixando uma cadeia simples mais linear restante para moldar o eléctrodo anular.
3. Dobrar o único fio de aço inoxidável para trás sobre si própria e torção, formando um anel liso na ponta do eléctrodo.
4. Para o ERG eletrodos ativos moda este laço ~ 0,2 - 0,5 mm de diâmetro por torção da base do loop (para a finalidade descrita aqui, forma dois eletrodos ativos desta forma para gravar ERG de ambos os olhos), e para o ERG inativos e eletrodos VEP faça o diâmetro do laço ~ 0,8 mm de diâmetro (neste exemplo, fazer isso para um eletrodo VEP ativo e todos os três eletrodos inativos).
5. Prenda a circular VEP eletrodo ativo em torno de um parafuso de aço inoxidável (diâmetro 0,7 mm, comprimento 3 mm) de modo que o eletrodo fica encostada à cabeça do parafuso.
6. Hook os 3 eletrodos inativos (2 ERG, 1 VEP) em torno de um segundo parafuso de aço inoxidável (diâmetro 0,7 mm, comprimento 3 mm).
7. Puxe a manga de plástico para a frente sobre as pontas afiadas da vertente dois de aço inoxidável para reduzir a irritação.
8. Esterilizar os transmissores de telemetria por imersão em 2% de glutaraldeído durante mais de 10 horas a cerca de 25 ° C. Em seguida, lave o transmissor com solução salina estéril 3 vezes.

2. Transmissor de Implantação

1. Preparação animal
   1. Desinfectar a área cirúrgica antes da experimentação por limpeza com etanol a 70%. Autoclave todo o equipamento cirúrgico antes do uso e manutenção do equipamento em clorexidina quando não em uso durante a cirurgia. Cobrir o animal com um penso cirúrgico durante a cirurgia para manter um ambiente estéril. Garantir que todos os experimentadores usar máscaras cirúrgicas, luvas e aventais estéreis.
   2. Induzir a anestesia com 1,5 - 2% de isoflurano, a um caudal de 3 L / min e manutennido a 1,5 - 2% em 2 L / min durante toda a cirurgia. Confirmar profundidade suficiente de anestesia pela ausência de um reflexo pedal sobre beliscar o músculo entre os dedos.
   3. Raspar uma área de 40 mm x 30 mm no abdómen de cima da virilha ao esterno.
   4. Raspar uma área de 30 mm x 20 milímetros sobre a testa, posterior aos olhos e anterior para os ouvidos.
   5. Desinfectar as duas áreas raspadas. Para a área da testa desinfectar com 10% de iodopovidona três vezes (evitar o uso de anti-sépticos à base de álcool para a área perto do olho, sendo consistente com o padrão de prática estabelecidos pela Associação dos Tecnólogos cirúrgicos). Durante o abdómen desinfecção com 10% de iodo de povidona e 70% de etanol.
   6. Aplicar uma gota de proxymetacaine à córnea para a anestesia tópica adicional.
   7. Aplicar uma gota de carboximetilcelulose de sódio a córnea para evitar a secagem dos olhos.
2. implantação cirúrgica
   1. Adicione uma incisão 10 milímetrosna cabeça ao longo da linha média vertical entre as orelhas com um bisturi cirúrgico.
   2. Adicione uma incisão cinco milímetros no abdómen através da camada de pele ao longo da linha média abaixo do esterno.
   3. Túnel a 5 mm de diâmetro de uma cânula subcutânea da incisão abdominal para a incisão cabeça.
   4. Alimentar os fios dos eléctrodos (3 ativos e inativos 3) do transmissor através da cânula do abdómen para a cabeça.
   5. Deixe o eletrodo de referência com a base transmissor e cobrir a ponta do eletrodo com gaze asséptica.
   6. Cubra as pontas dos eléctrodos (3 ativos e inativos 3) com gaze asséptica.
   7. Fixe a cabeça do rato para uma plataforma estereotáxico.
   8. Estender a incisão testa a 30mm de comprimento com uma tesoura cirúrgica.
   9. Expor área cirúrgica retraindo a pele solta com 2 suturas (3 - 0) em ~ 3 e 9 horas.
   10. Raspe o periósteo que recobre o crânio com gaze esterilizada para expor bregma, lambda e da linha média suturas.
   11. Perfurar dois buracos através do crânio no VEP activa (7 milímetros ventral em relação ao bregma 3 milímetros lateral à linha média) e inactiva (5 mm rostral à bregma na linha média) estereotáxicas co-ordenadas.
   12. Anexar VEP eletrodos ativos e inativos com parafusos pré-inscritos aço inoxidável (diâmetro de 0,7 mm, comprimento 3 mm) para o crânio com uma pequena chave de fenda para ~ 1 mm de profundidade para os buracos premade. Este ancora o parafuso para o osso sem danificar o tecido cortical subjacente.
   13. Para implantar os eletrodos ativos ERG usar um 8-0 sutura para retrair temporariamente a pálpebra superior.
   14. Inserir um 16 a 21 G por via subcutânea cânula de trás do olho através do fundo de saco conjuntival superior.
   15. Remover o guiamento de agulhas.
   16. Alimente o eletrodo ativo através do cateter de plástico encurtado da testa para o olho. Em seguida, remover o cateter de plástico.
   17. Utilize uma sutura temporária (8-0), que é enfiada através do laço eléctrodo, para evitar que os electrode de retrair volta para o túnel.
   18. Adicione uma incisão 0,5 milímetros sobre a conjuntiva superior a 0:00, 1 mm por trás do limbo. Use dissecção cega para expor o esclerótica subjacente.
   19. Implantar um 8-0 ou 9-0 sutura imediatamente atrás do limbo na metade da espessura da esclera.
   20. Remover sutura temporária do ERG eletrodo ativo.
   21. Ancorar o eletrodo ativo ERG à meia escleral sutura espessura amarrando 3 nós consecutivos, garantindo a ponta do eletrodo está situado próximo ao limbo.
   22. Feche a aba conjuntival utilizando 1 a 2 suturas interrompidas (8 - 0 a 9 - 0). Certifique-se que a conjuntiva cobre completamente o eletrodo ERG para melhorar o conforto.
   23. Remover a pálpebra retracção sutura.
   24. Repetir o procedimento para o olho contralateral.
   25. Aplique o gel de cianoacrilato sobre o crânio para proteger todas as parafusos de aço inoxidável e fios de eletrodos. Garantir os eletrodos ativos ERG não são puxados muito apertado antes de fixar a enmovimentos oculares capazes.
   26. Fechar o ferimento na cabeça usando um não-absorvível 3-0 sutura.
   27. Gire roedor para expor região abdominal. Alongar a incisão dérmica abdominal a 40 mm ao longo da linha alba com uma tesoura cirúrgica.
   28. Adicione uma incisão 35 milímetros através da parede interior do músculo para expor a cavidade abdominal interior.
   29. Usando duas suturas (3 - 0) anexar o corpo do transmissor para o lado direito da parede abdominal interna do animal. Evitar o contacto do fígado.
   30. Passe o eléctrodo de terra e seguro nesta forma com uma sutura (3-0). Coloque-lo flutuando livremente na cavidade abdominal.
   31. Feche o peritônio usando uma sutura contínua (3-0).
   32. Feche a incisão na pele usando suturas interrompidas (3 - 0).
3. Cuidados pós-operatórios
   1. Monitorar o animal até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Casa do animal individualmente após a cirurgia.
   2. administrar carprofen por via subcutânea para a analgesia (5 mg / kg) uma vez por dia durante 4 dias.
   3. Adicionar antibióticos orais profiláticos (Enrofloxin, 5 mg / kg) para a água potável durante 7 dias pós-cirurgia.
   4. Aplicar uma pomada anti-inflamatória a locais de incisão da pele para reduzir a irritação durante os primeiros 7 dias pós-cirurgia.

3. Conduta ERG e VEP Recordings em ratos conscientes

1. Escuro adaptar animal durante 12 h antes de registos de ERG e VEP
2. Efectuar todas as manipulações experimentais sob iluminação fraca vermelha (17,4 cd.m ^-2, λ _max = 600 nm)
3. Aplicar anestesia tópica (0,5% proxymetacaine) e dilatando (0,5% de tropicamida) cai para a córnea.
4. Orientar o roedor consciente em um personalizado feito restrainer, claro.
   Nota: O comprimento deste tubo de plástico pode ser ajustado para acomodar diferentes de tamanhos ratos com o diâmetro total fixado em 60 mm. A extremidade dianteira do dispositivo é afunilada para minimizar cabeça movimento e contém perfurações para permitir a respiração normal. Esta frente afunilada permite o alinhamento e estabilização da cabeça e os olhos do rato para a abertura da esfera Ganzfeld. Note-se que o roedor tem sido aclimatizadas ao limitador (3 a 5 vezes) antes da cirurgia.
5. Colocar o roedor na frente da bacia Ganzfeld com os olhos alinhada com a abertura da bacia.
6. Ligue o transmissor habitação por meio de um ímã dentro de ~ 5 cm do transmissor. Verifique se o transmissor está ligado, verificando o LED de status na base do receptor.
7. Recolhe sinais a uma variedade de energias luminosas (ou seja, -5,6 a 1,52 log cd.sm ^-2) conforme descrito anteriormente ^21. Resumidamente, médios mais sinais nos níveis de intensidade da luz de luz (~ 80 repetições) e menos nas energias mais brilhante luminosos (~ 1 repetição). Gradualmente aumentar o intervalo interstimulus de 1 a 180 segundos do mais obtuso para o nível de luz mais brilhante.
8. Para isolar a haste do ERGe as respostas de cone utilizar um paradigma twin-flash ^8. Por exemplo, iniciar dois flashes em cd.sm 1,52 log ^-2 com um intervalo inter-estímulo de 500 ms no meio.
9. Para gravar sinais VEP, média de 20 repetições para as energias mais brilhante luminosos (ou seja, 1,52 log cd.sm ^-2, 5 seg intervalo inter-estímulo).
10. Para avaliar a estabilidade do implante, o que é avaliado por variabilidade do sinal ao longo do tempo, realizar registos de ERG e VEP 7, 10, 14, 21 e 28 dias pós-cirurgia.
11. Seguindo período experimental, os ratos eutanásia por meio de injecção intracardíaca de pentobarbiturate (1,5 ml / kg) depois de cetamina: xilazina anestesia (12: 1 mg / kg).

Resultados

A resposta de fotorreceptores é analisada por montagem de uma Gaussiana retardada até ao bordo dianteiro do ramo descendente inicial da resposta do ERG no topo 2 energias luminosas (1,20, 1,52 log CSM ^-2) para cada animal, com base no modelo de carneiro e Pugh ^22, formulada por Hood e Birch ^23. Esta fórmula retorna uma amplitude e um parâmetro de sensibilidade, (Figura 1C e 1D, respectivamente). Uma função hiperból...

Discussão

Devido à natureza minimamente invasiva da eletrofisiologia visual, registos de ERG e VEP em pacientes humanos são conduzidos sob condições conscientes e exigem o uso apenas de anestésicos tópicos para a colocação do eletrodo. Em contraste, eletrofisiologia visual em modelos animais é convencionalmente realizado sob anestesia geral para permitir a colocação do eletrodo estável, eliminando movimentos oculares e corporais voluntárias. No entanto, anestésicos gerais comumente utilizados alterar as respostas do...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioamplifier	ADInstruments	ML 135	Amplifies ERG and VEP signals
Carboxymethylcellulose sodium 1.0%	Allergan	CAS 0009000-11-7	Maintain corneal hydration during surgery
Carprofen 0.5%	Pfizer Animal Health Group	CAS 53716-49-7	Post-surgery analgesia, given with injectable saline for fluid replenishment
Chlorhexadine 0.5%	Orion Laboratories	27411, 80085	Disinfection of surgical instrument
Cyanoacrylate gel activator	RS components	473-439	Quickly dries cyanoacrylate gel
Cyanocrylate gel	RS components	473-423	Fix stainless screws to skull
Dental burr	Storz Instruments, Bausch and Lomb	E0824A	Miniature drill head of ~ 0.7 mm diameter for making a small hole in the skull over each hemisphere to implant VEP screws
Drill	Bosch	Dremel 300 series	Automatic drill for trepanning
Enrofloxin	Troy Laboratories		Prophylactic antibiotic post surgey
Ganzfeld integrating sphere	Photometric Solutions International		Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size
Gauze swabs	Multigate Medical Products Pty Ltd	57-100B	Dries surgical incision and exposed skull surface during surgery
Isoflurane 99.9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for VEP electrode implant surgery
Kenacomb ointment	Aspen Pharma Pty Ltd		To reduce skin irritation and itching after surgery
Luxeon LEDs	Phillips Lighting Co.		For light stimulation, twenty 5 W and one 1 W LEDs, controlled by Scope software
Needle (macrosurgery)	World Precision Instruments	501959	for suturing abdominal and head surgery, used with 3 - 0 suture, eye needle, cutting edge 5/16 circle Size 1, 15 mm
Needle holder (macrosurgery)	World Precision Instruments	500224	To hold needle during abdominal and head surgery
Needle holder (microsurgery)	World Precision Instruments	555419NT	To hold needle during ocular surgery
Optiva catheter	Smiths Medical International LTD	16 or 21 G	Guide corneal active electrodes from skull to conjunctiva
Povidone iodine 10%	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	Proprietory name: Betadine, Antiseptic to prepare the shaved skin for surgery 10%, 500 ml
Powerlab data acquisition system	ADInstruments	ML 785	Acquire signal from telemetry transmitter, paired to telemetry data converter
Proxymetacaine 0.5%	Alcon Laboratories	CAS 5875-06-9	Topical ocular analgesia
Restrainer	cutom made		Front of the restrainer is tapered to minimize head movement, length can be adjusted to accommodate different rat length, overall diameter is 60 mm.
Scapel blade	R.G. Medical Supplies	SNSM0206	For surgical incision
Scissors (macrosurgery)	World Precision Instruments	501225	for cutting tissue on the abodmen and forhead
Scissors (microsurgery)	World Precision Instruments	501232	To dissect the conjunctiva for electrode attachment
Scope Software	ADInstruments	version 3.7.6	Simultaneously triggers the stimulus via the ADI Powerlab system and collects data
Shaver	Oster	Golden A5	Shave fur from surgical areas
Stainless streel screws	MicroFasteners	L001.003CS304	0.7 mm shaft diameter, 3 mm in length
Stereotaxic frame	David Kopf	Model 900	A small animal stereotaxic instrument for locating the implantation landmarks on the skull
Surgical drape	Vital Medical Supplies	GM29-612EE	Ensure sterile enviornment during surgery
Suture (macrosurgery)	Ninbo medical needles	3-0	for suturing abdominal and head surgery, sterile silk braided, 60 cm
Suture needle (microsurgery)	Ninbo medical needles	8-0 or 9-0	for ocular surgery including, suturing electrode to sclera and closing conjunctival wound, nylon suture, 3/8 circle 1 × 5, 30 cm
Telemetry data converter	DataSciences International	R08	allows telemetry signal to interface with data collection software
Telemetry Data Exchange Matrix	DataSciences International		Gathers data from transmitters, pair with receiver
Telemetry data receiver	DataSciences International	RPC-1	Receives telemetry data from transmitter
Telemetry transmitter	DataSciences International	F50-EEE	3 channel telemetry transmitter
Tropicamide 0.5%	Alcon Laboratories		Iris dilation
Tweezers (macrosurgery)	World Precision Instruments	500092	Manipulate tissues during abdominal and head surgery
Tweezers (microsurgery)	World Precision Instruments	500342	Manipulate tissues during ocular surgery