Crescimento diferido Ensaio de Inibição para quantificar o efeito de antimicrobianos bactérias derivadas de concorrência

Resumo

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

Resumo

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

Introdução

Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients ⁶. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community ⁶.

Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing ^3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another ¹. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community ⁷.

The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion ⁷.

Protocolo

O método a seguir é adaptado ^7,8 para testar estirpes concorrente com cepas produtoras de inibidores.

NOTA: Este protocolo envolve a geração de aerossol com culturas bacterianas. Isso só pode ser realizado em um espaço contido com a implementação das considerações de segurança localmente aprovados. A pulverização da cultura em placas de agar dentro de uma câmara de segurança de nível 2 irá minimizar a contaminação das placas de agar e o ambiente circundante. Isso também irá proteger o pesquisador da inalação de aerossóis das bactérias pulverizados, esta é uma grande preocupação se o pesquisador está usando nível de confinamento 2 organismos. equipamento de protecção individual adequado deve ser usado. A área que circunda a placa de Petri é melhor coberto com papel absorvente descartável. descontaminação pós-pulverização utilizando luz UV é aconselhável.

1. Preparar as placas de ágar

1. Prepare a infusão de coração e cérebro de agar (BHI) em conformidade com o manuinstruções do cante.
2. Autoclave a ágar de BHI a 121 ° C, 15 psi durante 20 min, ou de acordo com as recomendações do fabricante autoclave para esterilizar.
3. Despeje 15 ml alíquotas de agar BHI esterilizado em pratos de Petri e deixe-a definida.
   NOTA: Garantir a cada placa de agar para ser utilizado dentro do ensaio origina a partir do mesmo banco de ágar e que não é a mesma quantidade de agar em cada placa. Isso limita a variabilidade em nutrientes disponíveis e difusão inibidor entre as placas que permitem a comparabilidade.

2. Preparar estéril Caldo

1. Prepare caldo BHI em conformidade com as instruções do fabricante.
2. Adicionar 10 ml de aliquotas de BHI a 28 frascos de vidro universais ml.
3. Autoclave o caldo de BHI a 121 ° C, 15 psi durante 20 min, ou de acordo com as recomendações do fabricante autoclave para esterilizar.
   NOTA: Assegurar que todo o caldo utilizado no ensaio origina a partir do mesmo lote de aut caldooclaved ao mesmo tempo limitar a variação de nutrientes que podem causar variação nos resultados.

3. Preparar frasco esterilizado vaporizador (s)

1. Desmonte a garrafa vapourizer.
2. Spray de 5% de agente de limpeza de superfície activa através da vapourizer para eliminar contaminantes internos, mergulhe a garrafa vapourizer, tampa e vapourizer no agente de limpeza de superfície activa 5% durante a noite.
   NOTA: Luvas e equipamento de protecção individual adequado deve ser usado no manuseio agente de limpeza activo de superfície.
3. Seque o vaporizador, tampa e garrafas sob o capô fluxo de ar estéril.
4. Encher o frasco com etanol 70%, reconecte vapourizer e borrife um pouco do etanol através da vapourizer.
5. Colocar a tampa no vaporizador e armazenar com o etanol até à sua utilização no interior.
6. Imediatamente antes de usar, de forma asséptica enxaguar o frasco com caldo de BHI estéril e pulverizar o caldo através do vapourizer.
   NOTA: Isso impede que o aff etanolecting o inóculo adicionado à garrafa na secção 6.3.

4. Preparar a cultura durante a noite bacteriana (s)

1. Streak o competidor e inibidor de estirpes numa placa de agar BHI estéril e incubar a 37 ° C em condições aeróbias durante aproximadamente 18 horas (durante a noite).
   NOTA: Este placa produz um stock de bactéria que podem ser usados ​​para várias repetições dentro da mesma semana, quando armazenados a 4 ° C.
2. Inocular 10 ml de caldo de BHI estéril com uma única colónia bacteriana da estirpe de competidor necessária dentro de um frasco de 28 ml universal.
3. Incubar a garrafa universal a 37 ° C durante a noite aerobicamente por agitação a 250 rpm num agitador orbital.

5. Ponto Cultura do isolado inibidor produtoras

1. Preparar a cultura durante a noite (s), como descrito no ponto 4.
2. Certifique-se de placas de agar são completamente seco, sem condensação na tampa, antes da inoculação (por exemplo, através da incubação de PLAte durante 60 minutos a 37 ° C); isso impede que o inóculo se espalhe ao longo da placa do local de inoculação.
3. Pipetar 25 ml da cultura da noite para o centro das placas de agar. Evitar deprimindo completamente o êmbolo da pipeta para evitar bolhas de ar que pulverizam cultura através do ágar.
4. Permitir que a cultura a secar à temperatura ambiente para limitar a propagação da cultura. Incubar as placas de agar a 37 ° C durante a noite em condições aeróbias.

6. Preparar o pulverizador inóculo da estirpe de ensaio concorrente (s)

1. Preparar a cultura durante a noite, como descrito na secção 4. Diluir a cultura durante a noite de 10 vezes em caldo BHI para se obter cerca de 4 x 10 ⁶ UFC ^ml-1, e uma suspensão de OD ₆₀₀ de 0,3 ± 0,05.
   NOTA: A diluição de 10 vezes não vai dar 4 x 10 ⁶ CFU ml ^-1 para todas as espécies bacterianas, calcular o fator de diluição necessário pela propagação plaqueamento diluições em série entre 1 x 10 ^{-1 -1 x 10 -6.}
2. Despeje a cultura diluído em um frasco de perfume vaporizador plástico estéril.
   NOTA: O volume total deve ser mais do que é necessário para o número de placas de agar a ser pulverizado. Aproximadamente 250 ul por placa é adequado para uma 9 cm de diâmetro numa caixa de Petri.

7. Ensaio de Inibição de Crescimento diferida

1. Pulveriza-se a cultura por meio de cada um dos frascos de vaporizador para assegurar que a cultura é carregado no mecanismo de pulverização antes da pulverização sobre o ágar.
2. A partir de uma distância de aproximadamente 15 cm acima do ágar, pulverização com cerca de 250 ul de cultura diluída (3 pulverizadores de um típico 50 ml vaporizador) durante toda a superfície do agar. Incubar as placas de agar a 37 ° C durante a noite em condições aeróbias. Repetir para outras placas com o mesmo número de pulverizações.

8. Interpretação diferidos Resultados Inibição do Crescimento Ensaio

1. Medir a zona de inibição do crescimento do competi pulverizadoTor estirpe (Figura 1A - C, "X" para "X"), em milímetros, subtraindo o diâmetro do ponto central do inibidor-produtor (Figura 1A - C, "Y" para "Y").
   NOTA: Figura 1E mostra como esses dados poderiam ser apresentados
2. Grave a pontuação clareza para zonas de inibição.
   Nota: Isto indica o grau de inibição observada. Exemplos são mostrados na Figura 1A - D, as estirpes que podem ser utilizadas para a normalização são sugeridos na secção de resultados representativos. A escala seguinte pode ser usado para marcar clareza: uma pontuação de 0 a clareza descrever uma zona de inibição completa do crescimento da estirpe concorrente. Uma pontuação de 1 para descrever uma zona de inibição quase completa do crescimento, com a única colónias individuais presentes na zona de compensação. Uma pontuação de 2 para descrever uma zona visível de crescimento reduzida, crescimento dentro desta zona é confluente ou próximo confluentes mas reduziu na densidade de> 50%. Uma pontuação de 3 para descrever apenas uma redução mínima de crescimento, o crescimento confluente e é reduzida em menos do que 50%, uma zona é ainda visível e mensurável. A pontuação de 4 para descrever nenhuma inibição visível de crescimento. Uma pontuação de 5 para descrever que o crescimento da estirpe de competidor foi aumentado na proximidade da estirpe produtora de inibidor de ensaio. Veja a Figura 1 para exemplos. Estas pontuações são subjetivos para o experimentador.

9. Réplicas

1. Repetir os ensaios pelo menos em triplicado biológico para determinar a reprodutibilidade dos resultados obtidos.
   NOTA: Se repetições são realizadas em dias diferentes, fazer medições e marcar placas imediatamente após a remoção de incubação, então ou placas armazenar a 4 ° C ou tirar fotografias de alta qualidade placas antes de descartá-los. Armazenamento ou fotografias de placas permite uma fácil comparação dos resultados entre os diferentes dias, to seu é particularmente importante para a confirmação de pontuação reproduzíveis em dias / experimentos. Estar cientes de que o armazenamento das placas tem o potencial de alterar os resultados.
   NOTA: Para placas fotografias lugar claro na posição vertical sem a sua tampa sobre um fundo preto fosco em uma área de luz difusa, use uma câmera de alta resolução (≥8 MP) capaz de se concentrar em objetos perto da lente (modo macro). Alternativamente, alguns geradores de imagens de gel com trans-iluminador definidos para a luz branca pode produzir produtos de alta qualidade, imagens altamente reprodutíveis.

Resultados

Os resultados do ensaio deve ser observável como uma diferença na estirpe sobreposta concorrente centralmente perto da manchado inibidor produtoras de estirpe (Figura 1). Estas diferenças podem ser interpretado como a inibição completa (Figura 1A), a inibição parcial (Figura 1B e 1C), nenhuma inibição (figura 1D) ou a associação positiva. O laboratório amplamente disponíveis estirpes S. epidermidis e S. Tü3298 epidermidis Rp62A e S. epidermidis e S. Rp62A aureus Newman foram usadas nas Figuras 1B e 1D respectivamente. Sugere-se que estas estirpes podiam ser utilizados para testar este protocolo.

Dependendo da espécie testada, a inibição completa e inibição parcial são provavelmente o resultado de péptidos antimicrobianos, antibióticos ou outros inhibito crescimento difusívelR produzidos pela estirpe produtora de inibidor. A inibição parcial também tem sido associada a reduzida disponibilidade de nutrientes para a estirpe concorrente devido à absorção ou sequestrante de nutrientes pela estirpe inibidor ^6.

Comparação do tamanho da zona de inibição entre diferentes isolados produtores de inibidores testados contra a mesma estirpe concorrente indica diferenças em qualquer um dos seguintes: a quantidade de agentes antimicrobianos produzidos pela estirpe produtora de inibidor; a capacidade do inibidor para se difundir através dos meios de comunicação; o tipo de inibidor produzido e o nível de resistência da estirpe aos inibidores concorrente a ser produzido. Comparação do tamanho da zona de inibição concorrente entre as diferentes estirpes testadas contra a mesma estirpe produtora de inibidor é indicativa dos níveis de resistência das estirpes concorrente para o inibidor a ser produzido.

Os resultados irão variar, dependendo da estirpe utilizada e de inibição concorrente da estirpe utilizada. Repete com a mesma cepa inibitório e competidor deve, idealmente, ter a mesma pontuação clareza (descrito no capítulo 8.2), isso indica boa técnica tem sido usada por toda parte.

Se tiver ocorrido aplicação inconsistente das bactérias das placas não deve ser usado. Por exemplo, se a cultura de ensaio concorrente é muito diluída a zona de inibição aparece maior e com um bordo inferior claramente definida do que o tipicamente observado (Figura 2A); isso iria afetar a confiabilidade de quaisquer medidas zona comparativos. Se o local estirpe produtora de inibidor não foi completamente seco antes da incubação durante a noite, a estirpe inibidor é susceptível de se espalhar e não formam um local bem definido (Figura 2B), que normalmente afecta as medições de zona, mas pode também afectar a clareza de pontuação. Se a tensão é concorrentenão pulverizados uniformemente isto pode levar a uma distribuição desigual de bactérias (Figura 2C). Se a estirpe concorrente é muito concentrado, é possível que a estirpe pode crescer concorrente no topo da estirpe inibidor (Figura 2C), em casos extremos, isso pode levar a alguma inversão das funções da estirpe concorrente / inibidor.

Figura 1:. O intervalo de resultados qualitativos e quantitativos que pode ser obtido a partir do ensaio de inibição de crescimento diferido Resultados para a inibição do crescimento pode variar a partir de (A) a inibição completa (pontuação de 0), (B) a inibição parcial (pontuação 1) , (C) inibição parcial (2 pontos) a (D) nenhuma inibição (escore 4). As etiquetas indicam as bordas de crescimento das estirpes de inibidor (Y) e a aresta mais exterior da inibiçãozonas (X). O tamanho da zona de inibição do intervalo de 0 mm a mais de 10 mm, como mostrado em (E), que mostra as medições para as placas fotografadas em A, B, C e D. Os resultados são apresentados para os isolados de estafilococos recentes (A , C) ou estafilocócica laboratório comum isola S. epidermidis Tü3298 (inibidor) e S. epidermidis Rp62A (competidor) (B), e S. epidermidis Rp62A (inibidor) e S. aureus Newman (concorrente) (D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Exemplos de resultados inconsistentes devido à má técnica resultados podem aparecer de forma diferente do que o esperado, se (A. ) estirpe competidor foi muito diluída, (B) estirpe inibidor não estava completamente seco antes de incubação / placas não foram seco ou (C) se a cepa competidor não foi pulverizado de forma uniforme e estava muito concentrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Uma etapa fundamental deste protocolo bacteriana competição espécies que o diferencia dos outros, é a incubação durante a noite do inibidor de isolar antes da adição do isolado concorrente. A cepa inibidor requer este período de crescimento para produzir compostos inibidores. À medida que a estirpe concorrente é sobreposta no topo da mesma forma, este método permite ao investigador observar todo o potencial da estirpe de inibidor para interferir com o crescimento da estirpe de concorrente. Como resultado, este ensaio reflecte o que acontece com a natureza; um isolado está totalmente estabelecida num nicho, e o outro deve ser capaz de neutralizar quaisquer variáveis ​​inibitórios para ser capaz de invadir com sucesso o nicho.

Há duas partes para este protocolo que são mais susceptíveis de produzir resultados errados se for realizado incorretamente. Em primeiro lugar, a esterilização incompleta das garrafas vaporizador pode introduzir bactérias contaminantes para o ensaio. incubation do caldo utilizado para enxaguar o frasco vaporizador na etapa 3.6, em um recipiente estéril pode ser utilizado para confirmar garrafas foram completamente esterilizados. lavagens adicionais em soluções desinfectantes, como Virkon, pode ser utilizado antes da lavagem em agente de limpeza tensio-activo, descrito na etapa 3.2, se a esterilização adicional é necessária.

A segunda etapa, que podem produzir resultados errados é a diluição da estirpe concorrente (passo 6.1). Se a diluição não é óptima, as medições claros de inibição não pode ser determinado facilmente. Este ensaio foi optimizado utilizando vários isolados nasal como inibidor da produção de estirpes através de uma ampla gama de espécies de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas contra S. aureus SH1000 como o ^7,8 estirpe concorrente. Ele foi subsequentemente testado utilizando vários estafilococos coagulase-negativa e coagulase- positiva como concorrente e estirpes produtoras de inibidor. Ao testar diferentes dos descritos acima como o concorrente gênerosestirpe, alguma optimização da diluição para o inoculo pode ser necessário.

Se as notas clareza variam significativamente entre as repetições, pode ser necessário para padronizar o inóculo estirpe concorrente, definindo-a uma densidade óptica específica. No entanto, isto irá aumentar o tempo do ensaio preciso para configurar, e é susceptível de reduzir o número de estirpes é possível processar cada ensaio. Visualmente ajustar a cultura para um OD apropriado utilizando um padrão de McFarland pode fornecer uma alternativa rápida.

Uma limitação desta técnica é que ela só pode ser aplicada a bactérias cultiváveis. É por isso que muitos estudos utilizam 16S rRNA sequenciamento de prever as interações de exclusão competitiva ^3,4,13. No entanto, as técnicas genéticas e metagenomic só pode distinguir membros da comunidade ao nível de espécie, e / ou não levam em conta nomeadamente a variação intraespecífica característica. É possível rastrear a associação de uma particulAR gene que codifica um traço com a presença ou a ausência de uma espécie bacteriana ^5, no entanto isto requer pré-conhecimento de um gene susceptível de ser associada com a exclusão de uma espécie.

Uma consideração segurança dessa técnica é que, devido à geração de aerossol de bactérias, só pode ser utilizado em laboratórios com um gabinete de segurança de nível 2, ou com precauções de segurança semelhantes. Existem técnicas alternativas para testar a concorrência entre os isolados que representam a variação característica intra-específica e que não geram aerossóis de bactérias. Um tal método é o ensaio de antagonismo simultânea ^2. Neste método, um inoculo de um isolado é espalhada sobre uma placa de ágar, e um segundo inoculo isolado é manchado ou picadas na parte superior uma vez que o primeiro ter secado. Isso produziria um ambiente onde as tensões estão em concorrência directa (antagonismo simultânea), ambos competindo para produzir compostos inibidores e varrer os nutrientes em primeiro lugar. o advantage do ensaio de inibição de crescimento diferido sobre o ensaio de antagonismo simultânea é que o isolado inibidor deve sempre ter a vantagem competitiva de ser totalmente estabelecida antes invasão do isolado concorrente. Este é mais reflexivo do que aconteceria no ambiente, como na maioria dos nichos, um isolado será estabelecida antes de uma outra estirpe é adicionado, em vez de dois isolados sendo adicionados ao mesmo tempo ^8.

Outra alternativa para evitar a geração de aerossol de bactérias seria adicionar o competidor isolar em ágar de topo, o que pode ser vertido em vez de pulverizado ao longo do isolado inibidor. No entanto, o volume de agar de topo adicionado teria de ser cerca de 3 ml a garantir uma cobertura uniforme da placa. Dentro deste volume, o isolado concorrente não seria crescendo nos mesmos meios de comunicação como o isolado inibidor, por isso não sofrem de nutrientes reduzidos. O competidor também não estaria em contacto directo com quaisquer compostos inibidores da UNTil eles difundido no topo Agar. Um tal ensaio não pode ser descrita como inibição ou antagonismo diferido simultânea.

Um método semelhante foi anteriormente utilizada para avaliar os níveis de resistência à bacitracina entre S. clínica aureus ^10. A principal diferença entre o protocolo descrito aqui e descrito por ^10, é o último linhagens concorrentes unicamente classificadas como sensíveis (completo clareza inhibition- marcar 0) ou resistentes (parciais há clareza inhibition- marcar 1-5). O ensaio de inibição de crescimento diferido pode, portanto, ser também utilizadas para pesquisar os níveis de resistência aos produtores de agentes antimicrobianos em particular, ou mesmo para procurar novos agentes antimicrobianos activos contra os agentes patogénicos resistentes a múltiplas drogas.

Tem sido sugerido que a microflora do hospedeiro podem ser manipuladas para eliminar os membros indesejáveis ​​da comunidade bacteriana ^9. Aplicação de corinebactérias ou Staphylococcus epidermidis já foi mostrado para eliminar S. aureus colonização nas narinas em uma proporção significativa da população ^11,12. Estudos em estirpes específicas que podem excluir competitivamente membros indesejáveis ​​da flora do hospedeiro, através de técnicas tais como a descrita aqui, pode, portanto, conduzir a terapias futuras.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain heart infusion broth	Lab M	lab049	rich general purpose media
agar-agar	Merck Milipore	101614
Petri dishes	Sarstedt	82.1473.001
Plastic perfume vaporizer	not known	-	10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket
Universal bottles		no longer in production, alternative SLS BOT5006	28 ml glass cylindrical bottle (~280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap
Decon 90	Decon		surface active cleaning agent