Combinando a microscopia Intravital fluorescente (IVFM) com modelos genéticos para estudar a dinâmica de enxertia das células hematopoiéticas para nichos de medula óssea

Resumo

Microscopia de fluorescência intravital (IVFM) da calvária é aplicada em combinação com modelos de animais geneticamente para estudar o homing e enxertia das células hematopoiéticas em nichos de medula óssea (BM).

Resumo

Aumentando a evidência indica que hematopoiese normal é regulada por distintas pistas microenvironmental na BM, que incluem especializados nichos celulares modulando funções de células-tronco hematopoiéticas crítico (HSC)^1,2. De fato, uma imagem mais detalhada do microambiente hematopoiético está a emergir, no qual o endosteal e nichos endoteliais formam unidades funcionais para a regulação da HSC normal e sua progênie^3,4,5 . Novos estudos têm revelado a importância das células perivasculares, adipócitos e células neuronais para manutenção e regulamenta HSC função^6,7,8. Além disso, há evidências de que células de linhagens diferentes, ou seja, células mieloides e linfoides, lar e residam em nichos específicos dentro do microambiente BM. No entanto, um mapeamento completo do microambiente BM e seus ocupantes ainda está em andamento.

Cepas de rato transgênicas expressando marcadores fluorescentes específicos de linhagem ou camundongos geneticamente modificados para falta de moléculas selecionadas em células específicas do nicho BM estão agora disponíveis. Mata-mata e linhagem rastreamento modelos, em combinação com abordagens de transplante, proporcionam a oportunidade de aperfeiçoar o conhecimento sobre o papel dos específicos "nicho" de células para populações hematopoiéticas definidas como HSC, células B, células T, células mieloides e eritroide de células. Esta estratégia pode ser ainda mais potencializada, mesclando-se o uso da microscopia de dois fotões da calvária. Fornecendo imagens de alta resolução na vivo e renderização 3D da calvária BM, agora podemos determinar precisamente o local onde subconjuntos específicos hematopoiéticos para casa em BM e avaliar a cinética de sua expansão ao longo do tempo. Aqui, Lys-GFP ratos transgénicos (marcação de células mieloides)⁹ e RBPJ mata-mata ratos (falta de sinalização de entalhe canônico)¹⁰ são usados em combinação com IVFM para determinar a enxertia das células mieloides de um microambiente BM defeituoso de entalhe.

Introdução

Microscopia de fluorescência do multiphoton intravital (IVFM) é uma poderosa técnica de imagem que permite para o de alta resolução, em tempo real de imagens de tecidos com profundidade de até 1mm, dependendo do tecido. Quando aplicado a calvária de rato, permite observar o comportamento das células hematopoiéticas dentro da BM de forma não-invasiva acima de 60-100 μm¹¹. Esta abordagem é usada aqui para determinar a cinética de enxertia de progenitores mieloides normais nos ratos nocaute BM de RBPJ falta canônica de sinalização Notch.

Trabalho recente do nosso grupo demonstrou que defeituoso sinalização de entalhe canônico na BM microambiente conduzem a uma doença mieloproliferativa, como¹². Perda de sinalização Notch foi obtida pela exclusão condicional do domínio de ligação do DNA de RBPJ, o fator de transcrição crítica a jusante de entalhe canônico, sinalização, usar Mx1-Cre induzida por recombinação¹⁰. Neste estudo, utilizou-se o modelo de ratos de^{salmão/salmão} Mx1-Cre/RBPJ. Exclusão condicional do motivo do DNA-ligando de RBPJ resulta na perda de sinalização de todos os receptores Notch. No modelo de Mx1-Cre, Cre expressão é conduzido pelo promotor Mx1 ativado após administração de polyI:C resultando na indução de supressão do gene alvo em células do sangue, bem como em componentes estromais de múltiplos órgãos, incluindo a BM, o baço e o fígado.

Mx1-Cre⁺/RBPJ^{salmão/salmão fumado} e Mx1-Cre^–/RBPJ^{salmão/salmão} ratos induzida com polyI:C (aqui indicado como RBPJKO e RBPJWT, respectivamente) foram letalmente irradiados e transplantado com células hematopoiéticas normais, de tipo selvagem. A partir da semana 4 após transplante, destinatários RBPJKO desenvolveram leucocitose significativa, seguido por esplenomegalia. Apesar de ratos RBPJKO apresentaram aumento percentual de progenitores mieloides no BM na semana 8 após transplante e nos pontos de tempo mais tarde, análise do BM em semanas 4 e 6 não revelou diferenças marcantes em seu conteúdo de células mieloides em relação ao controle RBPJWT destinatários. Esta observação, juntamente com o fato de que a Mx1-Cre é expresso em diferentes órgãos hematopoiéticos, levantou a questão se o microambiente BM teve impacto direto sobre a iniciação do fenótipo mieloproliferativa.

Para determinar se a BM foi um crítico site inicial do desenvolvimento da doença, IVFM da calvária de rato foi usado em combinação com BM transplante (BMT), o modelo de mata-mata RBPJ e uma sistema de rastreamento de linhagem. Ratos transgênicos expressando EGFP sob o controle do promotor (Lys-GFP) lisozima específica⁹ foram usados para obter células de doador que podem ser visualizadas durante a BM de imagem após TMO. Expressão de lisozima é específico para células mieloides e Lys-GFP marca células do progenitor mieloide comum (CMP) para os granulócitos maduros¹³.

IVFM do BM em pontos diferentes do tempo demonstrou que células de Lys-GFP homed da mesma forma para os destinatários BM de RBPJWT e RBPJKO, mas expandido e incorporada mais rápido em destinatários BM de RBPJKO. Esta diferença foi dramática no ponto anterior de tempo (semana 2) e diminuiu ao longo do tempo (semanas 4 e 6). No entanto, estes pontos de tempo mais tarde, avaliação do compartimento hematopoiética do receptor, mesmo mostrou um aumento constante no número de células mieloides circulantes em PB e localizadas no baço de ratos RBPJKO, indicando um aumento da produção de células partir do BM na circulação. Análise de Lys-GFP células localização na BM de ratos transplantados com 6 semanas revelou que células mieloides residiam mais longe da vasculatura no microambiente RBPJKO do que no controle.

Coletivamente, a combinação de IVFM com estes modelos animais específicos fornecidos introspecções na dinâmica das células mieloides no microambiente BM RBPJKO enxertia. O delineamento experimental e abordagem quantitativa descrita aqui é proposto como um paradigma que pode ser aplicado para resolver questões semelhantes. Por exemplo, o uso de outra linhagem de células específicas rastreamento modelos, tais como RAG1-GFP¹⁴ ou¹⁵ ratos Gata1-GFP pode permitir seguindo o comportamento linfoide ou eritroide progenitores, respectivamente, no BM.

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Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem a utilização de animais foram realizados com autorização do cuidado Animal e usar o Comité da Indiana University School of Medicine. Certifique-se para aderir à legislação na experimentação animal do país onde o trabalho é realizado.

1. preparação dos ratos de destinatário Mx1CreRBPJ^{- / -}

1. Cruzar os ratos Mx1-Cre⁺ com RBPJ^{salmão/salmão} ratos¹⁰ para obter Mx1-Crenegativo para positivo ^{RBPJsalmão/salmão} ratos¹² e Mx1-Cre littermates de^{salmão/salmão} RBPJ para usar como controles. Verifique se o genótipo por PCR¹⁰.
2. Usar de 6-8 semanas-velho Mx1Cre⁺/RBPJ^{salmão/salmão fumado} e Mx1Cre ratos de^{salmão/salmão –}/RBPJ para realizar a indução de polyI:C.
3. Injete polyI:C 200 µ g i.p. em Cre⁺ e Cre^– ratos. Dê uma injeção de polyI:C todos os dias durante 3 dias na primeira semana. Dê uma injeção de polyI:C na segunda semana, 7 dias depois da injeção anterior (quatro injeções no total).
   1. Use RBPJKO (induzida Mx1Cre⁺/RBPJ^{salmão/salmão}) e RBPJWT (induzido por Mx1Cre^–/RBPJ^salmão/lox) ratos como destinatários 3 semanas após a última injecção de polyI:C.
      Nota: É recomendável usar ratos induzidos por pI: pC 3 semanas após a injeção. A resposta IFNα desencadeada por polyI:C induz mudanças significativas na BM, resultando na expansão imunofenotípica do HSC e diminuição da saída de progenitores maduros para o sangue periférico^16,17. Representação de subconjuntos hematopoiéticos é normalizado a 3 semanas após a injeção e os ratos podem ser utilizados sem os confundimento efeitos da inflamação. Este protocolo de indução foi otimizado para RBPJ. Se a exclusão de um gene diferente, o protocolo de indução pode variar dependendo da construção, e exclusão deve ser validado. Nós validado ~ 100% exclusão da região entre sites loxP por RT-PCR após um total de quatro injeções de polyI:C RBPJ.

2. preparação de Lys-EGFP células de medula óssea de doador para transplante

1. Eutanásia em um rato de Lys-EGFP (dióxido de carbono, seguido por deslocamento cervical) 1 ou 2 h antes do transplante.
2. Borrife a superfície do corpo animal com etanol a 70%.
3. Use tesoura cirúrgica para fazer uma incisão na pele em ambas as pernas ao redor do tornozelo e com fórceps cirúrgico afastar pele e pele juntos para expor o tecido muscular limpa.
4. Use uma tesoura cirúrgica para remover tanto músculo das pernas quanto possível. Usando uma tesoura, corte os ossos (no joelho e articulação do tornozelo) e limpar qualquer tecido muscular remanescente dos fêmures e tíbias usando esponjas de gaze. Coloque os ossos (dois fêmures e dois tíbias) em uma placa de 6 contendo DMEM 10% FBS.
5. Esmaga os ossos em um almofariz com 10ml frio 2mM EDTA PBS e pipetar as células da medula óssea para trazer as células em suspensão de célula única. Alternativamente, limpar os ossos com tempos de 2 mM EDTA PBS 3 de cada lado com uma seringa de 1 mL.
6. Filtre as células de medula óssea usando um filtro de 70 µm em um tubo de centrífuga de 15 mL. Lave o filtro com 2-3 mL de PBS. Girar as células para baixo de 10 min a 460 x g, Ressuspender as células em 10 mL de DMEM fresco 10% FBS.
7. Contar as células de medula óssea em um hemocytometer e ajustar a concentração de 1,5 x 10⁷ células/mL em IMDM sem soro. Use 3 x 10⁶ células por animal com um volume de 200 µ l. Cerca de 1/3 do total BM são células GFP + mieloides. Embora as células no gelo até que esteja pronto para a injeção. Use 0.5 x 10⁵ células para determinar a expressão de GFP por FACS⁹.

3. medula óssea transplante de células de Lys-GFP em ratos RBPJKO

1. Contenha o destinatários ratos em uma gaiola de torta. A irradiação de ratos com uma dose letal de radiação gama (1.200 Rad) sobre uma difusora de Cs-137. Usar um protocolo de dose dividida: 900 rads à noite seguido por 300 rads (16 h separado) na manhã seguinte.
2. Os ratos de destinatário letalmente irradiados RBPJWT e RBPJKO de transplante 5-6 h após a segunda dose de radiação. BM de injetar células colhidas de ratos de Lys-EGFP em uma concentração de 3 x 10⁶ células por animais através de injecção veia cauda (veja mais detalhes para a colheita de células na secção 2).
3. Coortes independentes dos ratos transplantados por IVFM nos pontos de tempo diferente da imagem: 24 h e em semanas 2, 4 e 6, conforme descrito abaixo (ver secção 4 & 5 na vivo procedimento de imagem).

4. cirúrgica preparação para a imagem latente Intravital

1. Esterilize instrumentos cirúrgicos. Dois belos fórceps (um direto, um ângulo), um par de tesouras bem e um par de suportes de agulha. Prepare a área operacional com todos os suprimentos necessários para o procedimento.
2. Dê o mouse uma injeção de IP de coquetel anestésico cetamina (xilazina 2,5-5 mg/kg + acepromazina 1.0-2.5 mg/kg + cetamina 90-100 mg/kg) usando uma seringa de agulha de 26-28 G.  Animal será monitorizada cada 15 minutos durante o procedimento e anestesia será complementada conforme necessário em ¼ da dose da original.
3. Coloque o mouse sobre uma fonte de calor adequada (almofada de aquecimento de 37 ° C, animal protegido do contato direto com a almofada de aquecimento) e monitorar visualmente a taxa respiratória.
4. Verifica reflexos usando o dedo beliscar a resposta. Certifique-se de que o animal está sob anestesia antes de iniciar qualquer procedimento cirúrgico.
5. Uso um 26-28 gauge agulha seringa para dar ratos uma injeção de veia da cauda de um marcador fluorescente de vascular (dextrano, 100 μL de solução 20 mg/mL).
6. Aplica pomada de vet para ambos os olhos. Grampeie a superfície dorsal da cabeça do animal com tosquiadeiras elétricas pequenas. Aplica uma creme para esponjas de gaze de uso de 5 min. remover o creme e em seguida enxaguar com solução salina de depilação. Prepare o couro cabeludo limpo com álcool 70%, usando um cotonete.
7. Use pinça fina e tesoura para fazer uma pequena incisão de pele (10-20 mm) no couro cabeludo para expor a superfície dorsal do crânio subjacente. Use seda cirúrgica 5-0 para colocar duas suturas de estadia na pele de cada lado da incisão, criando uma aba para expor a calvária para a imagem latente.
8. Posicionar os ratos em suas costas e couro cabeludo exposto em um prato fundo de vidro enchido com o óleo do microscópio, mergulhe. Transporte o animal para o mutiphoton sala de imagem.
9. Coloque o animal no palco microscópio com a calvária posicionada sobre o prato de vidro acima do objectivo e, em seguida, cubra com um 37almofada de aquecimento ° C (animal deve ser protegido do contato direto com o calor).

5. in Vivo imagens de alta resolução da calvária de rato

1. Usar um sistema confocal invertido modificado para a imagem latente do multiphoton (ver tabelade materiais ). Seguir indicações do fabricante sintonizar um 2-fóton laser de 830 nm, lugar a 20 W X, at 0.95 lente objetiva no pedaço de nariz de microscópio e verificar o alinhamento do feixe de laser.
   Nota: Microscópio vertical sistemas são mais comumente utilizados para estes estudos, mas também pode ser utilizado um sistema do multiphoton invertido. Neste estudo, utilizou-se um dispositivo estereotáxica atraumática projetada personalizada. Embora haja vários dispositivos estereotáxicos comercialmente disponíveis para sistemas de microscópio vertical, não há nenhum dispositivo disponível comercialmente estereotáxica para um sistema de microscópio invertido que visavam garantir o crânio do mouse. Como alternativa a um dispositivo personalizado estereotáxica, o crânio pode ser fixado na posição acima o objetivo utilizando vários métodos de fita ou cola para a estabilidade.
2. Abra um software de aquisição de imagem. Nas configurações de"aquisição" painel Verifique se um modo de digitalização direcional é selecionado. Configurar a velocidade de varredura de 4 μs/pixel, taxa de quadros para 512 x 512 pixels e zoom para 1,5. Selecione 20 objetivo X W at 0,95 de lista de disponíveis lentes objetivas para coincidir com a lente posicionada no inalador nasal.
3. Acessar a lista de"tintura" no painel de "Controle de aquisição de imagem" e selecione "Dois fótons". Abra a janela "Caminho da luz & corantes" e selecione DM690-980 excitação DM. Open o obturador de laser 2P, marcando a caixa de verificação na unidade Laser 2. Na janela "Controlador de microscópio", selecione RDM690 espelho.
4. Selecione "Lâmpada de EPI", escolha o cubo do epi-filtro B/G e focar o objetivo para o espécime para visualizar fluxo vascular e o nicho de medula óssea de calvária, usando como referência a bifurcação da veia central (a) e a sutura coronária (b) (Figura 2A).
5. Recolha imagens usando o modo de não-descanned. Selecione três detectores externos: PGTO detector1 para coletar o sinal SHG de colágeno (filtro de emissão - 430/100 nm), GaAsP detector2 para coletar sinal GFP (filtro de emissão - 525/50) e GaAsP detector3 para coletar o sinal do TRITC-dextran (filtro de emissão - 605/90 nm).
   1. Realize imagens a uma taxa de varredura de 4μs/pixel com nenhuma média para minimizar a fototoxicidade. Recolha imagens em um ganho de potência e detector laser constante ajustada para utilizar a gama dinâmica plena do detector com saturação mínima.
   2. Recolha série de secções através da profundidade do tecido (60 x 1 μm Z-pilhas) de 6 regiões da medula óssea de calvária. Use as configurações de tamanho de passo de 1 μm, zoom 1.5 e 512 x 512 pixels tamanho do quadro (423 µm x 423 µm).
      Nota: Total, tempo total necessário para a imagem de um rato é 1-1,5 h.

6. análise quantitativa

1. Executar as reconstruções de quantificação e 3D de imagem usando um software de visualização e quantificação de dedicado imagem 3D/4D conforme as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais). Visualize interativamente Z-pilhas em 3D utilizando a projeção de intensidade máxima (MIP), alfa-mistura ou algoritmos de processamento de volume de projeção sombra.
2. Segmento de células GFP usando o "módulo de segmentação local objeto". Aplica processamento aritmético de pilha (subtração de canal) para eliminar falsa positiva contagem de células GFP (isso elimina o sinal das células ósseas exibindo forte fluorescência nos canais verdes e vermelhos).
3. Execute a segmentação da vasculatura e osso superfície usando o módulo de superfície de segmentação. Se necessário, calcule distâncias de células para qualquer das superfícies acima aplicando algoritmos X-tensão, chamados "distância do ponto à superfície".

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Resultados

Coortes de 2 RBPJKO e 2 RBPJWT de destinatários foram fotografadas em uma sessão individual de imagens em pontos diferentes do tempo: 24h e 2, 4 e 6 semanas após o transplante de células de BM Lys-GFP (fluxo de trabalho é ilustrado na figura 1A).

Em cada rato, imagens foram adquiridas de 6 regiões padrão da calvária BM, identificado por sua posição em relação a bifurcação da veia central (F...

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Discussão

Este protocolo descreve um delineamento experimental otimizado para estudar a cinética da enxertia de células hematopoiéticas por microscopia Intravital fluorescente. Neste estudo, a expansão de células progenitoras mieloides em um BM WT ou em um entalhe sinalização defeituoso BM foi controlada a calvária óssea por células mieloides positivas seguintes de Lys-GFP após TMO em destinatários RBPJWT ou RBPJKO. Esta abordagem é proposta como um modelo que pode ser aplicado para responder a perguntas semelhantes, ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine cocktail	IU School of Medicine		Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg
TRITC dextran	Tdb Consultancy	TD150-100mg	Other color dextran may be used.
Andis hair trimmer	Braintree Scientific	CLP-323 75
Gauze sponge	Med Vet International	PK224	4-ply, 2 x 2
Nair depilatory cream	Commercial store
Saline	Med Vet International	RXSAL-POD1LT	0.9% Sodium Chloride poly bottle
Insulin syringe	Fisher Scientific	14-826-79	28 g, 1/2 cc
Fine Forceps	Fine Science Tools	00108-11, 00109-11	straight forcep, angled forcep
Scissor	Fine Science Tools	15018-10
Needle holder	Fine Science Tools	12002-14
5-0 silk suture	Fisher Scientific	MV-682	Other non-absorbable suture may be used
WillCo- glass bottom dish	WillCo	GWSt-5040
Optical microscope oil	Leica
Stereotaxic stage insert	IU School of Medicine	Custom design
Olympus FV1000 confocal microscope system	Olympus
Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective	Olympus
Small heating pad	Commercial store		Zoo Med reptile heating pad
Imaris 8.1 imaging software	Bitplane		3/4 D Image Visualization and Analysis software