Transdução retroviral de Células de Medula Óssea progenitoras para gerar células T Receptor Retrogenic Mice

Resumo

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Resumo

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCRα and TCRβ chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

Introdução

Receptor de células T (TCR) repertório de ratinhos e seres humanos tem sido estimado em 1 x 10 ⁸ e 2 x 10 ⁶ TCR únicos respectivamente ^1,2. Esta grande diversidade permite que as células T a reconhecer uma vasta gama de epitopos de antigénios derivados de auto-péptidos, bem como a partir de agentes patogénicos apresentados pelo complexo de histocompatibilidade principal (MHC) sobre as células apresentadoras de antígenos (APCs). As diferenças sutis nas interações das TCRs com complexos exclusivos péptido-MHC ditar se uma célula T vai sofrer apoptose, anergia, activação, diferenciação, produção de citocina ou citotoxicidade. No entanto, devido ao grande repertório de TCR, como análise de um TCR específico irá responder a um antigénio particular, exige o uso de sistemas de TCR únicos.

Vários ratinhos transgénicos TCR ter sido gerada, a fim de estudar a função de um único TCR num modelo in vivo ^3-9. No entanto, é preciso tomar cuidado para ratinhos transgénicos TcR incluindo oo custo, o período de tempo para gerar um único ratinho transgénico e o assim chamado efeito fundador da inserção do transgene no ADN da linha germinal aleatória ^10. Assim, relativamente poucos ratinhos transgénicos TCR ter sido gerado para um dado antigénio e as implicações funcionais de alta e baixa afinidade do TCR para o mesmo epitopo raramente são abordados. Para abordar a necessidade de uma abordagem rápida para a tela e estudar vários TCRs individualmente ou em combinação, ratinhos retrogenic ( "retro" de retrovírus e 'genicas' de transgénica) têm sido utilizadas como uma alternativa para ratinhos transgénicos TcR ^11-13.

O motivo de consenso péptido 2A encontrado dentro de vários vírus consistem de uma 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, em que a clivagem ocorre entre a glicina da 2A e a prolina do 2B de cis actuando atividade hidrolase, resultando em pular do ribossoma durante a tradução ^10,14-16. Para um diagrama detalhado mostrando a Cleavage dos vários péptidos 2A (F2A, E2A, T2A e P2A) consulte referências 10 - 12. Desta maneira, 2 cistrões (TCR alfa e beta de TCR) pode ser ligado resultando em tradução estequiométrica num único vector. Utilizando esta abordagem, somos capazes de expressar e comparar diretamente vários TCRs específicas de antígeno in vivo.

Protocolo

Declaração de Ética: Todo esforço é feito para manter o desconforto animal ou stress a um mínimo durante a irradiação e na veia da cauda injeções. Os ratos são usados ​​como uma fonte de células nestas experiências; como tal, não existem procedimentos ou manipulações para além da eutanásia. Os ratos serão sacrificados por inalação de _CO2, seguido por deslocamento cervical para confirmar a morte. Este procedimento é consistente com as recomendações do Painel sobre a eutanásia da American Veterinary Medical Association.

1. Prepare Retroviral Construir

1. Sub-clone da cadeia do receptor de células T (TCR) alfa e beta, separadas por um ligante 2A, num retroviral ¹¹ de vectores baseado em MSCV (exemplo, pMIAII ou pMIGII) ^11.
   NOTA: O vinculador 2A permite a expressão estequiométrica e concordantes das cadeias alfa e beta de TCR de uma única estrutura de leitura aberta. O vector inclui uma cassete IRES proteína fluorescente (GFP ou ametrine) que é usado pararastrear as células transduzidas e eficiência de transdução. Para um protocolo detalhado consulte Holst et al ^11.
2. Isolar o plasmídeo de ADN utilizando o kit de preparação de plasma obtidos comercialmente ou de um produto semelhante. Usar uma concentração de trabalho de 1 - 2 mg mL ^-1.

2. Geração de retrovirais Produtor linhas celulares

1. Utilizar um processo de dois passos para produzir as linhas celulares produtoras retrovirais.
   NOTA: Para um protocolo detalhado, por favor consulte Holst et al ^11..
   1. Gerar retrovírus por transfecção transitória de células 293T com três plasmídeos (pVSVG, PEQ-Pam3 (-e) e vector de interesse ¹¹⁾ e tomar o sobrenadante retroviral a partir de células 293T para transduzir a linha celular produtora retroviral ecotr�ica GP + E86.
   2. Isolar o top 40% dos que expressam células produtoras GP + E86 fluorescentes por FACS e propagar as células produtoras + E86-GP transdcuced como fonte de vírus.
      NOTA: A geraçãode produtores de título elevado é crítico para a transdução eficiente de células de medula óssea. Para um protocolo completo, por favor ver Holst et al. ¹¹

3. Retrovirus-transferência de genes mediada Stem Cell (Dia -5)

1. Descongelar e cultura -1,0 0,5 x 10 ⁶ de cada linha celular produtora GP + E86 em DMEM completo de 10% (vol / vol) de FBS para permitir um crescimento suficiente para duas placas confluentes de 150 mm por dia 0 do presente protocolo.
   NOTA: O descongelamento 0,5-1,0 x 10 ⁶ de cada linha celular produtora GP + E86 numa placa de 10 centímetros permitirá para 30 - 50% de confluência no dia 5. Isto também permite a 5 dias de cultura, a fim de expandir a GP + E86 linhas de células produtoras de duas placas confluentes de 150 mm por dia 0.
   1. A linha celular produtora retroviral cultura em meios de cultura de tecidos completo contendo 5% de soro de vitelo feta, e ciprofloxacina (10 ug / ml) para evitar contaminação por micoplasma.
      NOTA: Interrompa o uso da ciprofloxacina em generating o sobrenadante virai para a transdução de medula óssea. Evitar o excesso de crescimento da linha celular produtora, como isso vai impactar negativamente a medula óssea eficiência de transdução.

4. Os ratinhos dadores Inject com 5-fluorouracilo (5-FU) (dia -3)

1. Pesa-se a ratinhos dadores (5 - 12 semanas de idade) para determinar a quantidade de 5-FU necessária. Usando camundongos com idade inferior a 5 semanas de idade resulta em baixo rendimento de medula óssea. Para assegurar a expressão de uma única TCR, utilizar uma estirpe de ratinhos deficientes em células T, tais como SCID, pano ou alfa de TCR ratinhos deficientes como dadores de medula óssea.
2. Trabalhando no capuz de cultura de tecidos, diluir o estoque de 5-FU com PBS esterilizado a fim de fazer uma quantidade suficiente de 10 mg ^mL-1 de solução de trabalho de 5-FU para proporcionar 0,15 mg de 5-FU por grama de peso corporal.
3. Usando uma seringa de 1 ml com uma agulha 37 G, intraperitoneal injectar 0,15 mg de 5-FU por grama de peso do corpo por murganho dador.
   NOTA: Use o mouse 1 doadores por um destinatário para iniciar e ajustaro número de ratinhos dadores de acordo com o rendimento celular. Um método alternativo para o tratamento com 5-FU para o enriquecimento e isolamento de células progenitoras de medula óssea é a selecção negativa de células positivas como descrito em linhagem Viret et ai.

5. Procedimento de Extracção de Medula Óssea (Dia 0)

1. Obter tesouras de dissecação e pinças para isolamento óssea. Prepare meios (HBSS suplementado com FCS a 5% (vol / vol)) para recolher ossos em um tubo de 50 ml. Manter 50 ml cónico contendo media no gelo. Eutanásia ratos por inalação de _CO2, seguido por deslocamento cervical para confirmar a morte. Comprima pata para garantir que não haja reflexos são detectados.
2. Esterilizar o local da cirurgia e instrumentos cirúrgicos com etanol ou metanol. Remova o fêmur, tíbia, úmero e cintura pélvica com cuidado pelo primeiro corte e sob a cintura pélvica. Cortar para trás para baixo ao longo do fêmur à tíbia. Remover todo o tecido circundante usando tesouras e pinças para obter ossos limpos. Guardaossos hidratadas em HBSS + 5% (vol / vol) de FBS.
3. Separar os ossos através do corte nas articulações, certificando-se de cortar ambas as extremidades fora de cada osso. Inserir uma agulha de calibre 25 ligada a uma seringa de 10 ml contendo HBSS + 5% (vol / vol) de FBS. Aplique pressão e lave tudo de medula óssea através de um descanso coador de 70 mícrons em um cônico de 50 ml.
4. Periodicamente, empurrar a medula óssea através do filtro de 70 um utilizando o êmbolo de uma seringa de 1 ml ou 3 ml. Lavar o filtro com HBSS + 5% (vol / vol) de FBS. Isto irá assegurar uma suspensão de célula única que é livre de fragmentos de osso e de tecido. Manter as células estéreis realizando o procedimento em uma capa estéril.
5. Centrifugar as células da medula óssea a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.

6. Medula Óssea Cultura (Dia 0)

1. Decantar ou aspirar mídia e sedimento de células ressuspender em tampão de 1 ml de amônio base de cloreto de lise de sangue vermelho (ou RBC tampão de lise equivalente) por tubo de 50 ml. Depois de 1 min de incubação a salatemperatura, extinguir o tampão de lise de glóbulos vermelhos por adição de 10 ml de DMEM completo 20% (vol / vol) de FBS.
2. células centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
3. Decantar ou aspirar o sobrenadante e ressuspender medula óssea em 5 ml de DMEM completo 20% (vol / vol) de FBS. Contar as células com uma câmara de contagem de Neubauer.
   NOTA: rendimento geral deve ser aproximadamente 5-10 x 10 ⁶ culas por rato; No entanto, o rendimento pode variar entre diferentes estirpes de ratinhos.
4. Células da medula óssea placa a uma densidade de 4 x 10 ⁷ culas por placa de 150 mm em 30 ml de DMEM completo 20% (vol / vol) de FBS suplementado com IL-3 (20 g ^ml-1), IL-6 (50 g ml ^-1) e SCF (50 g ml ^-1).
   NOTA: Use citocinas recém-descongeladas-alíquotas. Não utilizar citocinas que foram congeladas e descongeladas mais do que uma vez ou mantidas a 4 ° C durante mais de 2 semanas.
5. Incubar a medula óssea durante a noite (aproximadamente 24 horas) a 37 ° C com 5% de CO _2.

7. Cultura Produtor retroviral celular (Dia 0)

1. A placa 3 x 10 ⁶ células produtoras retrovirais por placa de 150 mm em 18 ml de DMEM completo 20% (vol / vol) de FBS.
2. Incubar as células produtoras retrovirais a 37 ° C durante a noite. Antecipar uma placa de 150 mm por 15 milhões de células da medula óssea (cerca de 2 - 3) Os ratinhos dadores.

8. Retroviral O sobrenadante (Dia 1)

1. No dia seguinte (aproximadamente 24 horas mais tarde), recolher o sobrenadante retroviral a partir das placas de produtores (criado no passo 7) pela elaboração do sobrenadante retroviral diretamente fora da placa de 150 mm com uma seringa de 10 ml e filtrar através de um 0,45 -μm filtro de seringa.
2. Cuidadosamente substituir o sobrenadante retroviral removido com 18 ml de DMEM fresco completo de 20% (vol / vol) de FBS.
3. Suplementar o sobrenadante retroviral filtrada com IL-3 (20 g ^mL-1), IL-6 (50 g ml ^-1), MSCF (50 g ml ^-1) e brometo de Hexadimetrina (polibreno) (6 &# 956; g ml ^-1).
   NOTA: O brometo de Hexadimetrina deve ser feita a cada 2 meses para evitar uma queda na eficácia de transdução retroviral.

9. Medula Óssea Harvest (Dia 1)

1. Depois de completar o passo 8.3, a colheita das células de medula óssea a partir do Passo 6.4 e transferir o meio contendo células não aderentes em tubos estéreis de 50 ml.
2. Lavar as placas vigorosamente com 10 ml de PBS e em recolher a 50 mL cónico a partir do passo 9.1. Se necessário, repita o passo de lavagem.
3. Centrifugar as células a 300 xg durante 10 min a 4 ° C, decanta-se o sobrenadante, ressuspender as células em um pequeno volume (1 - 3 ml de DMEM completo) a 20% (vol / vol) de FBS, e contar. Antecipar 50 - recuperação de 75% a partir do dia 0. Ressuspender medula óssea a 1 x 10 ⁶ células por 1 ml de sobrenadante retroviral contendo citocinas e brometo de Hexadimetrina.

10. Medula Óssea Transdução (Dia 1)

1. Placa do sobrenadante / ma óssea retroviralrrow mistura a um volume de 3 ml por poço numa placa de cultura de tecidos de seis poços. Enrole as placas em plástico para minimizar a troca de gás durante a centrifugação na etapa 10.2.
2. Rodar as placas de seis poços embrulhadas em 1000 xg durante 60 min a 37 ° C.
3. Após a rodada é concluída, retire o filme plástico e coloque as placas em uma incubadora a 37 ° C CO ₂ durante 24 h.

11. Retroviral sobrenadante e Transdução (Dia 2)

1. Após 24 horas, recolher o sobrenadante viral fresco a partir da linha celular produtora viral. Filtra-se o sobrenadante retroviral, utilizando uma seringa de 10 ml e um filtro de seringa de 0,45? M. Suplementar o sobrenadante filtrado retroviral com IL-3 (20 g ^mL-1), IL-6 (50 g ml ^-1) e SCF (50 g ml ^-1) e brometo de Hexadimetrina (6 g ml ^-1).
2. Em seguida, remover cuidadosamente com uma pipeta ou aspirar os melhores 2 ml de meio de cada poço da placa de seis poços contendo as células da medula óssea.
   NOTA: trabalhar com cuidado para não aspirar a medula óssea, o que é normalmente concentrada no meio do poço. Alternativamente, o sobrenadante é removido pode ser centrifugada para recuperar as células de medula óssea perdida.
3. Para cada poço na medula óssea placa de 6 poços adicionar 3 ml de sobrenadantes contendo citoquinas frescas virais e brometo de Hexadimetrina. Enrole as placas em plástico, e repetir a transdução de centrifugação a 1000 xg durante 60 min a 37 ° C. Desenrole as placas e incubar as células a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante a noite (cerca de 24 hr).

12. A adição de DMEM fresco suplementado (dia 3)

1. Após 24 h, remover os melhores 2 ml de meio de cada poço da placa de seis poços contendo as células da medula óssea, como no passo 11.2. Substituir a mídia removido com DMEM fresco de 20% (vol / vol) de FBS suplementado com concentrações finais de IL-3 (20 g ^mL-1), IL-6 (50 g ml ^-1) e SCF (50 g ml ^-1) .
2. Incubar medula ósseaplacas a 37 ° C incubadora de CO ₂ durante mais 24 h.

13. Colheita transduzidas de Medula Óssea (dia 4)

1. Após 24 horas, recolher as células da medula óssea a partir das placas de seis poços. Lavam-se as placas com PBS vigorosamente para remover todas as células não-aderentes.
   1. Centrifugar as células a 300 xg durante 10 min a 4 ° C e decanta-se o sobrenadante.
   2. Ressuspender a medula óssea em um pequeno volume (1 ml) de PBS + 0,5% (vol / vol) de FBS inactivado pelo calor. Manter as células no gelo.
2. Retirar uma amostra de 10 ul de cada condição de medula óssea e contar as células utilizando uma câmara de contagem de Neubauer. Assumindo 1-2 dador por destinatário, o rendimento será suficiente para transferir, pelo menos 4 x 10 ⁶ culas por rato destinatário. Ressuspender a medula óssea em um volume suficiente de PBS + 0,5% (vol / vol) de FBS inactivado pelo calor a injectar 200 - 300 ul por rato.
   1. Injectar pelo menos 2 x 10 ⁶ células, com uma eficácia de transduçãode 25% (pode injectar-se a 8 x10 ⁶ células) por rato por via intravenosa.
      NOTA: Rotineiramente injectar cinco ratos receptores por duas placas de 6 poços de células de medula óssea. Se o rendimento é substancialmente inferior, mais ratinhos dadores deve ser utilizado até que o número de medula óssea suficiente pode ser obtida. A fim de alcançar a reconstituição óptima, pelo menos 5 x 10 ⁵ transduzidas (fluorescente positivo) deve ser injectada em cada destinatário.
3. Com uma micro pipeta, tomar uma amostra de 10-ul de cada condição de medula óssea e analisar a eficiência de transdução por citometria de fluxo com base na expressão do marcador fluorescente (Figura 1A) ^11.
   NOTA: De um modo geral, a percentagem de células positivas fluorescentes é entre 25% e 70%, dependendo da construção e titulação retroviral. O número de células de medula óssea transduzidas necessário reconstituir um rato irradiam sub-letalmente pode variar, dependendo da eficiência de transdução. Quanto menor o transduction eficiência, as células de tutano de osso mais necessária e, inversamente, quanto maior a medula óssea eficiência de transdução, o menor número de células necessário para a reconstituição. eficiência de transdução abaixo de 25% é a ideal e pode resultar em reconstituição e sobrevivência insuficiente. A fim de assegurar a recuperação da medula óssea ótima e eficiência de transdução, usar a mídia e citocinas recém-preparadas de cultura de tecidos. Quando se expressa um novo TCR utilizando o sistema retrogenic, a selecção de TCR que in vivo é desconhecida. Dependendo de cada indivíduo afinidade de TCR, de TCR selecção no timo e expressão da célula T periférica ¹⁷ variará.

14. rato irradiação, Bone Marrow Injection e Cuidados

1. Irradiar camundongos um dia antes da injecção de medula óssea (mesmo dia que passo 13). Use as seguintes doses: camundongos C57BL / 6 (e outras estirpes do tipo selvagem), 900 rads; RAG1 ^{- / -} ratos, 500 rads; SCID, 300 rads).
   1. ratinhos receptores lugar sobre amoxicilina (50 mg / kg / dia) ou outro antibiótico de tratamento de água, antes da irradiação, e continuar a antibióticos para as primeiras duas semanas após a injecção de medula óssea.
      NOTA: dose de irradiação óptimo pode ter que ser determinadas empiricamente.
2. Para injecção, carregar as células do Passo 13.1 para uma seringa de 1 ml com agulhas grossas imediatamente antes da injeção, em seguida, mudar a agulha de calibre 27 para injecção, expelir o ar para evitar embolia aérea. camundongos calor sob uma lâmpada de aquecimento e injetar 0,2 ml de medula óssea por rato por via intravenosa.
   NOTA: Não deixe que as células se sentar na seringa por qualquer período de tempo ou as células vão resolver.
3. Monitorar os camundongos semanalmente para garantir que eles permaneçam saudáveis.
4. Depois de 5 - 6 semanas, os ratinhos sangrar para verificar para reconstituição com base de GFP + / + ametrina e co-expressão de TCR (Figura 1B) ^11.

Resultados

Osso eficiência de transdução de medula é verificada no passo 13.3 do protocolo antes de a medula óssea é injectado no IV na veia da cauda Na medula óssea representante transdução figura (Figura 1A), cerca de 10 uL da medula óssea colhidas foi adicionado a 100 ul de PBS e analisadas quanto à expressão ametrina. Geralmente, a percentagem de células positivas fluorescentes é entre 25% e 70%, dependendo da construção e titulação retroviral. Após a injecç...

Discussão

No protocolo, detalhamos vários passos críticos para garantir a saúde da medula óssea ideal, eficiência de transdução e reconstituição. Primeiro passo crítico é a geração e manutenção das células produtoras viral GP + E86. Use linhas celulares produtoras passagem precoce e manter a 80% de confluência ou inferior antes de ser utilizado. Ao fazer células produtoras viral GP + E86 frescos, garantir as células 293T são passagem precoce e crescente em cultura durante 24-48 horas. Chapeamento de muitas cé...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, high glucose + glutamine	Corning Cellgro	10-013-CV	Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate
FBS	Atlanta Biological	S11550
Trypsin-Versene	Lonza	17-161F
0.45 µm syringe filter	Thermo Scientific	194-2545
polybrene	Sigma	H9268-10G	Sterile Filtered in dH2O
Ciprofloxacin	VWR	AAJ61970-06
5-fluorouracil (5-FU)	VWR	AAA13456-06
Sodium Pyruvate	Corning Cellgro	25-000-CI
MEM nonessential Amino Acids	Corning Cellgro	25-025-CI
HEPES 1 M solution	Corning Cellgro	25-060-CI
2-Mercaptoethanol	Gibco by Life Technologies	21985-023
Pen/Strept	Corning Cellgro	30-002-CI
L-glutamine	Corning Cellgro	25-005-CI
150 mm tissue culture dishes	Greiner Bio-one	639160
Tisue culture-treated 6-well flat plate	Greiner Bio-one	657160
70 µm nylon cell strainers	Falcon	352350
Mouse IL-3	Invitrogen	PMC0033
Human IL-6	Invitrogen	PHC0063
Mouse Stem Cell Factor	Invitrogen	PMC2113L
10x PBS	Corning Cellgro	46-D13-CM
HANKS Buffer	Corning Cellgro	21020147
BD 10 ml Syringe	BD	300912
BD 1 ml Syringe	BD	309659
27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle	BD	305109
30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle	BD	305106