In Vitro permeação de Ferritinas FITC-carregados através de um Rat barreira sangue-cérebro: um modelo para estudar a Entrega de Nanoformulated Moléculas

Resumo

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

Resumo

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

Introdução

A resistência do sistema nervoso central (SNC) de doenças (ou seja. O cancro, epilepsia, depressão, esquizofrenia e desordem neurológica associada ao HIV) para terapias farmacológicas é devido a vários mecanismos diferentes, incluindo permeação do fármaco árdua através da barreira sangue-cérebro (BBB) . O BBB é a fronteira que isola tecidos do cérebro a partir de substâncias que circulam no sangue. Dentro desta barreira, uma camada de células endoteliais microvasculares cerebrais (BMECs), suportados por pericitos e endfeet astrócitos, é responsável pela elevada selectividade da certificação para aquelas drogas hidrossolúveis com um peso molecular superior a 400 Da ^1. Outro mecanismo de resistência relacionada com a droga está ligada à presença na BMECs dos transportadores de efluxo de drogas (proteínas glicoproteína-P e resistência a múltiplas drogas), que co-atuam para reduzir a penetração da droga no SNC e facilitar a sua extrusão do cérebro ^2.

Na última década, Um grande número de abordagens nanotecnologia têm sido desenvolvidos para satisfazer o desafio biológica e clinica de entrega de drogas através da certificação ^3-6. Neste contexto, nanoesferas ferritina (Fnn) representam uma solução completamente inovadora e promissora. Fnn são 12 esferas nm de 24 ferritina auto-montagem (Fn) monômeros, que são dispostos em uma estrutura esférica oca, de 8 de diâmetro interno nm. subunidades de ferritina pode ser desmontado em pH ácido e reagrupados numa forma com memória de forma, trazendo o pH até à neutralidade, permitindo que várias moléculas orgânicas a ser encapsulado. Portanto, Fnn representam um modelo interessante para o desenvolvimento de multifuncional entrega da droga sistemas ^7,8. Além disso, podem interagir com Fnn BMECs graças ao reconhecimento específico de receptor de transferrina (TfR) 1, que é expresso sobre a membrana luminal destas células ^9.

Até agora, diferentes em modelos in vitro da BHE foram desenvolvidos na order para elucidar trans-certificação permeabilidade para vários fármacos, a toxicidade para a certificação, ou a interacção de moléculas com transportadores de efluxo. De facto, estes modelos são considerados válidos abordagens in vitro para uma triagem rápida de moléculas activas, antes de prosseguir com os estudos in vivo. Estes modelos consistir de uma única camada endotelial de BMECs ou BMECs astrócitos e co-cultivadas (mais raramente) pericitos, obtido a partir de animais (rato, ratinho, porco e bovino) ou linhas celulares humanas ^10,11,12. A resistência eléctrica transendotelial (TEER) e a permeabilidade aparente (P _app) de marcadores com um peso molecular definido representam dois parâmetros críticos que são usados ​​para determinar a qualidade do modelo in vitro. Aqui nós descrevemos o emprego de um modelo de certificação in vitro, com base numa co-cultura de rato BMECs (RBMECs) e Rat astrócitos corticais (RCA) para estudar a permeação trans-BBB de nanocages ferritina encapsular isothi fluoresceínaocyanate (FITC).

Protocolo

1. Estabelecer o modelo de certificação

Nota: Para estabelecer o modelo de certificação, sugerimos o uso RBMECs primários disponíveis comercialmente e RCA. Todos os passos devem ser executados com reagentes estéreis e descartáveis, manipulados numa câmara de fluxo laminar.

1. Cultura de células
   1. frascos de cultura de células com revestimento de poli-L-lisina 100 ug / ml (1 h à temperatura ambiente) ou fibronectina 50 ug / ml (1 h a 37 ° C) para promover a ligação de RCA ou RBMECs, respectivamente. Em seguida, descongelar 1 x 10 ⁶ RCA e 5 x 10 ⁵ RBMECs em meio de células endoteliais, suplementado com 5% de soro fetal bovino, suplemento de crescimento celular endotelial 1% e 1% de penicilina / estreptomicina (SECM). RCAs de sementes em um frasco T175 em 20 ml SECM e RBMECs em um frasco T75 em 10 ml SECM.
      Nota: A descongelação e passagens de semeadura de RCA e RBMECs deve ser ajustada, em termos de densidade celular e o tempo em cultura, de acordo com o número de condições experimentais a ser testado com o modelo de certificação. Ao inícioção com um frasco de 1 x 10 ⁶ RCA e um frasco de 5 x 10 ⁵ RBMECs, é possível obter-se a 20 inserções de certificação de rolamento.
   2. Manter as células a 37 ° C e 5% de _CO2 numa atmosfera húmida durante cerca de 6 dias, até cerca de 80% de confluência de RCA e mais de 90% de confluência para RBMECs. Retire células utilizando uma solução de tripsina-EDTA (tripsina 1: 250) durante 5 min (1 ml de tripsina para frascos T75 e 2 ml para frascos T175). Pare a actividade da tripsina com SECM (2: 1), suspensões de células, centrifugar a 750 x g durante 5 minutos e voltar a suspender as pelotas em 60 ml SECM.
   3. Dividir os RBMECs em 3 frascos T175 e cultura em SECM por mais 3 dias antes da semeadura em inserções. Contar o número total de vida RCA, por observação de uma suspensão de células diluída 1: 1 com o azul de tripano ao microscópio óptico numa câmara de Burker.
2. Semeadura de células em inserções
   1. Tratar um lado do tereftalato de polietileno (PET) de membrana de transpa 6 multi-poçosinserções ent com poli-L-lisina 100 ug / ml e do outro lado com fibronectina 50 ug / ml, para permitir a ligação de RCA e BMECs. Lidar com as inserções com uma pinça, a fim de evitar o contacto com a membrana PET.
      1. Coloque as inserções em uma placa de 6 poços e adicionar solução de fibronectina (mínimo de 500 ul) para dentro da câmara superior. Após 1 h de incubação a 37 ° C, remover a solução de fibronectina, tomar as pastilhas da placa multi-poços e colocá-los de cabeça para baixo na parte inferior do de 150 ^cm2 numa caixa de Petri, que é aqui utilizada como um suporte estéril para o já revestido inserções.
      2. Adicionar cuidadosamente 800 ul de poli-L-lisina sobre o lado inferior do inserto (como mostrado na Figura 1A; referido como sementeira RCA), e manter a solução sobre as pastilhas durante 1 h à TA.
      3. Aspirar a solução e deixar que as inserções secar à temperatura ambiente durante 15-30 min. As inserções estão agora prontos para a semeadura de células, mas também pode ser armazenada na placa multi-poços para váriasdias a 4 ° C, antes de prosseguir com a construção BBB.
         Nota: Lembre-se de manter pelo menos 3 inserções revestidas livre de células, para ser usado como controles para validar estabelecimento BBB pela FD40 medições de fluxo.
   2. RCA sementes (35000 / cm ²⁾ sobre o lado inferior das inserções poli-L-lisina-revestidas, deixando cair a 800 ul de suspensão de células para a inserção de cabeça para baixo (Figura 1A). Deixar a suspensão RCA nas pastilhas durante 4 h à TA, a fim de permitir a ligação eficiente das células à membrana.
   3. Aspirar a solução residual, colocar as inserções em poços contendo 2 ml de SECM e manter a placa de multi-poços, a 37 ° C e 5% de _CO2 numa atmosfera humidificada, a alteração do SECM a cada 2 dias.
   4. Após 3 dias, quando os RCA ter revestido a face inferior da peça inserta, RBMECs semente sobre o lado superior da peça inserta, seguindo estes passos:
      1. Retire RBMECs de frascos T175 e contar océlulas vivas totais, conforme relatado nos passos 1.1.2 e 1.1.3.
      2. RBMECs sementes (60000 / cm ²⁾ sobre a superfície superior do inserto no SECM (1,000 mL) (Figura 1B), deixando 3 inserções com apenas os astrócitos, para ser utilizado como fundo TEER. Colocar a placa de multi-poços em condições de cultura padrão. Manter o sistema para a cultura durante pelo menos 3 dias, mudando o SECM na câmara interior e inferior a cada 2 dias.

2. Validação BBB

1. Medição TEER
   1. No dia 3 ^rd de co-cultura, verificar o TEER inserindo as inserções de certificação de rolamento para uma câmara apropriada (que tem uma tampa e que ambos câmara e o tampão conter um par de tensão de detecção e eléctrodos de corrente), encheu-se com quatro ml de SECM. Ligue a um epitelial volts de tecido / ohmímetro.
   2. Juntamente com as medições TEER do BBB-sistemas celulares, registre os valores TEER dos 3 inserções, levando as RCAs them vão ser subtraídos dos valores obtidos com o BBBs. Multiplicar os valores TEER resultantes por a superfície da peça inserta (4,2 cm ^2), a fim de expressar os resultados como Ω x ² cm.
   3. A partir do ^3º dia de co-cultura, medir a TEER todos os dias. Nota: Após um período inicial em que o TEER aumenta, os valores registados devem permanecer estáveis ​​durante pelo menos dois dias consecutivos (normalmente entre a ⁵ e a 7 ^​​° dia de co-cultura). Nesse ponto, a certificação está pronta para o segundo passo de validação (secção 2.2) e / ou para as experiências de trans-BBB.
      Nota: O procedimento descrito na secção 2.1, pode ser realizada nas mesmas BBB-sistemas dedicados para as seguintes experiências de permeabilidade (secção 3). Operar sob condições estéreis.
2. Trans-BBB Flux de FITC-dextrano 40 (FD40)
   1. Medir o fluxo FD40 da parte superior para a câmara inferior dos modelos de BBB comparada com a do outro lado 3 inserções vazios(Ver a nota do ponto 1.2.1) de acordo com as seguintes etapas:
      1. Adicionar 1 mg / ml FD40 (diluído em SECM) no compartimento superior do BBBs, e após 1, 2 e 3 h retirar 200 ul SECM da câmara inferior e medir a intensidade da fluorescência por espectrof (λ _ex 488 nm, λ _in 515 nm, fenda 5).
      2. Obter os valores para SECM fundo fluorescenceby medindo 500 ul de meio virgem utilizando os mesmos parâmetros analíticos. Subtrair o fundo de fluorescência SECM de todos os valores de fluorescência FD40.
      3. Determinar a quantidade de FD40 permeado por comparação dos valores de fluorescência observado com uma curva de calibração produzida com concentrações conhecidas (ie. 0,312, 0,625, 1,25, 2,5 ug / mL) do marcador fluorescente dissolvido em 500 ul de SECM.
      4. Calcular o coeficiente de permeabilidade aparente (P _app) a partir dos valores de fluxo médios de acordo com:
         P _app = J / AC
         Em que J é o fluxo da molécula de (moles / seg), A é ​​a área de permeação ⁽² cm) e C é a concentração da molécula no compartimento superior (moles / ^cm3).
         Nota: Três ou mais BBB-sistemas que tenham atingido valores TEER adequados, devem ser exclusivamente dedicados a este procedimento de validação, e não deve ser empregue para as seguintes experiências de permeabilidade (secção 3). A esterilidade não é obrigatória.

3. Trans-BBB permeação de Ferritinas FITC-carregado (Fnn)

Nota: Uma variante recombinante de ferritina humana (FN), produzido em Escherichia coli e montados em nanocages (Fnn) para a encapsulação de diferentes moléculas fluorescentes, estão disponíveis a partir do NanoBioLab do Prof. Prosperi (Universidade de Milão-Bicocca, Itália). FNN são carregados com FITC, de acordo com um protocolo previamente descrito ¹³ e as concentrações de ambas as moléculas e Fn são carregados com exactidão determinEd.

1. Trans-certificação fluxo de FITC e FITC-FNN
   1. Medir o fluxo de FITC-FNN a partir da parte superior para a câmara inferior de modelos de BBB validados (normalmente na ^5ª - 7 ^° dia de co-cultura), em comparação com a do corante livre depois de 7 e 24 horas de incubação, de acordo com a as etapas a seguir:
      1. Adicionar FITC-FNN (50 ug / ml Fnn, 1,1 uM FITC) ou uma quantidade igual de livre FITC para dentro da câmara superior de pelo menos 6 sistemas BBB para cada formulação, a fim de retirar a 2 ml de solução SECM a partir da câmara inferior pelo menos 3 inserções após 7 horas, e da câmara baixa do outros 3 inserções após 24 horas.
      2. Medir a intensidade de fluorescência de 500 ul das amostras recolhidas por espectrof (λ _ex 488 nm, λ _in 515 nm, fenda de 5).
      3. Obter a fluorescência de fundo SECM medindo 500 ul de meio utilizando os mesmos parâmetros analíticos. Subtrair a fluorescência de fundo SECMa partir de todos os valores de fluorescência ou FITC FITC-FNN.
      4. Determinar a concentração do permeado com FITC ou FITC-FNN pela comparação dos valores de fluorescência obtidos com duas curvas de calibração diferentes, produzidos com concentrações conhecidas (isto é,. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) do corante livre ou nanoformulated dissolvido em 500 ul SECM.
2. FITC-Fnn Localização no RBMECs
   1. Remover SECM da câmara superior dos sistemas de BBB, lavar as inserções com PBS e fixar os RBMECs em, pelo menos, duas pastilhas de cada grupo experimental por adição de 500 uL de paraformaldeído (4% em tampão fosfato salino-PBS) no compartimento superior para 10 min à temperatura ambiente.
   2. Lavam-se as pastilhas três vezes com PBS para remover o paraf ormaldeido residual.
      Nota: Deste ponto em diante, a esterilidade não é necessário.
   3. Corte pedaços adequados da membrana PET, e prosseguir com a immunodecoration das células de acordo com os seguintes passos:
      1. permealize RBMECs com 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 10 minutos. Realizar uma etapa de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente com uma solução contendo 2% de albumina de soro bovino (BSA), soro de cabra a 2% em PBS. Incubar as amostras com uma Willebrand factor anti-Von (vWF) a diluição de 1:20, durante 2 h à TA.
      2. Após lavagem três vezes com PBS, expor as células durante 2 horas à temperatura ambiente a uma BSA 2%, solução de soro de cabra a 2% contendo um anticorpo secundário adequado, a uma diluição de 1: 300, a fim de revelar o anti-VWR, e DAPI numa diluição de 1: 1500 para detecção de núcleos.
   4. Monte as peças de inserção em lâminas de microscópio utilizando uma solução de montagem Antifade (uma gota por fragmento de inserção), em seguida, feche a amostra com uma lamela. Analisar por microscopia confocal usando uma lente de imersão em óleo e 40X, 1,5 zoom e resolução de 1.024 x 1.024 pixels.

Resultados

Durante o estabelecimento do modelo de certificação, a fixação de células e crescimento das inserções pode ser monitorizada utilizando um microscópio de luz graças à natureza transparente das membranas de PET. RCA, semeadas a uma densidade de 35.000 células / ^cm2, prender de forma eficiente para o lado inferior do inserto após 4 h de incubação à temperatura ambiente (Figura 2A) e crescem-se a cobrir a superfície da membrana em 3 dias, tendo uma...

Discussão

O método in vitro descrito aqui, representa uma abordagem útil validado para estudar a entrega trans-certificação de moléculas fluorescentes mediante nanoformulation com nanopartículas. Aqui usamos Fnn, o que representa um bom candidato para estudar a translocação de moléculas de carga através da bbb. FNN é considerado o nanovector ouro para a certificação trans-entrega de drogas / agentes uma vez que é especificamente reconhecido pelo receptor TfR1, que é expresso sobre a membrana luminal de BME...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Brain Microvascular Endothelial Cells	Innoprot	P10308	isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen
Cortical Astrocytes	Innoprot	P10202	isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen.
Endothelial Cell Medium kit	Innoprot	P60104	ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light
Trypsin-EDTA without Phenol Red	EuroClone	ECM0920D	Warm in 37 °C water bath before use
Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000	Sigma	FD40S	protect from light
paraformaldehyde	Sigma	158127	diluition in chemical hood
Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg	EuroClone	ECB4004L
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
goat serum	EuroClone	ECS0200D
mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor	Dako	M0616
AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs	ThermoFischer Scientific	A-11003	protect from light
DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole)	ThermoFischer Scientific	D1306	protect from light
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFischer Scientific	P36934
Poly-L-lysine Hydrobromide	Sigma	P1274	the same solution can be used several times
fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141	the same solution can be used several times
Polyethylene terephthalate (PET) inserts	Falcon	F3090	Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area
T75 Primo TC flask	EuroClone	ET7076
T175 Primo TC flask	EuroClone	ET7181
EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter	World Precision Instruments Germany	EVOM2
Endohm- 24SNAP cup	World Precision Instruments Germany	ENDOHM-24SNAP
Light/fluorescence microscope with camera	Leica Microsystems	DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module	inverted microscope for live cells with camera
Confocal Microscope	Leica Microsystems	TCS SPE
Spectrofluorimeter	Jasco	FP-8000