Detecção de proteínas de ligação a ARN pela<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down em Cultura adipócito

Resumo

Um protocolo de pull-down ARN é optimizado aqui para a detecção de interacções entre proteínas de ligação a ARN (RBPs) e não-codificante, bem como ARN de codificação. Um fragmento de ARN a partir do receptor de androgénio (AR) foi usado como um exemplo para demonstrar como recuperar a sua RBP de lystate de adipócitos primários castanhos.

Resumo

proteínas de ligação a ARN (RBPs) estão a emergir como uma camada reguladora no desenvolvimento e função do tecido adiposo. RBPs desempenhar um papel-chave na regulação da expressão de genes aos níveis pós-transcricional por afectar a estabilidade e eficiência de translação de ARNm alvo. técnica pull-down ARN tem sido amplamente utilizado para estudar a interacção RNA-proteína, que é necessário para elucidar o mecanismo subjacente a função ', bem como RNAs não-codificantes longos' RBPs (lncRNAs). No entanto, a abundância de lípidos alta nos adipócitos representa um desafio técnico na realização deste experimento. Aqui, um protocolo de pull-down RNA detalhada é otimizado para a cultura de adipócitos primário. Um fragmento de RNA a partir de (AR) «Região do receptor de andrógeno 3 não traduzida (3'UTR) contendo um elementwas rica adenilato-uridilato usados ​​como exemplo para demonstrar como recuperar seu parceiro RBP, proteína Hur, de lystate adipócitos. O método descrito aqui pode ser aplicado para detectar as interacções entreRBPs e RNAs não codificadoras, bem como entre RBPs e RNAs de codificação.

Introdução

RBPs são proteínas que se ligam ao ARN de cadeia dupla ou simples em células e participam na formação de complexos de ARN-proteína. RBPs pode ligar-se uma variedade de espécies de ARN, incluindo ARNm e ARN não codificantes longos (lncRNAs), e exercem a sua influência aos níveis pós-transcricional. Ambos os RBPs e lncRNAs estão emergindo como novos reguladores no desenvolvimento adiposo e funcionar ^1,2,3. Para compreender o mecanismo de RBP- e regulação mediada por lncRNA de vias celulares, é muitas vezes necessário para detectar a interacção entre uma molécula de ARN específica e um ou vários RBPs, e, por vezes, para identificar o espectro completo de parceiros proteicos de um ARN transcrição. No entanto, a experiência pode ser um desafio devido ao seu elevado teor de lípidos em adipócitos. O ARN protocolo suspenso descrito aqui pode ser utilizado para recuperar os parceiros de proteína de um RNA específico a partir dos lisados ​​de culturas de adipócitos primários ^4,5.

Justificativa para este protoCol é resumido como se segue. Um isco ARN é transcrito in vitro a partir de um molde de ADN, e conjugado com estreptavidina-revestida esferas magnéticas ⁴ marcado com biotina. O isco de ARN é incubada com lisados ​​celulares para permitir a formação de complexos de ARN-proteína, que são subsequentemente puxadas para baixo sobre um suporte magnético. Mais especificamente, o ARN protocolo suspenso descrito abaixo utilizar um fragmento de ARN de AR 3'UTR como a isca para recuperar proteína Hur, uma RBP universalmente expresso ligado a 3'UTR do ARNm de ^6,7, a partir de uma cultura primária theadipocytelysate. Para testar a especificidade de ligação deste ensaio, um RNAas não-relevantes bem como em branco esferas de estreptavidina é incluído como controlo. Este protocolo é compatível com western blot ou espectrometria de massa (MS) para confirmar a captura de um RBP específico ou para identificar o repertório cheio de RBPs capturados, respectivamente ^8.

Estão disponíveis várias técnicas para estudar a interacção RNA-proteínas. Para revelar RNAs ligados por um determinado RBP, RIP (imunoprecipitação RNA) e CLIP (reticulação UV e imunoprecipitação) pode ser aplicado. Em contraste, para identificar parceiros de proteína de um determinado ARN, ARN suspenso, CHIRP (isolamento cromatina por purificação de ARN), QUADRO (análise de hibridação de captura de alvos de ARN) e RAP (purificação de ARN anti-sentido) pode ser aplicado. Em comparação com os posteriores, a técnica de pull-down RNA leva menos esforço para configurar. Pode ser empregue para capturar as proteínas in vitro e in vivo. A abordagem in vivo de RNA pull-down, que é tecnicamente mais exigente do que o seu homólogo in vitro, preserva interações RNA-proteína por reticulação nas células, capta RNAs marcado com aptâmeros de interesse a partir de células e, posteriormente detecta RBPs encadernados. ARN pull-down pode ser utilizado para enriquecer baixas RBPs abundantes, e para isolar e identificar os complexos de ARN-proteína que têm diversos papéis funcionais no controlo de regulação celular ^9,10 .

Protocolo

NOTA: O ARN de interesse no contexto do presente estudo é um fragmento da 3'UTR AR.

1. Preparação de ARN-biotina marcado

1. Para obter o RNA, amplificar T7-AR-oligo por PCR, seguida por transcrição in vitro utilizando um estojo comercial e seguindo as instruções do fabricante ^11.
   NOTA: Os primers para PCR estão listadas na Tabela 4: T7-AR-F e T7-AR-R.
2. Para o controlo de ligação não específico, amplificar uma sequência parcial do ADN de luciferase de pirilampo (FL) por PCR a partir do plasmídeo psiCHECK-2, seguido por transcrição in vitro.
   NOTA: Os primers para PCR estão listadas na Tabela 4: hluc (+) - T7-sonda-F e hluc (+) - R-sonda Tabela 4 sequências de molde e os iniciadores para amplificação por PCR...
3. Para uma reacção de PCR de 50 uL, misturar 50 ng de ADN (oligo ou plasmídeo), 4 ul de dNTPs (2,5 mM de cada dNTP individuais), 5 ul de tampão de reacção 10x, 1 ul de 2,5 U / & #181; L de polimerase de ADN, 2 ul de 10 mM de iniciadores para a frente, 2 ul de 10 mM de primer reverso, e água isenta de nuclease.
   1. Executar a amplificação por PCR num termociclador utilizando o seguinte programa. Passo 1: um ciclo de 95 ° C durante 2 min; Passo 2: 35 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 30 seg (AR) ou 60 seg (FL); Passo 3: um ciclo de 72 ° C durante 10 min.
4. Sintetizar ARN biotinilado utilizando um kit de transcrição in vitro, seguindo as instruções do fabricante ^11. Neste experimento, use produtos de PCR como modelos para a síntese de RNA. Por um pi in vitro da reacção de 20 transcrição, misturar 200 ng de PCR amplificado de DNA, 2 ul de cada NTP indivíduo, 1 ul 10 mM de biotina-CTP, 2 ul de tampão de reacção 10x, e 2 ul de ARN-polimerase de T7. Incubar a mistura a 37 ° C durante 4 h.
5. Após a transcrição in vitro, a mistura de reacção com um mimo ul de 2 U / mL de ADNase a 37 & #176; C durante 15 minutos para degradar ADN molde. Por fim, dilui-se o ARN biotinilado para um volume total de 60 uL para a purificação subsequente.
6. Purifica-se ARN biotinilados para remover os sais e os nucleótidos não incorporados utilizando colunas de purificação de acordo com as instruções do fabricante ^12. Medir a concentração de ARN e armazenar a -80 ° C para ensaios subsequentes pull-down.
7. Para garantir que a estrutura secundária adequada para o ARN de interesse na interacção RNA-proteína, de calor 50 ul de ARN biotinilado (50 pM) a 90 ° C durante 2 min, frio em gelo durante 2 min, em seguida, fornecer com 50 tampão de RNA estrutura ul 2x (Tabela 3), e para permitir o dobramento de RNA, à TA durante 30 min ^13,14.

2. Preparação de Grânulos de ARN-conjugado

NOTA: Use um suporte magnético para a separação das esferas magnéticas e sobrenadante.

1. Ressuspender as esferas magnéticas revestidas com estreptavidina dentro do recipiente original por breve vortexing seguindo as instruções do fabricante. Transferir 150 ul grânulos em suspensão para um tubo de 1,5 ml. Colocar o tubo no ímã para 1 min. sobrenadante de descarte. Mantenha talão pellet.
   NOTA: Em ensaios de pull-down de ARN, quando alíquotas grânulos em suspensão do frasco original, use 50 pérolas ul para um ensaio seguido por western blot e 200 pérolas ul para um ensaio seguido por MS.
2. Lavar as pérolas uma vez por re-suspensão do grânulo pelete com 1 ml da recomendada pelo fabricante 1x tampão B W & (Tabela 3) (de ligação e de lavagem), seguindo-se a rotação do tubo durante 5 min à temperatura ambiente num rotador. sobrenadante de descarte. Mantenha talão pellet.
3. Para inactivar RNase em grânulos, esferas de lavar duas vezes, de cada vez por re-suspensão da pelota talão com 400 uL de tampão A. O tampão A é uma solução alcalina contendo NaOH 0,1 M e NaCl 0,05 M (Tabela 3). Girar o tubo durante 2 min à temperatura ambiente num rotador. sobrenadante de descarte. Mantenha talão pellet.
4. Para remover NaOH a partir de grânulos, grânulos lavar duas vezes, de cada vez por re-suspensão da pelota talão com 400 ul de tampão B (Tabela 3), seguido pela rotação do tubo durante 2 min à temperatura ambiente num rotador. sobrenadante de descarte. Mantenha talão pellet.
5. Ressuspender pellet talão com 300 ul 2x W & B tampão, contas dividido em partes iguais e transferir para três tubos de 1,5 ml (100 contas ul por tubo). Fornecer os tubos contendo talão com 100 mL RNase água livre, 100 ul biotinilado FL RNA e 100 ul biotinilados AR 3'UTR RNA, respectivamente.
6. Incubar cada mistura de pérolas durante 1 h à temperatura ambiente com rotação. Coloque tubos no ímã para 1 min. Descarte todo o sobrenadante. Manter peletes grânulo.
7. Lavar as pérolas duas vezes, de cada vez por re-suspensão da pelota cada grânulo com 400 ul de 1x tampão de W & B, seguido por rotação tubos durante 5 minutos a temperatura ambiente num rotador.
8. Coloque tubos no ímã para 1 min. Descarte todo o sobrenadante. Ressuspender cada pelle talãot com 50 ul de tampão de isolamento nuclear (Tabela 3).

3. pr�adip�ito Isolamento e Adipogênese Indução

1. Conforme descrito em publicações anteriores ^5, dissecar pré-adipócitos da almofada de gordura marrom interescapular (ratinhos de tipo selvagem C57BL6, 3 semanas de idade).
2. Crescer e in vitro diferenciar os pré-adipócitos ^5. As células estão prontas para aplicação a jusante 4-5 dias após o início da diferenciação.

4. Preparação de Lisado celular dos adipócitos primários

NOTA: Assegurar que todos os procedimentos de preparação de ligado celular são feitas em gelo, e todos os buffers são arrefecidas em gelo. homogeneizadores Dounce de vidro pré-frio no gelo.

1. Crescer e diferenciar pré-adipócitos em 15 cm pratos ⁵ (ver secção 3.2). Cada prato fornece células adequadas para o ensaio de pull-down um RNA. No dia 4 ou dia 5 de diferenciação, meio de cultura de células de descarte, e ce lavarLLS uma vez com 1x PBS.
2. Para colher as células, adicionar 10-15 ml de 1x PBS para as células, raspar para recolher as células num tubo de 50 ml, e as células por centrifugação a 200 xg durante 5 min à TA. Elimine o sobrenadante utilizando uma pipeta.
3. Ressuspender o sedimento celular em 2 ml de tampão hipotónico (Tabela 3), e incuba-se as células em gelo durante 15 min. Transferência de células para um homogeneizador de vidro de 15 ml Dounce e células de cisalhamento mecanicamente em gelo com 20 golpes.
4. Pellets núcleos celulares por centrifugação a 3300 xg durante 15 min a 4 ° C. Mantenha pellet núcleos de gelo para uso posterior (ver secção 4.6). Transferir o sobrenadante para tubos de 1,5 ml, adicionar KCl 3M de sobrenadante para se obter uma concentração final de 150 mM, e centrifugação a 20000 xg durante 15 min a 4 ° C.
5. Após a centrifugação, remover cuidadosamente lipidlayeron topo usando uma pipeta, e recolher o sobrenadante como o lisado celular citoplasmática.
6. Ressuspender pellet núcleos (ver secção 4.4) em 1 ml de tampão de isolamento nuclear. Tnúcleos ransferência para um homogeneizador de vidro Dounce de 15 ml usando uma pipeta, e os núcleos de cisalhamento mecanicamente em gelo com 100 pancadas. Sedimentar os detritos nucleares por centrifugação a 20000 xg durante 15 min a 4 ° C, e recolher o sobrenadante como o lisado celular nuclear.
7. Ou combinar os lisados ​​celulares nuclear e citoplasmática, ou utilizar separadamente cada fracção, para aplicação pendente a jusante. Nesta experiência de demonstração, estas duas fracções de lisado celular foram combinados a uma proporção em volume de 1: 1.
8. Adicionar inibidor de RNase para esta ligado celular não fraccionada para se obter uma concentração final de 0,5 U / uL. Retiradas 100 ul de lisado celular como controle de entrada para western blot ^15.

5. ligação e eluição de RBP

1. lisado celular dividida em três aliquotas iguais (1 ml de lisado celular num tubo de 1,5 ml), e incuba-se com vazio, FL ARN-conjugado e os grânulos AR 3'UTR ARN-conjugados (ver secção 2.8), respectivamente, durante 3 horas a 4 ° Ccom rotação.
2. Coloque tubos no ímã para 1 min. Recolher o sobrenadante utilizando uma pipeta de 1 ml, seguido de isolamento de RNA a partir do sobrenadante para confirmar ARN integralidade. Isolar ARN utilizando uma solução de tiocianato de guanidínio-fenol ácido, seguindo as instruções do fabricante (Tabela 2). Avaliar o ARN intacto através da análise de 28S e 18S subunidades de RNA ribossomal. Mantenha pelotas talão no gelo.
3. Lavam-se as esferas magnéticas seis vezes, cada vez por ressuspensão cada pellet de talão com 1 ml de tampão de isolamento nuclear contendo 40 U de RNase inibidor e 0,25% de IGEPAL, seguido pela rotação tubos durante 2 minutos à temperatura ambiente num rotador. Usar um suporte magnético para a separação das esferas magnéticas e sobrenadante. Descarte todo o sobrenadante. Mantenha pelotas talão no gelo.
4. Use etapas a seguir para eluir complexos de RNA-proteína de esferas para transferência de western. Em primeiro lugar, ressuspender cada pellet de grânulo em 75 ul de tampão de isolamento nuclear; em seguida, adicionar 25 ul 4x western blot carregamento buffer (contendo SDS) para obter um volume total de 100 ul. Finalmente, ferver grânulos em 100 ul desta solução a 95 ° C durante 5 min.
   NOTA: Use os seguintes passos para eluir complexos de RNA-proteína de esferas para MS. Passo 1: ressuspender cada pellet de grânulo em 100 ul de tampão de eluição (Quadro 3); Passo 2: incubar as amostras de esferas durante 2-3 horas à temperatura ambiente com rotação; Passo 3: centrífuga e recolher o sobrenadante contendo proteína; Passo 4: concentrar soluções de proteína de 20-30 ul antes da apresentação para MS.
5. Centrifugue cada 100 ul de amostra de talão a 12000 xg durante 30 seg a 4 ° C, e recolher o sobrenadante. Alíquota de sobrenadante 15 ul para análise western blot (ver secção 6.1 e 6.2). Sondar a membrana resultante com o anticorpo monoclonal de rato Hur diluído (diluição 1: 1000), durante a noite.

6. Western Blotting para verificação da RBP

1. RBPs separadas por SDS-PAGE usando técnicas padrão.
2. realizar nósStern blotting usando técnicas convencionais através de sondagem para os RBPs associados com o ARN de interesse.
   NOTA: Neste experimento demo, foi utilizado anticorpo monoclonal de Hur para a imunodetecção de proteína Hur.
3. Incubar a membrana com o anticorpo resultante Hur diluído (diluição 1: 1000) em 5% w / v de leite em pó desnatado, 1x TBS, 0,1% Tween - 20 a 4 ° C com agitação suave, durante a noite. Lavar as membranas três vezes com 1x TBST. Incubar membrana com o anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho-HRP) à temperatura ambiente durante 1 h. membrana de lavagem. Desenvolver e registro sinal.

Resultados

Nesta experiência de demonstração, um fragmento de ARN de AR foi utilizado como isco para capturar a sua proteína de ligação Hur. Tanto uma isca FL ARN que não é relevante para a proteína Hur, e uma alíquota de esferas de estreptavidina em branco não conjugados serviram como controlos negativos. interacções ARN-proteína podem ocorrer quer no núcleo ou citoplasma, e este protocolo de pull-down pode ser aplicado a total ou fraccionado (nucleares ou citoplasmáticas) lisados ...

Discussão

lncRNAs RBPs e desempenham um papel vital na saúde e na doença, no entanto, os mecanismos moleculares destas moléculas são mal compreendidos. Identificação de proteínas que interagem com moléculas lncRNA é um passo fundamental para elucidar os mecanismos de regulação. Enriquecimento de RBPs por o sistema de ensaio suspenso ARN baseia-se na captura em solução de complexo interagir de modo que as proteínas a partir de um lisado celular pode ser selectivamente extraído usando iscas de ARN biotinilados ligado...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Major materials used in this study.
MEGAscript kit	Ambion
Biotin-14-CTP	Invitrogen
NucAway spin columns	Ambion
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen
HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)	Santa Cruz Biotechnology
Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)	Santa Cruz Biotechnology
Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)	HyClone
Phosphate Buffer Saline (1×PBS)	HyClone
RNase inhibitor	Bioline
Protease inhibitor	Sigma
Pfu Turbo DNA polymerase	Agilent Technologies
TRIsure	Bioline
Name	Company	Catalog Number	Comments
Major equipment used in this study.
Sorvall Legend Micro 21R centrifuge	Thermo Scientific
Sorvall Legend X1R centrifuge	Thermo Scientific
Bio-Rad T100 thermal cycler	Bio-Rad
Nanodrop 2000	Thermo Scientific
BOECO rotator Multi Bio RS-24	BOECO,Germany
Protein gel electrophoresis and blotting apparatus	Bio-Rad
DynaMag-2 magnet	Life Technologies