Técnicas para a Evolução da levedura Pentose-fermentação robusta para bioconversão de transformação de lignocelulose em etanol

Resumo

Evolução e isolamento de técnicas adaptativas são descritos e demonstrados para se obter derivados de Scheffersomyces stipitis estirpe NRRL Y-7124 que é capaz de consumir rapidamente de hexoses e pentoses em açúcares mistos enzima sacarificado hidrolisados undetoxified e a acumular-se sobre 40 g / L de etanol.

Resumo

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.

Introdução

Estima-se que 1,3 bilhões de toneladas secas anuais de biomassa lignocelulósica poderia apoiar a produção de etanol e permitir que os EUA a reduzir o seu consumo de petróleo em 30%. ¹ Embora biomassa vegetal misturas de açúcar rendimentos de hidrólise ricos em glicose e xilose, inibidores da fermentação são gerados pelo pré-tratamento químico necessário para quebrar hemicelulose e celulose para expor ataque enzimático. ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural (HMF) são considerados os principais componentes entre muitos inibidores que se formam durante o pré-tratamento. A fim de mover a indústria de etanol lignocelulósico para a frente, a investigação e procedimentos para permitir a evolução de estirpes de leveduras capazes de sobreviver e funcionar eficazmente para usar tanto hexoses e pentoses, na presença de tais compostos inibidores são necessários. Um ponto fraco adicional significativo de estirpes de leveduras industriais tradicionais, tais como Saccharomyces cerevisiae, é a incapacidade de fermen eficientementet a xilose disponíveis em hidrolisados ​​de biomassa vegetal.

Pichia stipitis estirpe NRRL Y-7124 (CBS 5773), recentemente renomeado stipitis Scheffersomyces, é uma levedura de fermentação pentose nativa que é bem conhecido para fermentar a xilose em etanol. ^2,3 A evolução da estirpe NRRL Y-7124 foi prosseguido aqui porque tem sido documentada a têm o maior potencial de linhagens de leveduras nativas para acumular etanol economicamente recuperável superior a 40 g / L com pouco subproduto xilitol. ^4,5,6 na mídia ideal, S. stipitis estirpe NRRL Y-7124 produz 70 g / L de etanol, em 40 h (1,75 g / L / h), com um rendimento de 0,41 ± 0,06 g / g em culturas de elevada densidade celular (células de 6 g / l). ^7,8 Resistência para inibidores da fermentação etanol, furfural, e HMF também tem sido relatado, ⁹ e S. stipitis foi classificado entre mais promissores pentoses-fermentação de leveduras nativas disponíveis para productio etanol em escala comercialn de lignocelulose. ¹⁰ O nosso objectivo era aplicar diversas hidrolisados lignocelulósicos undetoxified e pressões de seleção de etanol para forçar evolução em direção a um derivado mais robusto da estirpe NRRL Y-7124 adequada para aplicações industriais. Chave entre características melhoradas procurados eram taxas mais rápidas de açúcar de absorção em hidrolisados ​​concentrados, reduzida diauxy para uma utilização mais eficiente de açúcar misturado, e tolerâncias mais elevadas de etanol e inibidores. A aplicação de S. stipitis para hidrolisados undetoxified foi um dos principais focos da pesquisa para eliminar a despesa operacional adicional associado com processos de desintoxicação hidrolisado, como calagem excessiva.

Dois hidrolisados industrialmente promissores foram aplicadas para forçar evolução:. Enzima Sacarificada fibra de amônia pré-tratados com expansão hidrolisado de palha de milho (AFEX CSH) e diluir o licor switchgrass hidrolisado pré-tratadas com ácido (PSGHL) ^11,12 tecnologia de pré-tratamento AFEX está sendo desenvolvido paraminimizar a produção de inibidores de fermentação, enquanto que o pré-tratamento com ácido diluído representa o menor custo actual tecnologia mais comumente praticado para expor biomassa celulósica para sacarificação enzimática. PSGHL é separável a partir da celulose remanescente após pré-tratamento e é tipicamente rica em xilose a partir do hidrolisado hemicelulose, mas pobre em glucose. AFEX CSH e composições PSGHL diferem uns dos outros em aspectos-chave que foram exploradas para gerenciar o processo de evolução. AFEX CSH é menor em aldeídos furano e inibidores do ácido acético, mas superior em aminoácidos e as fontes de azoto, quando comparada com amoníaco PSGHL (Tabela 1). PSGHL apresenta o desafio adicional de xilose sendo o açúcar predominante disponível. Assim PSGHL é apropriado para enriquecer especificamente para melhor utilização xilose na hidrolisados, uma fraqueza prevenção do uso comercial de levedura disponíveis. Mesmo entre leveduras de fermentação de pentoses nativas, a dependência em relação à xilo açúcar abaixo do idealse a apoiar o crescimento celular e reparação torna-se ainda mais desafiador na hidrolisados por causa de uma variedade de razões:. deficiências de nutrientes, inibidores causando danos generalizados para a célula integridade estrutural, e as perturbações do metabolismo devido a desequilíbrios redox ⁹ suplementação de nitrogênio, especialmente na forma de aminoácidos, pode representar um custo operacional significativa para as fermentações. O impacto da suplementação de nitrogênio sobre o rastreio isolado e ranking foi explorada com hidrolisados ​​switchgrass.

Indivíduos melhoradas foram enriquecidos em uma população evoluindo usando várias pressões de seleção dependente de diversidade genética natural do S. população e as mutações stipitis induzida pela exposição a dois hidrolisados diversas, etanol ou radiação UV. Pressões de selecção foram aplicados em paralelo e em série para explorar o progresso evolução de S. stipitis para derivados desejados capazes de crescer e fermentar eficientemente hidrolisados em(Figura 1). A cultura repetitivo de populações funcionais hidrolisados ​​em cada vez mais difíceis foi realizado em microplacas utilizando uma série de diluições de 12%, quer CSH AFEX glucano ou então PGSHL preparado em 20% de carga de sólidos. A aplicação de crescimento desafiou-etanol em xilose em cultura contínua melhorou ainda mais CSH adaptada populações AFEX, através do enriquecimento de fenótipos que demonstram menor suscetibilidade ao etanol repressão da utilização de xilose. A última característica foi recentemente mostrado problemática à utilização das pentoses pela estirpe NRRL Y-7124 após fermentação da glicose. ⁸ Enriquecimento em PSGHL foi próxima explorado para ampliar a funcionalidade hidrolisado.

Derivados melhorados putativos de S. stipitis NRRL Y-7124 foram isolados de cada fase do processo de evolução usando enriquecimento alvo sob condições de estresse e à diluição em placas para escolher colónias a partir das populações mais prevalentes. relativa adimensionalíndices de desempenho (RPIS) foram usadas para classificar estirpes com base no desempenho global, em que o comportamento cinético foi avaliada sobre os diferentes tipos de hidrolisados ​​e suplementos nutrientes aplicados. Embora os sucessos de vários procedimentos de adaptação para melhorar a funcionalidade do S. stipitis na hidrolisados lignocelulósicos foram documentados anteriormente, as estirpes que demonstram a produção de etanol econômica na hidrolisados undetoxified não tenham sido previamente relatado. ^13-17 Utilizando os processos de evolução para ser visualizado em mais detalhes aqui, Slininger et al. ¹⁸ cepas que são significativamente aprimorados em relação desenvolvido a estirpe-mãe NRRL Y-7124 e são capazes de produzir> 40 g / L de etanol em AFEX CSH e enzima hidrolisado virgatum sacarificado (SGH) adequadamente complementada com fontes de azoto. Estas novas estirpes são de futuro interesse para a lignocelulose em desenvolvimento para a indústria de etanol e como sujeitos de genômica adicionais estudos edifícionaqueles de tensão previamente sequenciado NRRL Y-11545 ^19. Um estudo da genómica das principais linhagens produzidas durante as várias fases de evolução diagramado na Figura 1 poderia elucidar a história de mudanças genéticas que ocorreram durante o desenvolvimento como um prelúdio para novas pesquisas de melhoria estirpe.

Protocolo

1. Prepare Começando Materiais e Equipamentos para Ensaios

1. Prepare hidrolisados ​​usando 18 a 20% de biomassa inicial de peso seco na reacção de pré-tratamento para utilização na evolução, o isolamento e a procedimentos de classificação. Veja Slininger et al. 2015 ¹⁸ para os métodos detalhados para preparar AFEX CSH, PSGHL e SGH com suplementos de nitrogênio N1 ou N2 utilizados em evolução, isoladamente ou ranking. Ver Tabela 1 para composição de cada tipo de hidrolisado.
   NOTA: fortificação de azoto de SGH foram designados como SGH-N1 ou SGH-N2 definidos como se segue: SGH-N1 = SGH fortificada a 42: carbono 1 molar em relação ao rácio de azoto (C: N), com fontes de azoto, incluindo ureia, amino livre de vitamina ácidos de caseína, D, L-triptofano, L-cisteína, e vitaminas a partir de fontes definidos de tal modo que (~ 15% molar de N azoto é azoto amino primário (PAN) e ~ 85% de N é de ureia); SGH-N2 = SGH fortificada para 37: 1 C: N com uréia e farinha de soja como o menor custo fonte comercial oaminoácidos de f e vitaminas, proporcionando ~ 12% do N do PAN e 88% na forma de uréia.
2. Adquirir uma cultura liofilizada da estirpe, Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 (CBS 5773) do Culture Collection ARS (Centro Nacional de Pesquisa Agrícola Utilização, Peoria, Illinois), e preparar culturas de glicerol como indicado. Manter culturas de levedura da mãe e seus derivados em 10% de glicerol a -80 ° C.
   1. estoques de glicerol a sequência de dextrose de levedura de malte, peptona (YM) placas de agar (3 g / l de extracto de levedura, 3 g / l de extracto de malte, 5 g / l de peptona, 10 g / L de dextrose, 20 g / l de agar) e incubar 48- 72 h a 25 ° C. ⁸ placas desenvolvida pode ser armazenado até uma semana a 4 ° C antes de ser utilizado como líquido de inóculos de pré-cultura.
3. Prepare óptimas definidas Médio (ODM), um meio sintético compatível com procedimentos de formulação industriais ²⁰ que anteriormente foi desenvolvido para a conversão óptima de xilose em etanol pela str paiain Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124. ⁷ Use o meio definido em todas as pré-culturas e culturas para bioensaios de desempenho de fermentação e também para o etanol desafiado, evolução cultura contínua xilose-fed. Composição ODM está listado para referência na Tabela 2.
4. Como descrito anteriormente, ¹⁸ analisar biomassa celular utilizando um espectrofotómetro de leitura de cuvette- ou de micro-placa, se for caso disso, para medir a absorvência da cultura a 620 nm (A _620). Quantificar açúcares, etanol, furfural, hidroximetilfurfural (HMF), e ácido acético em amostras de cultura utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou a determinação enzimática robótico de glicose e xilose por um maior rendimento.

2. Enriqueça Derivados robustos durante a transferência de série na AFEX CSH

1. Inocular uma pré-cultura da estirpe NRRL Y-7124. Transferência de células de agar YM a 75 ml ODM + 150 g / L de xilose para manter a capacidade de crescer sob oestresse smotic. Incubar pré-culturas em frascos de 125 ml fechado com esponja de silicone tampões 24 h a 25 ° C com agitação (150 rpm, uma "órbita).
2. alíquotas congeladas descongelamento de 6-12% CSH AFEX glucana em água fria para o uso. Ajustar o pH a 5 e se necessário filtro de esterilizar antes da preparação de uma série de diluição em microplacas de 96 poços.
3. Encha microplacas com 50 jil por poço e 8 poços por diluição hidrolisado, em seguida, com inocular alguns microlitros de pré-cultura por poço para permitir que uma absorvância inicial (620 nm) A ₆₂₀ ≥0.1. Incubar as placas estaticamente 24-48 horas a 25 ° C em uma caixa de plástico com uma toalha de papel molhada para umidade.
4. Usando o hidrolisado de diluição mais concentrada que visivelmente cresceu a A _620> 1, a transferência de 1-5 ul a cada poço de uma nova série de diluição hidrolisado para atingir inicial A ₆₂₀ ≥0.1.
5. Monitorar a cultura de crescimento A ₆₂₀ em microplacas com um espectrofotômetro. Uma série de diluições Ser não inoculadoves como um controlo e branco. tampas de placa são deixados no durante o monitoramento para evitar a contaminação, e as leituras ajustados em conformidade.
6. Preparar stocks de glicerol de culturas de adaptação regularmente para o isolamento subsequente das estirpes melhoradas ou para utilização em reinoculating diluições em série do hidrolisado contínua. Para preparar stocks, piscina quatro poços (200? L) de maior concentração de hidrolisado colonizado. Mistura 1: 1 com glicerol a 20% estéril em criotubos, para congelar as células em 10% de glicerol a -80 ° C.
7. Repita os passos 2,3-2,6 até que o crescimento em 12% CSH AFEX glucano é sempre visível em 24 horas.

3. Isolar única célula Derivados tolerantes após enriquecimento em AFEX CSH

1. Streak selecionado stocks de glicerol de culturas de adaptação para agar YM e usar raias para inocular 50 mL de 3% ou 6% glucana AFEX CSH (pH 5) em cada um dos três poços (Initial A ₆₂₀ ~ 0,1). Incubar microplacas de 24 horas como no passo 2.3. réplica piscinate colonizado poços na maior força hidrolisado com um forte crescimento, e placa de diluição para ym ou 6% glucana agar CSH AFEX. Prepara-se o último como uma mistura 1: 1 de filtro esterilizado 12% CSH AFEX glucano com solução / L de agar morno autoclavada 30 g.
2. Escolha 5 colónias isoladas a partir da placa de diluição mais elevada que mostra o crescimento após 24-48 h de incubação a 25 ° C para congelar como culturas de stock de glicerol. Streak cada colônia para uma placa de YM. Incubar 24 horas. Com uma ansa estéril, transferir uma sequência de células desenvolvidas para um pequeno volume de glicerol a 10%, mistura a suspender as células, e para distribuir 2-3 criotubos por congelação a -80 ° C.

4. Avaliar o desempenho da AFEX CSH Derivados tolerantes Comparado ao Pai

1. Teste isolados no Simples culturas 6% Glucan AFEX CSH lote.
   1. Transferência de células de placas de 48 hr riscado dos estoques de glicerol a pH tampão fosfato 7 de potássio (0,4 mm) para preparar suspensões de células com A ₆₂₀ = 10. Use 1 ml decada suspensão para inocular cada um dos quatro poços de 50 ul de 3% de hidrolisado de glucano de inicial A ₆₂₀ = 0,2. Incubar microplacas de 24 horas como no passo 2.3. Prepara-se o 3% CSH AFEX glucano a pH 5 por diluição de 12% glucano AFEX CSH 1: 3 com água estéril.
   2. Transferência de dois poços de 24 horas de microplacas para inocular 25 ml pré-culturas de pH 5 a 12% CSH AFEX glucana utilizados em 50% da força total. Incubar pré-culturas em frascos de 50 mL com tampas de esponja de silicone durante 24 horas a 25 ° C, ~ 150 rpm (1 "órbita) Preparar a meia-força 12% glucano AFEX CSH diluindo o hidrolisado. 1: 1 com água estéril.
   3. Use meia-força pré-culturas hidrolisado para inocular 25 ml culturas de crescimento semelhante à inicial de um ₆₂₀ = 0,1. Incubam-se as culturas de crescimento como acima (4.1.2) e amostra diária (0,2 ml). Acumulações de monitor de biomassa ₍₆₂₀₎ e as concentrações de açúcares e de produtos de fermentação (HPLC).
2. Alternativamente, repitch (isto é, R e colheitaeuse) populações de 6% de glucano de levedura crescido AFEX-CSH para testes em 8% de glucano culturas em lotes de hidrolisado, como descrito anteriormente. ¹⁸
3. Em alternativa, ainda mais as populações de ensaio de 6% de glucano repitched culturas CSH AFEX por alimentação com 12% de hidrolisado de glucano, tal como descrito anteriormente. ¹⁸
4. Teste lag diauxic de isolados em culturas de lote de ODM com açúcares mistos.
   1. Inocular 75 ml de pré-culturas ODM com 150 g / L de xilose em 125 mL de frascos com tampas de esponja de silicone por transferência de malha a partir de faixas de glicerol YM. Incubar 24 horas como no passo 2.1.
   2. Use pré-culturas para inocular culturas de 75 ml de teste semelhantes com ODM contendo 75 g / L de glucose e 75 g / L de xilose, a pH 6,5. Frascos de agitação a 25 ° C, 150 rpm. Amostra diária.
   3. Alternativamente, testar o impacto de 0-15 g de ácido / L acético em diauxy durante a fermentação da glucose e xilose, utilizando um protocolo semelhante, com excepção do pH inicial é ajustado a 6,0 ± 0,2 em culturas de teste para manter o pH 6-7 dutocar o consumo de ácido acético, tal como descrito anteriormente. ¹⁸

5. Aplique cultura contínua selecionar para utilização xilose desafiou-etanol

1. Prepare ODM como o meio de alimentação de cultura contínua com 60-100 g / L de xilose, 20-50 g / L de etanol a pH 6,3 ± 0,2. Escolha de combinações de xilose e etanol para simular a fermentação parcial de 150 g / L de xilose, assumindo um rendimento potencial de ~ 0,5 g de etanol / g de xilose, e para acomodar o potencial de 50-70 g / L de etanol a ocorrer. ⁸
2. Para preparar o inoculo de cultura contínua, transferir um representante AFEX colónia CSH-tolerantes (análogo ao Colony 5 no exemplo, a Figura 1) por ciclo a partir de uma placa de YM 48 h, para 75 ml da ODM isento de etanol (100 g / L de xilose, neste caso) em frascos de 125 ml. Incubar a 25 ° C, 150 rpm (1 "órbita) durante 24 h. Escolher a concentração de xilose ODM pré-cultura para corresponder ao do volume inicial segurando cultura contínua.
3. Inocular um volume de cultura contínua realização de ODM a pH 6,3 ± 0,2 com 100 g / L de xilose + 20 g / L de etanol com ~ 5-10 mL de um concentrado de pré-cultura de um isolado AFEX CSH-tolerantes (análogo ao Colony 5, Figura 1 ) para obtenção de 100 ml a ₆₂₀ inicial a ~ 0,5. Manter o volume segurando cultura (V _R), a 25 ° C num frasco com agitação de 100 ml com camisa agitado a 200 rpm e equipado com eléctrodo de pH esterilizável, controlador de pH e banho de água circulante de temperatura controlada.
4. Inicialmente, uma vez que o crescimento celular será lento devido à exposição ao etanol, configure o meio de alimentação à dose usando uma bomba accionada do pH. Definir a bomba para alimentar pH 6,3 ODM com 100 g / L de xilose e 50 g / L de etanol, quando a cultura de fermentação o pH cai para 5,4, parando, assim, ainda mais queda do pH. Manter o volume a 100 ml com uma bomba de desnatação efluente continuamente a superfície de cultura. Por conseguinte, a concentração de etanol aumenta com o metabolismo continuado e alimentação.
5. Medir efluente e extrair amostras (1-2 ml) a partir de culturas contínuas a cada 48-72 horas, para a análise da concentração de células viáveis, os produtos e os substratos, como anteriormente descrito. ¹⁸ Para encontrar a concentração de células viáveis, fazer série de diluições 1:10 em amostras tampão (ver 4.1.1) e de espalhamento em placa as diluições de agar YM (ver 1.2.1). Com base em taxas de recolha do efluente (Q), calcular a taxa de diluição (D) (Q / V _R), e, no exemplo de S. stipitis, variou 0-0,01 hr ^-1.
6. Salve stocks de glicerol regularmente isolando a partir de placas de viabilidade de diluições de amostras tamponadas formando 30-100 colônias, representando colonos robustos mais prevalentes na época em enriquecimento. placas de inundação com ~ 5 ml de 10% de glicerol para permitir a preparação de cryovials duplicados. Para manutenção ou uma pausa, parar a cultura contínua e reiniciar conforme necessário usando a maior parte da (s) atual (resistente) de glicerol.
7. Para reiniciar, raia o estoque (s) de glicerol da maioriapopulações resistentes a agar YM e transferir 24-48 células hr por loop para um pré-cultura de ODM livre de etanol para a incubação como acima. Inocular 100 ml de volume que prendem de ODM a inicial ₆₂₀ 0,5 Um usando um concentrado de levedura pr�cultivado, e permitir a cultura a crescer por lotes até à fase estacionária antes de o fluxo de meio de alimentação é reiniciado.
8. Se as culturas podem crescer constantemente a> 0,01 h ^-1 em xilose, na presença de> 25 g / L de etanol, inicia a alimentação contínua de cultura (ODM + 60 g / L de xilose + etanol variando de 30 a 50 g / L) a uma baixa taxa de diluição de 0,01 h ^-1 ~ de 100 ml de volume que prendem (inicialmente ODM + 60 g / L de xilose + 20 g / L de etanol). Ao longo do tempo, levantar o etanol na alimentação para 50 g / L. Capturar populações avançadas nos estoques de glicerol.
   NOTA: A manutenção da taxa de diluição de baixo permite a formação de uma concentração de células suficientemente elevado para reduzir a disponibilidade de oxigênio e fermentação apoio.
9. Opcionalmente, aplicar ultra-violeta (UV) irradiation mensal para glicerol populações de ações utilizadas para reinoculate culturas contínuas.
   1. colónias Ressuspender de estrias estoque de glicerol em 10 ml de ODM (como em pré-culturas) com 60 g / L de xilose e piscina todas as ações em um único frasco estéril. Aplicar a suspensão de células reunidas em ~ 5 x 10 ⁸ células viáveis / ml para apenas cobrir o fundo de 4-5 placas de Petri com 6 ml / placa. Para obter 6 ml cobertura de uma placa de Petri descartável padrão, dispensar 15 ml de superar a tensão superficial, e em seguida, remover 9 ml.
   2. Expor cada placa de cultura aberta aos raios UV da fonte de luz em uma cabine de segurança biológica. Ajustar o tempo de exposição aos raios UV ou a distância para obter a taxa de mortalidade desejada> 90%. Aqui, expor durante 45 min a cerca de 56 cm da fonte.
   3. Dilui-se suspensões de células de placa antes e após a irradiação. taxa de matar estimativa baseada em unidades formadoras de colónias. Para o S. stipitis exemplo, a taxa de mortalidade foi de ~ 97%.
   4. Transferir as culturas expostas aos UV (24-30 mL) a uma folha-CoVrado frasco de 50 ml, e incuba-se a 25 ° C e 150 rpm durante 24 horas para permitir que a pequena percentagem de células viáveis para repovoar a ~ 1 x 10 ⁸ S. viável stipitis células / ml. Ao impedir reativações de fotografias, a cobertura de alumínio preserva mutações, enquanto culturas são incubadas.
   5. Utilizar a cultura mutagenizada repovoada para inocular culturas contínuas de ~ 1 x 10 ⁷ células viáveis / ml. Reiniciar o ODM + 60 g / L de xilose meio de alimentação enriquecida em etanol para continuar o processo de selecção.

6. Avalie glicerol de Stock Populações e identificar aqueles com melhor fermentação da xilose na presença de etanol

1. Streak seleccionado culturas stock de glicerol de ágar YM como o primeiro passo na tela para melhor crescimento e fermentação de xilose na presença de etanol.
2. Transferir cada população evoluído para ser conferido a partir de faixas de agar de 75 ml pré-culturas em ODM com 150 g / L de glucose, e incuba-se em 125 ml de frascos de 96h antes da utilização como inóculos para culturas de ensaio. As grandes populações cultivadas em glucose exigirá indução de enzimas para utilização xilose.
   1. Para testar a indução, recolher cada cultura, de suspensão de células para 30 ml, ₆₂₀ Uma inicial de 40 em ODM 60 g / L de xilose + 30-45 g / L de etanol, e incuba-se a 25 ° C, 150 rpm (1 "órbita) em frascos de 50 mL com tampas de esponja de silicone. desenhar amostras duas vezes diariamente para monitorar a absorção de xilose por análise de HPLC.
3. Alternativamente, tal como descrito em Slininger et al., ¹⁸ para avaliar o crescimento em xilose, na presença de etanol, preparar pré-culturas de cada população evoluiu por transferência de malha de 75 ml de ODM com 150 g / L de xilose em 125 mL de frascos, e incubar 96 h a 25 ° C, 150 rpm (1 "órbita). inocular culturas de teste para uma baixa inicial a ₆₂₀ de 0,1 em 25 ml de ODM + 60 g / L de xilose + 30-45 g / L de etanol em frascos de 125 ml. Incubar frascos a 25 ° C, 300 rpm, uma "órbita e de amostra.

7. Isolar colônias de uma única célula que utilizam xilose em PSGHL quando o etanol está presente

1. Com base nos resultados do passo 6, seleccionar populações de glicerol que mostram uma capacidade superior para crescer em e fermentar xilose, na presença de etanol. Use-os para placas raia. As placas raia são usados para preparar, suspensões de células em buffer densas de A ₆₂₀ = 5. Em seguida, suspensões de células foram usadas para inocular pré-culturas em placas de 96 poço profundo a A ₆₂₀ = 0,5. Inocular 1 ml de pré-culturas em PSGHL misturado 1: 1 com ODM + 50 g / L de xilose (sem etanol). Incubar em pré-culturas de 96 cavidades, placas de poços profundos com evaporação baixo ventilada cobre por 48 horas a 25 ° C, 400 rpm, uma "órbita. Separar diferentes populações stock de glicerol de poços vazios.
2. A utilização de cada pré-cultura, inoculo dezasseis 1 ml de culturas para replicar inicial Um ₆₂₀ ~ 0,5 em 1: 1 PSGHL: ODM + 50 g / L de xilose com 20, 30, ou 40 g / L de etanol para enriquecer colonos tolerantes. Incubar cultu enriquecimentores de forma semelhante à pré-culturas.
3. Para cada estoque de glicerol diferente, colher os poços de cultura com maior concentração de etanol permitindo o crescimento e xilose uso. Placa cada linha de células de agar YM para obter colónias individuais prevalentes para preservar em glicerol. Escolha dez colônias por linha celular e raia cada um para uma placa de agar YM para a preparação de glicerol.

8. Além do mais Enriqueça Robust Evolved Cepas durante a transferência de série na PSGHL, como por AFEX CSH

1. Preparar pré-culturas de NRRL Y-7124 (ião molecular), AFEX CSH-tolerantes evoluiu isolar, e cultura contínua evoluiu população com maior capacidade de utilizar xilose na presença de etanol. Inocular 75 ml de ODM + 150 g / L de xilose por ciclo de estrias stock de glicerol tal como descrito acima (passo 2.1) para o processo de adaptação hidrolisado AFEX CSH.
2. Diluir PSGHL com água para proporcionar uma série de concentrações cada vez maiores. Prepara-se uma de 96 cavidades de micro-placa para cada uma das três linhas de células, utilizando de cadadiluição PSGHL para encher 8 poços com 50 ul. Use pré-cultura para inocular cada um 50 ul de micro-cultura de diluições em série de ₆₂₀ ~ inicial Um 0,1-0,5.
   1. Continuar a evolução de levedura para aumentar a força de PSGHL usando o mesmo procedimento que a adaptação hidrolisado AFEX CSH descrito acima (passo 2) até que as culturas são capazes de crescer no hidrolisado força total a uma proporção média de 14-d estável de Aa ₆₂₀ por Δtime como transferências de série são continuou mais quatro meses.

9. As colónias de células único isolado Usando PSGHL gradientes com ou sem Etanol Desafio

1. Obter unicelular isolados directamente a partir de força total PSGHL placas de adaptação finais por diluição em placas de agar YM. Escolha dez grandes colónias de cada uma das três linhas de células e raia bar para placas YM para preparar stocks de glicerol tal como descrito anteriormente (passo 3.2).
2. Opcionalmente, explorar pontos de tempo mais iniciais doprocesso de evolução por meio do isolamento dos estoques de glicerol armazenados das três linhas celulares.
   1. Inocular uma pré-cultura para cada linha celular pelo circuito de estrias stock de glicerol e incubar 24 horas em 30 ml ODM + 50 g / L de xilose (50 ml frascos, 25 ° C, 150 rpm).
   2. Células desafio de pré-culturas para o crescimento no hidrolisado por inoculação de 50 ul de 50% PSGHL em poços a uma inicial A ₆₂₀ ~ 0,2 e incubação estaticamente 48 horas.
   3. Espalhe 0,1 ml de cada cultura em placas de ágar enriquecido gradiente PSGHL que variam de 0 a 50% de hidrolisado de força (~ 300-400 entregar células viáveis ​​por placa), e pegar 10 colónias individuais por linha de células a partir da maior área possível hidrolisado concentração do gradiente . ²¹ Streak escolheu colônias para YM para a preparação de glicerol como no passo 3.2.
   4. Como uma alternativa para o passo 9.2.3, em vez de inocular as placas de agar de gradiente, inocular cavidades de 96 poços de micro-placas de inicial Um ₆₂₀ ~ 0,2, wheRE Os poços são concebidos para conter uma gama de concentrações de hidrolisado de 50 a 100% da força de etanol e de 10 a 40 g / L. Neste caso, o desenvolvimento de micro-placas de 72-96 horas e de outra forma como no passo 2.3. Isolar dez colónias isoladas a partir de poços dos mais severos combinações hidrolisado a etanol que mostram o crescimento através de diluição em placas, e preparar stocks de glicerol como no passo 3.2.

10. Em uma tela primária, eliminar Isolados inferiores comparando e Ranking Performances sobre PSGHL em duas condições de nutrientes

1. Aplicar uma tela placa poço profundo alto rendimento de desempenho PSGHL para a tela cinco conjuntos de trinta isolados juntamente com NRRL Y-7124 pai e isolado AFEX CSH-tolerantes (análoga à Colony 5 do exemplo evolução Figura 1) como controles para escolher seis linhagens superiores (20%) de cada conjunto para passar para o nível de triagem secundária (passo 12).
2. Realizar a tela em placas de poços profundos cheios de 1 ml por poço e cobertos witampas de aço inoxidável th com silicone preto selos evaporação baixos. Fixe todas as placas para o conselho da incubadora / agitador e operar a 25 ° C e 400 rpm (1 "órbita shaker). Design tudo que poço profundo placa enchendo padrões para permitir a separação de diferentes isolados por poços abertos.
3. Para começar cultivos, escolher um cordão de células de estrias glicerol preparados a partir de 30 isolados obtidos como acima (nas etapas 3, 7 e 9) para duplicar poços de ODM + 50 g / L de xilose e incubar 48 horas.
4. Como um meio de desafio para preculturing isolados, preparar 50% PSGHL PSGHL misturando 1: 1 com ODM + 10 g / L de glucose + 50 g / L de xilose. Para o rastreio de 30 isolados e duas estirpes de controlo 2, 2 placas com poços por cada um dos 16 isolados são preenchidos, deixando poços vazios entre os diferentes isolados.
5. Para as culturas de desafio, de transferência, num volume de 50 ul de ODM pré-culturas (A ₆₂₀ ~ 10) para cada um dos dois poços de cultura PSGHL desafio de 50% para cada um dos isolados e controla a obtenção de uma initial A ₆₂₀ ~ 0,5 e incubar 72 horas.
6. Usar dois meios de teste de diferentes riqueza nutritiva para o rastreio isolados: 60% PSGHL + ODM nutrientes; e os nutrientes ODM + YM 75% PSGHL +. Adicionar nutrientes ODM (excluindo açúcares) na metade da força como padrão para ODM usar com 50 g / L de açúcar (passo 1.3). Como designado, adicionar nutrientes YM (excluindo açúcares) na metade da resistência padrão de 3 g / L de extracto de levedura, 3 g / L de extracto de malte, 5 g / L de peptona.
7. Inocular culturas de teste, transferindo 50 ul de 72 horas 50% PSGHL desafio pré-culturas para inocular 1.000 ul a inicial de um ₆₂₀ ~ 0,5 em cinco poços profundos para cada um dos dois meios de teste.
8. Amostra cada isolado diária. Pipetar o conteúdo de um poço para um tubo de microcentrifugação e centrifuga-se (5533 xg, 15 min) para obter o sobrenadante de etanol, glucose e xilose análises de elevado rendimento. Medir biomassa como ₆₂₀ em 96 poços de micro-placas (200 ul / poço) com um espectrofotómetro.
9. Dentro de cada conjunto de 30 éolates testado (5 conjuntos de S. stipitis NRRL Y-7124 evoluiu cepas), calcular índices de desempenho relativos (RPI), conforme descrito na etapa 11 abaixo e usam para classificar cada linhagem com base no rendimento de etanol (etanol máxima acumulada por açúcar inicial fornecido) e taxa de absorção de xilose (concentração de xilose consumida por 96 horas inicial) em ambos os meios de teste.

11. Posto Isolados na tela primária PSGHL Usando Índice de Desempenho Relativo (RPI)

1. Na sequência de rastreio primário, calcular índices de desempenho relativos adimensionais (RPI), a fim de classificar a 30 isolados de cada uma das cinco experiências diferentes para a tela isolados no PSGHL com duas formulações diferentes de nutrientes por experimento, ou seja, 60% PSGHL e 75% PSGHL.
2. Calcular o parâmetro estatística F para uso na classificação do desempenho do isolado dentro de um grupo de isolados testados numa dada experiência: F = (XX _AVG) / s. Aqui, X é o parâmetro de desempenho, tais como o rendimento (Y)ou taxa (R), observada para cada isolado do indivíduo, enquanto X _AVG e s são a média eo desvio padrão, respectivamente, de X observou em todos os isolados de dentro de uma dada experiência. Para distribuições normais, -2
3. Para cada isolado em um experimento, calcule o desempenho relativo com base na taxa, RPI _R = (2 + F _R) × 100/4, e da mesma forma calcular o desempenho relativo com base no rendimento, RPI _Y = (2 + F _Y) × 100/4 . O valor do RPI varia de 0 a 100 ~ percentil (menor para o maior). Em seguida, calcular médias RPI para cada isolado dentro de um determinado experimento hidrolisado como se segue: RPI _avg = (RPI _Y + RPI _R) / 2, em que as contribuições de rendimento e de taxa são dadas igual ponderação nesta aplicação.
   Note-se que, em geral, os parâmetros de rendimento e de taxa pode ser ponderada, se for considerado desigual em importância.
4. Calcule RPI _global entre os n tipos de hidrolisados testados: RPI _geral = Σ _{i = 1, n} [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _i / n. Considere cada isolado em um conjunto experimental de 30 isolados e 2 controles. Durante classificação primária do ~ 150 única colónia isolados adaptado para xilose-rico PSGHL, RPI _global é calculada para as taxas e os rendimentos através das duas formulações PSGHL aplicados no ecrã, isto é, 60% PSGHL e 75% PSGHL, onde n = 2.
5. Com base na RPI _geral dentro de cada experimento, escolha a percentagem superior de isolados para passar para o ecrã secundário. Neste exemplo, a parte superior 20% de estirpes são escolhidos para passar através (isto é, 30 de 150 testado).

12. Em uma tela secundária, Compare Performers de tela principal Top em vários hidrolisados ​​completas (> 100 g / L Sugars mistos) para revelar Máximas Funcionamento Cepas robustos

1. Compare melhores desempenhos PSGHL em 6% glucana CSH AFEX e SGH alterada com dois níveis de nitrogênio, SGH-N1 e SGH-N2 (composiçãos como na Tabela 1) para a classificação final. Peneirar os 30 isolados que foram os melhores desempenhos na tela bem prato fundo principal de PSGHL (etapas 10 e 11) e os dois controles (estirpe progenitora NRRL Y-7124 e isolado AFEX CSH-tolerantes (análoga à Colony 5, Figura 1 exemplo ).
2. Comece cultivos escolhendo um grânulo de células a partir de faixas de glicerol para duplicar os poços profundos de 1 ml ODM + 50 g / L de xilose como antes e incubar 48 h no sistema bem placa de profundidade (passo 10.2). Em seguida, transferir 50 ul de pré-culturas ODM para 50% culturas SGH desafio, e incubar no sistema bem prato fundo durante 72 horas para se obter um ₆₂₀ no ~ 10). Prepara-se o SGH 50% por mistura de SGH 1: 1 com ODM sem açúcar + 50 g / L de xilose (pH 5,6).
3. Para cada um dos isolados, inocular uma aliquota de SGH-N1 ou N2 SGH-16 ml com o sedimento de células (15 minutos, 2711 xg) a partir de três poços de cultura de desafio para se obter a cultura de teste inicial A ₆₂₀ ~ 2,0. Incubar culturas de ensaio a 25 & #176;. C, 180 rpm (1 "órbita) em frascos de 25 ml com tampas de esponja de silicone frascos de amostra diária e analisar por a tela de PSGHL.
4. De modo semelhante, a tela isolados como nos passos 12.2 e 12.3, mas desta vez substituto SGH-N1 e N2 com SGH-6% CSH AFEX glucano a pH 5,2 para utilização na preparação do meio de cultura de desafio meio de cultura e de ensaio. Para as culturas de desafio a 50%, 6% usar AFEX CSH diluída 1: 1 com água, uma vez que é suficiente de azoto, sem alteração.
5. Repita os passos 12,1-12,4 para duplicar os resultados.

13. Posto as Performances de isolados na tela secundária usando RPI _geral para avaliar uso de múltiplos hidrolisados completa

1. Calcular índices de desempenho relativo (RPI), a fim de classificar cada um dos top 20% dos isolados (~ 30 dos 150) a partir da tela principal que foram testados na tela secundária na enzima Sacarificada formulações hidrolisado de diferentes graus de riqueza nutricional.
2. pontuação de cadaisolados testados no ecrã secundário com base na taxa de absorção de xilose e rendimento de etanol realizada em três formulações de hidrolisado previamente tratado sacarificado com enzimas testadas em duplicado, incluindo AFEX CSH (i = 1 e 2), SGH-N1 (i = 3 e 4) e SGH -N2- (i = 5 e 6).
3. Calcule o RPI _global para cada isolado, e aplicar esse parâmetro de classificação para peneirar ainda mais a lista de isolados superiores: RPI _geral = Σ _{i = 1, n} [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _i / n, onde n = 6 .
   NOTA: Demonstrar cinética de isolados superiores na hidrolisados SGH-N2 em culturas em frascos seguindo os procedimentos em Slininger et al ^18.

Resultados

S. stipitis foi desenvolvido usando combinações de três culturas de selecção, que incluíram AFEX CSH, PSGHL, e cultura contínua xilose-Fed desafiou-etanol. A Figura 1 mostra o diagrama esquemático da evolução das experiências realizadas juntamente com os isolados encontrados tanto para executar mais eficazmente em geral, ou de forma mais eficaz em um dos hidrolisados testadas. a Tabela 3 mostra os números de acesso NRRL destes isolados superiores e resume as tensõe...

Discussão

Vários passos eram críticos para o sucesso do processo de evolução. Em primeiro lugar, é fundamental para escolher pressões de seleção apropriadas para impulsionar a evolução da população para com os fenótipos desejados que são necessários para a aplicação bem-sucedida. As seguintes tensões seletivos foram escolhidos para S. stipitis desenvolvimento e aplicados em alturas apropriadas para guiar o enriquecimento para os fenótipos desejados: forças crescentes de 12% glucano AFEX CSH (o que obr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-)	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy Flour	Archer Daniels Midland Co. (ADM)	63160	ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant)	Sigma-Aldrich	P1300	Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids	Becton Dickinson and Company	228830	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T3300	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C7352	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar	Becton Dickinson and Company	214010	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract	Becton Dickinson and Company	218630	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract	Becton Dickinson and Company	212750	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybean	Fluka	P0521-500g	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powder	Sigma-Aldrich	A8626	CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99%	Sigma-Aldrich	C3506	CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra	Sigma-Aldrich	G6779	CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99%	Sigma-Aldrich	T0376	CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99%	Sigma-Aldrich	U0750	CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS	Fisher Chemical	D16-500	CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99%	Sigma-Aldrich	X1500	CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom plates	Becton Dickinson Falcon	351172	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper	Kimberly-Clark		towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5)	Corning Life Science Glass	4980-125	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation	New Brunswick Scientific (1-800-631-5417)	M1335-0016	multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates	Applikon Biotechnology	Z365001700	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates	Applikon Biotechnology	Z365001296	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover	Applikon Biotechnology	V0W1040027	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover	Applikon Biotechnology	V0W1040001	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene	Applikon Biotechnology	ZC3DXP0240	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks	Bellco	1924-00032	Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured.	Bellco	1968-00100 (original Cat. No.)	Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer Oven	MathisAg	Typ-Nbr BFA12 215307	Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry Analyzer	YSI Life Sciences	2900D-UP	www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate Spectrophotometer	Bio-Tek Instruments, Inc	MQX200R	www.biotek.com