Exploração objeto romance como um ensaio de Potencial de ordem superior comportamentos repetitivos em Ratos

Resumo

Higher order restricted, repetitive behaviors (RRBs) disrupt the lives of affected individuals. These behaviors are challenging to model in rodents, making basic biomedical research into potential treatments or interventions for RRBs difficult. Here we describe novel object exploration as a potential assay for higher order RRBs in mice.

Resumo

Restricted, repetitive behaviors (RRBs) are a core feature of autism spectrum disorder (ASD) and disrupt the lives of affected individuals. RRBs are commonly split into lower-order and higher-order components, with lower order RRBs consisting of motor stereotypies and higher order RRBs consisting of perseverative and sequencing behaviors. Higher order RRBs are challenging to model in mice. Current assays for RRBs in mice focus primarily on the lower order components, making basic biomedical research into potential treatments or interventions for higher-order RRBs difficult. Here we describe a new assay, novel object exploration. This assay uses a basic open-field arena with four novel objects placed around the perimeter. The test mouse is allowed to freely explore the arena and the order in which the mouse investigates the novel objects is recorded. From these data, patterned sequences of exploration can be identified, as can the most preferred object for each mouse. The representative data shared here and past results using the novel object exploration assay illustrate that inbred mouse strains do demonstrate different behavior in this assay and that strains with elevated lower order RRBs also show elevated patterned behavior. As such, the novel object exploration assay appears to possess good face validity for higher order RRBs in humans and may be a valuable assay for future studies investigating novel therapeutics for ASD.

Introdução

Transtorno do espectro do autismo (ASD) é um distúrbio neurológico que consiste em três sintomas principais: comprometimento social, dificuldade para se comunicar por meio da linguagem e comportamentos repetitivos estampados ^1. Desde 2000, o número de pessoas que foram diagnosticadas com ASD aumentou de 1 em 150 a 1 em 68 no espaço de dez anos ^2. Embora a prevalência da doença continua a aumentar, a causa da desordem não é ainda conhecido. Houve um aumento nos esforços para identificar modelos de mouse apropriados para o núcleo e os sintomas associados da ASD, como esses modelos poderiam levar a uma maior compreensão dos sintomas subjacentes e as causas da ASD. Existem várias estirpes puras de mouse que aparecem para exibir comportamentos com validade de face para os sintomas centrais da ASD, incluindo comportamentos repetitivos ^3.

Restritos, comportamentos repetitivos (RRBs) são um sintoma central de alguns transtornos psiquiátricos, como ASD.RRBs pode aumentar com a gravidade da desordem ^4, e pode perturbar drasticamente o estilo de vida dos indivíduos afectados. RRBs são normalmente colocados em duas categorias, de ordem inferior comportamentos repetitivos, que em humanos consistem em ações tais como balançar e mão-agitando; e de ordem superior comportamentos repetitivos, que consistem em estrita adesão a rotina e resistência à mudança ^5-8.

Lower ordem comportamentos repetitivos têm sido amplamente estudados em roedores onde eles se manifestam como estereotipias motor, que pode ser facilmente observados na criação de um laboratório ^9. Esses comportamentos parecem ter boa validade de face para RRBs em seres humanos, e potencialmente forte validade do construto bem ^10. Teste para a presença de RRBs ordem inferior pode ser concluída através de monitoramento de vídeo da atividade do rato para estudar as lutas ea duração desses estereotipias motoras ^11. ordem superior comportamentos repetitivos representar um desafio para re biomédica básicaprocurar utilizando roedores, uma vez que estes RRBs não são tão facilmente identificados através de simples observação. Devido à dificuldade em identificar esses comportamentos, menos ensaios estabelecidos para o comportamento repetitivo de ordem superior existem. Tradicionalmente, RRBs de ordem superior ter sido medidos em roedores utilizando um paradigma do labirinto em que o animal de teste está treinado para chegar a competência em escapar. A localização de escape é então ligado eo número de ensaios necessários para re-aprender a localização de fuga é registrada ^12. Estes ensaios não são ideais como eles exigem um período de treinamento longo, muitas vezes induzem ansiedade, e pode resultar em resultados altamente variáveis. A exploração do furo de bordo também tem sido utilizada para quantificar de ordem superior RRBs ^13,14. Esta abordagem não requer treinamentos prolongados, mas não contar com a motivação de alimentos e / ou discriminação olfativa. Os ensaios para RRBs de ordem superior que não são ansiogênica ou exigem treinamento seria um bom complemento para o repertório existente de Exploratio hole-board n e ensaios baseados em Maze atualmente em uso.

O C58 / J (C58) estirpe consanguínea rato exemplifica fortemente altos níveis de comportamento estereotipado associado com ASD, ou seja, repetitivos, estereotipias motoras sem propósito e os níveis elevados de auto-preparação ^3,11. Além disso, os camundongos C58 exibir RRBs através de altos níveis de dependência, de volta sacudindo e scrabbling ^11,14,16. Esta estirpe começa mostrando esses comportamentos no início do período neonatal e continua a exibi-los durante a vida adulta. Seria ideal para ser capaz de testar a presença de elevados de ordem mais elevada RRBs para complementar os de ordem mais baixa RRBs bem documentados presentes nesta estirpe, bem como outras estirpes de ratinho. O ensaio objeto de exploração romance aqui descrito proporciona a oportunidade para pesquisadores observar inferior ordem e RRBs de ordem superior em simultâneo, uma vez que dá a capacidade de medir comportamentos padronizados, bem como estereotipias motoras repetitivas.

e_content "> Utilizando nova exploração como objecto um ensaio para a de ordem superior comportamentos repetitivos foi desenvolvido por Pearson et ai. ^17. Esta nova avaliação é uma extensão do teste de campo aberto bem estabelecida ^18-21 com a adição de quatro novos objectos arena. os ratos foram deixados a investigar livremente estes desconhecidas objectos e o número e ordem das investigações objecto foi registado. as investigações de objecto foram então analisadas para a presença de padrões, com ratinhos BTBR apresentação de números elevados de investigações estampados entre os objectos. Utilizando este ensaio, os ratos podem exibir de ordem superior comportamentos repetitivos e padronizados, eliminando a necessidade de aprender comportamentos, bem como a remoção de estímulos desnecessários. exploração novela objeto induz RRBs de ordem superior, pois permite que os ratos para criar padrões e sequências de formulário através de sua exploração naturais . Utilizando este ensaio permite ao investigador quantificar a presença destes RRBs de ordem superior.

Pearson et ai. desenvolveu este ensaio e é usado para testar a presença de potenciais de ordem superior comportamentos repetitivos na estirpe de ratinhos consanguíneos BTBR, com resultados intrigantes ^17. Temos publicou recentemente um estudo follow-up olhar para os comportamentos do C58, C57BL / 6J (C57) e / NJ (FVB) estirpes FVB, bem como uma investigação mais detalhada para potenciais variáveis ​​de confusão presentes neste ensaio, e possível abordagens estatísticas para analisar os dados gerados ^22.

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Protocolo

O protocolo aqui descrito foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Redlands. Os ratinhos C58, C57, e FVB utilizados nestes estudos foram criados no biotério da Universidade de Redlands de estoque originalmente obtidos a partir do Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Sentinelas deste biotério foram rastreados a cada seis meses e verificou-se ser livre de patógenos.

1. Equipamentos e quarto configurar

Nota: Foram utilizadas duas arenas diferentes para romance testes objeto: uma gaiola retangular de plástico transparente (45 cm x 24 cm x 20 cm) ou um gaiola circular opaca, com um diâmetro de base de 41 cm; No entanto, pode ser utilizado qualquer gaiola. Pearson et al., Utilizando uma gaiola rectangular menor (20 cm x 30 cm x 20 cm) no seu ensaio. Detalhes deste projeto experimental específico estão incluídas abaixo, mas dada a novidade deste ensaio, não há padrões aceitos dentro do campo da fenotipagem comportamental para qualquer uma das variáveis ​​descritas.

1. Preencha a arena de testes com cerca de ½ pol de cama milho-cob.
2. Selecionar quatro diferentes objetos novos. Escolha quatro objectos que são aproximadamente do mesmo tamanho, construídos de plástico de alta densidade para facilitar a limpeza e resistir à mastigação e diferentes umas das outras em forma e cor. Importante, assegurar que os ratinhos de teste não estão expostos a esses objetos até ser executado no ensaio.
   Nota: Por exemplo, um tijolo rosa brinquedo, um macaco vermelho, um azulejo branco com escrita azul e uma matriz branca padrão foram usados ​​aqui.
3. Na arena retangular, colocar esses objetos aproximadamente 3 cm dos cantos. Na arena redondo, colocar os objectos de modo a que eles estão a distâncias iguais uns aos outros e cerca de 10 centímetros a partir dos lados. Grave a colocação de cada objecto como um número diferente, 1-4 (Figura 1). Certifique-se de que os objectos são colocados numa ordem aleatória ou contrapeso ao longo do teste.
4. Posicionar uma câmera diretamente acima do testearena para gravar toda a arena durante os períodos de aclimatação e de ensaio.
   Nota: Tendo investigadores no mesmo quarto com os ratos podem potencialmente influenciar os níveis de atividade e exploração durante os testes.

2. novela objeto Exploração Teste

1. Teste no início do ciclo de luz numa sala iluminada com luz fluorescente a aproximadamente 100 lux. Certifique-se de que a iluminação é uniforme em toda a arena de testes para padronizar a aparência durante a gravação de vídeo.
2. Coloque um notecard de dimensões conhecidas na parte inferior da arena de teste e iniciar a gravação vídeo.
3. Transferir o rato de ensaio numa arena de teste vazio durante 10 minutos para servir como um período de aclimatação. gravação de vídeo o período de aclimatação.
4. Após o período de aclimatação, deixe o mouse na arena, rapidamente adicionar os quatro novos objetos para a arena de teste e registrar o comportamento do rato para um adicional de 10 min.
5. Uma vez que o total de 20 minutos de aclimatação PE / testeríodo decorrido, retornar o mouse teste à sua gaiola e bem limpa e seca os novos objetos e arena de testes com sabão sem perfume e água.

3. Vídeo Scoring

1. Conclua todos com pontuações comportamento usando o vídeo para facilitar a confiabilidade.
   Nota: O software de registo comportamental Noldus The Observer foi usado para executar as etapas ^22, tal como descrito aqui, mas um programa especializado não é necessário:
   1. Antes de marcar o primeiro vídeo, configurar o projeto esquema de codificação do software de registro comportamental através da criação de um novo projeto ou editando um projeto existente, similar.
      1. Dentro da caixa de instalação do Projeto, definida aquisição de dados para 'Off-line Observação. Dentro da caixa de Comportamento de codificação, o programa "Scrabble", "Digging", "Criação", "grooming" e "Sniff Objeto 1, 2, 3 e 4", como 'Eventos estatais ». Programa "Jumping", como um "ponto de Evento '. Nota: Definiçãos para estes comportamentos são descritos em detalhe noutro local ^11.
         Nota: Estado Eventos tem um início e parar o tempo, Considerando que o ponto Eventos simplesmente recolher dados de contagem. A combinação de teclas para cada comportamento discreto são gerados pelo software e estas teclas correspondentes são programadas em um teclado secundário (passo 3.1.2).
      2. Para programar o teclado secundário, abra o software de teclado, clique no botão apropriado secundária teclado exibido na tela, digite a combinação de teclas apropriado e clique em OK. Uma vez que o teclado secundário foi programado, feche o software como o programa será executado no plano de fundo do computador.
   2. Uma vez que o projeto e foi criado, use o software de registro comportamental para marcar o número ea duração das traseiras (definidos como ambas as patas dianteiras serem colocados em uma parede da arena), cava (definida como dois patas dianteiras do rato cavando a roupa de cama da arena), auto-noivos (definida como a mOuse lamber qualquer região do seu próprio corpo e / ou o mouse tocar em qualquer parte do rosto com suas patas dianteiras), e saltos (definida como uma criação do mouse e, em seguida, pulando para que todos os quatro pés estão fora do chão ao mesmo tempo).
      1. Para marcar um vídeo, vá em File> Open Project e, em seguida Observe> Observation> Novo. O programa solicita um nome de arquivo. Uma vez nomeado, selecione o arquivo de mídia de vídeo adequado.
      2. Comece o placar clicando no botão Iniciar Observação.
         Nota: Quando conseguir rato comportamento repetitivo, todas dos Estados eventos exigem dois toques de tecla, a primeira correspondente ao início do comportamento e o segundo corresponde ao fim do comportamento. Ponto de eventos requerem apenas uma tecla.
   3. Marque o número de vezes que o rato cheirou cada objeto. Sniffs são definidos como qualquer momento um rato move seu nariz no espaço de 0,5 cm de um objeto. Medir a duração cheirar usando software de registo de comportamento, da mesma forma que RePetdurações de comportamento tivo foram medidos (passo 3.1.2).
      1. Cada vez que um rato funga um objecto, gravar o número de posição correspondente, o que conduzirá a uma série de números no final do período de teste de 10 min (por exemplo, 1243421 ...). registrar esses dados manualmente.
         Nota: Para facilitar a eficiência e consistência, enquanto vídeos de pontuação, os números sempre correspondem a uma determinada posição, não se opõe.
      2. Se um rato fareja um objeto, olha para longe, em seguida, fareja o objeto novamente, contar esse número duas vezes.
      3. Uma vez que o 10 min vídeo completo foi marcado, visualizar os dados clicando em Analisar> Análise do Comportamento> Novo. Uma vez que os dados aparecem na tela, exportar ou copiar e colar em uma planilha separada.
   4. Grave a distância total percorrida o rato dentro da arena durante o teste.
      Nota: O software de monitoramento de vídeo, calibrado para controlar o mouse de teste e registrar a distância total movimentado em centímetros, foi usadopara realizar esta etapa. Todos os vídeos marcados pelo software de monitoramento de vídeo tinha um notecard de dimensões conhecidas colocados na arena no início do vídeo.
      1. Use o notecard para calibrar cada vídeo dentro do software através da criação de uma linha de calibração ao longo de cada extremidade do notecard e introduzir o comprimento adequado dentro da tela de calibração do software. Uma vez que as linhas são traçadas, o comprimento de entrada conhecida e a largura do notecard que correspondem a cada linha.
      2. Dentro de Configurações Arena, selecione toda a arena.
         Nota: As áreas separadas da arena pode ser diferenciada no software se, por exemplo, o movimento do mouse ao longo das paredes vs. através do centro era de interesse.
      3. Dentro de Configurações de controle de avaliação, selecione uma duração de dez minutos. Em Configurações de Detecção, escolha um objeto escuro em um fundo claro.
         Nota: Isto teria de ser alterado se ratos albinos estavam sendo usados ​​ou se o fundo era um tom mais escuro.
      4. Uma vez que as configuraçõesforam programados, marcar os vídeos. Clique Aquisição> Abrir Aquisição. Na caixa de Controle de Aquisição, clique em Novo Julgamento e depois começar a experimentação. Depois de dez minutos decorrido, o programa pára e os dados podem ser visualizados.
      5. Clique em Analisar> calcular as estatísticas. Uma vez que os dados aparecem na tela, exportar ou copiar e colar em uma planilha separada.

4. Análise Estatística, Sequencing

1. Dentro da cadeia de números correspondentes ao objeto investigações geradas por cada rato, identificar o número total de todas as possíveis combinações de 3 dígitos sem números de repetição (por exemplo 121, 123, 124, mas não 112 ou 122).
   Nota: Um programa escrito em linguagem de programação Python foi usado para identificar o número de vezes que cada seqüência possível aparece na seqüência de números. Não é necessário o uso de um programa de fora, e esta etapa pode ser completada muitas maneiras diferentes (por exemplo, usandoa função Localização no Microsoft Word ou Excel).
2. Registe o número de vezes que cada sequência ocorre e identificar as três sequências mais frequentemente repetidos para cada rato.
   Nota: sequências individuais podem variar com o mouse ea sequência real é de menos interesse do que o número de vezes que uma sequência foi repetida (ou seja, a adesão a um padrão é mais importante do que o próprio padrão).
3. Dado que o número total de sequências de um rato irá repetições correlacionam-se positivamente para o nível de actividade, corrigir estes valores dividindo a quantidade de padrões mais frequentes, o número total de padrões para cada ratinho individual. Isto vai produzir uma sequência de repetição índice que é independente da actividade global.
4. Compare o número de vezes que cada rato repete suas sequências mais comuns (corrigido para o nível de atividade) entre os grupos usando uma ANOVA adequado, procedimento de comparação múltipla (teste de Dunnett, por exemplo) e os testes post-hoc.

5. Análises Estatísticas, Preferências Objeto

1. Utilizando a mesma sequência de números gerados acima (passo 3.1.3.1), identificar o novo objecto preferências de cada rato através da contagem do número total de vezes que cada objecto foi investigado, ou em outras palavras, a contagem do número total de 1 seg, 2 seg , 3 seg e 4 segundos na seqüência de dados. Correta para o nível de atividade e compará via ANOVA como descrito acima (passos 4,3-4,4).
   Nota: Estes métodos publicados por nosso laboratório ²² e descrito aqui são fortemente baseada em Pearson et al ^17.

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Resultados

Os dados representativos mostram que ²² C58 feminino / ratos J exibido um maior número de padrões seqüenciados do que as outras estirpes na arena redonda (Figura 2, painel A), mas não na arena rectangular (Figura 2, painel C). Nenhuma das três estirpes macho diferiam umas das outras (Figura 2, painéis B e D). Os dados representativos mostram que ambos os ratinhos C58 / J machos e fêmeas exibem uma preferência mais fort...

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Discussão

Aqui, apresentamos um ensaio recentemente desenvolvido, que pode ser útil para quantificar comportamentos de ratos com validade de face de ordem superior comportamentos repetitivos em seres humanos. Ao contrário de ensaios mais estabelecidos, como a Barnes ou T-labirinto, este ensaio objeto de exploração romance não exige qualquer formação rato nem é particularmente provocam ansiedade. Além disso, o romance de exploração objeto não requer qualquer alimento ou estímulos sociais, permitindo maior foco sobre o...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Polycarbonate Rodent Cage (45 cm x 24 cm x 20 cm)			Multiple cages are desirable to facilitate testing of multiple mice
Plastic Opaque Circular Testing Arena (41 cm base diameter)	United States Plastic Corp.	13931	Multiple arenas are desirable to facilitate testing of multiple mice
Standard Corn-Cob Rodent Bedding
Novel Object - red monkey	Hasbro, Pawtucket RI		from Barrel of Monkeys
Novel Object - rectangular 2 x 4 LEGO
Novel Object - tile	Thinkfun Inc., Alexandria VA		from Toot and Otto
Novel Object - standard white die
Video Camera
Behavioral Logging Software - The Observer	Noldus, Wageningen, The Netherlands	other programs may be used
Video Tracking Software - EthoVision	Noldus, Wageningen, The Netherlands	other programs may be used
X-Keys input keyboard	P.I. Engineering, Williamstown MI	829484
MacroWorks II	P.I. Engineering, Williamstown MI