Preparação de CD4<sup&gt; +</sup&gt; As células T para Análise de GD3 e GD2 gangli�idos Membrane Expressão por microscopia

Resumo

Descreve-se um protocolo de coloração de anticorpo padrão para utilização em microscopia para determinar a expressão e localização da membrana de gangliósidos em repouso e as células naive humanas activadas T CD4 ^+. Também estão descritos em tempo real utilizando experiências de PCR <40.000 células que não requerem kits adicionais baixos de ARN de entrada.

Resumo

Os métodos aqui descritos para a activação de células T CD4 ⁺ naive em suspensão e a sua aderência em lamelas para análise por microscopia confocal de permitir que a localização espacial e a visualização de gangliósidos envolvidos na activação de células T CD4 ^+, que a expressão do complemento profiling experiências, tais como citometria de fluxo, Western borrar ou PCR em tempo real. A quantificação da expressão gangliósido através de citometria de fluxo e a sua localização celular através de microscopia pode ser obtido através da utilização de anticorpos anti-gangliósidos com elevada afinidade e especificidade. No entanto, um tratamento adequado de células em suspensão envolve o tratamento de placas de cultura para promover a adesão necessária exigida para a fluorescência ou a aquisição de microscopia confocal. Neste trabalho, nós descrevemos um protocolo para determinar GD3 e GD2 expressão gangliósido e co-localização com a TCR durante a ativação de células CD4 ⁺ T naïve. Além disso, real-time experiências de PCR utilizando <40.000 células são descritos para a determinação da GD3 e genes da sintase de GM2 / GD2, demonstrando que as experiências de análise genética pode ser realizada com um baixo número de células e, sem a necessidade de kits adicionais baixos de ARN de entrada.

Introdução

As células T CD4 ⁺ orquestrar a resposta imune através das suas funções efectoras após activação por apresentação de antigénio de células ^1. O estudo dos mecanismos celulares que são modulados durante a activação permite uma visão sobre um processo básico da função imune. No entanto, o estudo de células T CD4 ⁺ naive pode ser complicado porque representam uma população muito pequena de células na periferia sangue ^2.

Por meio de microscopia de fluorescência vários relatórios estudaram a localização de diferentes moléculas envolvidas na activação de células T CD4 ^+, principalmente proteínas associadas à membrana plasmática ^3. Os gangliósidos são glicosfingolípidos que contém ácido siálico e embora tenham sido extensivamente estudados em células nervosas, onde eles são abundantes, outras células, tais como células do sistema imunológico, também expressam gangliosidos com funções biologicamente relevantes ^4,5. Nós relatado anteriormente thaT durante a activação de células T CD4 ⁺ naive humanas existe uma regulação positiva do α2,8 sialiltransferase ST8Sia 1 (GD3-sintase) e a sintase GM2 / GD2, que induzem a neoexpression superfície significativa de GD2 e a regulação positiva de gangliósido GD3 ^6. Um estudo mais aprofundado de GD3, GD2 e outros gangliósidos em células do sistema imunológico é necessária para complementar uma vista parcial à base de proteína de função imunológica.

Geralmente, o estudo da expressão de gangliósido é baseado em técnicas tais como cromatografia em camada fina (TLC) ^7, mas esta técnica não permite que a localização espacial de gangliósidos na membrana plasmática ou em compartimentos subcelulares, limitando análise biológica.

Neste trabalho, nós descrevemos um protocolo para a identificação de anticorpos e mediada por localização de GD3 e GD2 gangliósidos em células T CD4 ⁺ naive humanas PBMC e depois com anti-CD3 / anti-CD28 de activação. Com este protocolo que ié também possível analisar o gene e a expressão de gangliósidos molecular num baixo número de células em suspensão, com a aquisição de imagens de alta qualidade ^6, considerando o tamanho pequeno dos linfócitos (9 jiM).

Protocolo

O sangue periférico de doadores saudáveis ​​do sexo masculino foi obtido com o consentimento informado e aprovação do Comitê de Bioética do Centro de Investigación en Dinámica Celular- Universidad Autónoma del Estado de Morelos.

1. Isolamento e Activação de células humanas T CD4 ⁺ Naive

1. Recolhe 2 ml de sangue periférico obtido a partir de dadores humanos saudáveis ​​por meio do consentimento informado e dilui-se com 2 ml de PBS estéril com EDTA (1x Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS), EDTA 2 mM, pH 7,4). Adicionar lentamente o sangue diluído em cima de 3 mL de solução de sacarose com 1,077 densidade como anteriormente descrito ^8.
   Nota: a migração durante a centrifugação diferencial provocada por diferenças na densidade fará com que os eritrócitos sedimentar completamente e uma camada de células mononucleares menos densas irão formar acima. 2 ml de sangue periférico irá processar cerca de 0,5 X 10 ⁶ células T CD4 ⁺ naive após a purificatiem etapas.
2. Centrifugar 30 min a 250 xg a 21 ° C (rotor utilização para tubos de fundo redondo com ângulo fixo de 30 mm), sem ruptura para gerar o gradiente de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Após centrifugação, o PBMC pode ser claramente observado como um anel branco. Recolher as PBMC com uma pipeta e transferir para tubo estéril para lavar roupa.
3. Após três lavagens com solução de PBS-EDTA a 250 xg durante 10 min para efectuar a purificação de células T CD4 ⁺ naive. métodos de triagem ou vários tipos de kits de purificação estão disponíveis para esta finalidade. De preferência, utilizar> 1 x 10 ⁷ PBMC para a purificação.
   1. Purifica-se células T CD4 ⁺ naive por selecção negativa com esferas magnéticas. Efectuar a selecção negativa com anticorpos anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, e CD235a (glicoforina A). Avaliar a porcentagem de pureza, determinando células CD4 + CD45RA + através de fbaixo citometria.
      Nota: Opcionalmente, proceder a incubação de PBMC durante a noite a 37 ° C e 5% de CO ₂ com uma densidade de 1 x 10 ⁶ células / ml em 10 ml de meio de cultura suplementado para promover a aderência de monócitos e continuar com a purificação de células CD4 ⁺ T naive. A recuperação eficiente de células T CD4 ⁺ naive a partir de sangue periférico depende em grande parte do sistema de purificação.
4. Prepare a placas de 24 cavidades de cultura de células por adição de 250 ul por poço de PBS com anticorpo 5 ug / ml de anti-CD3 monoclonal e incubar durante pelo menos 2 horas a 37 ° C.
   Nota: As placas com 96 poços pode ser usado quando um número menor de células T CD4 ⁺ naive são utilizados (por exemplo, 2 x 10 ⁴ x 10 -1 ^5).
5. Remover o anticorpo anti CD3 diluição do bem ou 24 placas de 96 poços e lava-se as placas duas vezes com PBS estéril 1x.
6. Dilui-se as células T CD4 ⁺ naive com> 95% de pureza (CD4 +CD45RA +) a uma densidade de 1 x 10 ⁶ células / ml em avançado meio RPMI 1640 suplementado com 3% de soro fetal de bovino (ou RPMI suplementado com 10% de soro), glutamina 2 mM e antibióticos (1 U / ml de penicilina, 1 ug / ml de estreptomicina).
   Nota: Se for necessário localização gangliósido em PBMCs, seguem o mesmo protocolo para a diluição e de estimulação, como descrito abaixo.
7. Adicionar 500 ul da diluição de células a poços revestidos com anti-CD3 e a poços não revestidos (células de controlo) na placa de 24 poços. Alternativamente, adicionar 100 ul da diluição de células para os poços da placa de 96 poços.
8. Conclua as condições de estimulação de células T CD4 ⁺ naive em anti CD3 poços revestidos por adição de 1 ug / ml de anticorpo anti CD28.
9. Manter as restantes células T CD4 ⁺ como de controlo nos poços não-revestidos sem adição de anticorpos anti-CD28. Incubar o repouso e activados de células CD4 ⁺ T para 0-72 horas, sob condições padrão de 37 °C e 5% de CO _2.
10. Para verificar uma activação adequada avaliar por citometria de fluxo da expressão do CD69 de activação precoce marcador (16 horas pós-activação) ou CD25 marcador de activação tardia (48 h pós-activação) em repouso e activados células ingénuas CD4 ⁺ T incubado a 37 ° C e 5% de _CO2, na ausência ou na presença de anticorpos anti-CD3 / CD28 ^9,10.

2. A adesão de repouso e activados células naive CD4 ⁺ T

1. Esterilizar 12 mm lamínulas redondas por autoclavagem e exposição à luz UV durante pelo menos 15 min.
2. lamelas lugar em placas de cultura celular de 24 poços estéreis.
   Nota: Para as culturas com menos de 1 x 10 ⁵ células, é preferível utilizar câmaras de deslizamento com pequenas cavidades adaptadas para impedir a dispersão de células da lamela.
3. lamelas de revestimento (ou câmara de slides) com 200 ul de poli-L-lisina (PM de 150-300 kDa) 0,1% (w / v) de solução e incubar durante 5 min a rtemperatura oom (RT), eliminar e seco durante pelo menos 1 h à TA.
4. Misturar cuidadosamente e recolher o repouso e de células T CD4 ⁺ naive activados a partir das placas de 24 poços. Contar as células e se necessário, ajustar com meio suplementado fresco para transferir 1 x 10 ⁵ células para as lamelas revestidas com poli-L-lisina. Incubam-se as células por um período mínimo de 6 horas a 37 ^° C e 5% de CO _2.

3. Recolha e Fixação de repouso e activados células naive CD4 ⁺ T

1. Remova cuidadosamente o meio de descanso culta e células T CD4 ⁺ naïve ativadas.
2. Adicionar 500 ul de PBS estéril RT lentamente.
   Nota: adição cuidadosa e remoção de soluções a partir de poços impede o desprendimento de células a partir da lamela.
3. Descartar o PBS e adicionar mais 500 mL PBS para remover completamente os meios de cultura.
4. Fixar as células por adição de 500 ul filtrada paraformaldeído a 4% (FILTração remove micropartículas que podem interferir com a análise de microscopia) e incubar durante 30 min à temperatura ambiente (de preferência) ou durante a noite a 4 ° C.
   Atenção: O paraformaldeído é um composto tóxico e volátil. Ele é conhecido por ser um carcinogéneo humano. Use com cuidado e com um protocolo de segurança adequado.
5. Remover o fixador e lava-se, pelo menos, duas vezes com PBS à temperatura ambiente.
6. Avance para o próximo passo ou manter os poços da placa com 500 ul de PBS a 4 ° C durante vários dias até que a coloração.
   Nota: A esterilidade durante este processo ajuda a evitar o crescimento de microorganismos.

4. Coloração, Montagem e visualização por microscopia confocal

1. Remover o PBS dos poços. Adicionar 500 ul de tampão de bloqueio a frio (1x PBS, 0,5% de albumina de soro de bovino de grau padrão, 1% de soro fetal de bovino a pH 7,4). Incubar durante 20 min em gelo.
2. Retire o tampão de bloqueio com cuidado e adicionar os anticorpos primários (anti gangliósidos GD3 clone R24, GD2 clone 14G2a),Conjugado com PE anti-CD25 e APC conjugada anti TCR e isotipos controlos diluídos em tampão de bloqueio a 2,5 ug / ml.
3. Incubar 2 hr em gelo ou durante a noite a 4 ° C.
   Nota: agitação orbital lenta é preferível.
4. Remover o anticorpo cuidadosamente e lentamente adicionar 500 ul de PBS. Repita duas vezes.
5. Adicionar os anticorpos secundários (conjugado com FITC anti IgG3 para R24 anti GD3, Alexa Fluor 488 conjugado com Alexa Fluor 647 ou conjugado anti-IgG2a para anti GD2 14G2a) diluído em tampão de bloqueio a 0,1 ug / ml.
6. Incubar durante 1 hora em gelo no escuro, sem tremer.
7. Lavar três vezes em PBS como descrito em 4.4). Manter os poços com PBS suficiente para evitar a desidratação de amostras.
8. Adicionar Hoechst 333258 mancha diluída em PBS a 0,1 ug / ml.
9. Incubar 15 minutos à temperatura ambiente e remover. Lavar três vezes em PBS.
10. Colocar as lâminas numa toalha de papel e adicionar 20 ul de solução de montagem (50% de glicerol em PBS) ou solução de montagem comercials para evitar o desbotamento e extinguindo a partir de amostras.
11. Com cuidado, pegue a lamela com uma pinça fina e colocá-lo na solução de montagem. Assegurar que o lado da lamela em que as células estão ligados é, em contacto com a solução. Selar as lamelas com unha polonês e analisar usando fluorescência ou microscopia confocal.

5. Isolamento de ARN

1. Prepare anticorpo CD3 anti (5 ug / ml) revestidas placas de 96 poços. Incubar 4 x 10 ⁴ células T CD4 ⁺ naive / poço em 100 ul de meio de cultura suplementado com anticorpo CD28 anti (1 ug / ml) para completar o estímulo. Incubar a 37 ° C e 5% de _CO2 durante 0-72 horas.
2. Após diferentes tempos de pós-activação colocar as células para um tubo de microcentrífuga.
3. Adicionar 500 ul de PBS e centrifugar a 250 xg durante 5 min à TA.
4. Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de reagente Trizol.
5. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente e manter a amostra a -8076; C durante pelo menos 24 h. Prosseguir com o isolamento do RNA quando necessário.
   Nota: Partindo da amostra a -80 ° C durante pelo menos 24 horas melhora o rendimento de ARN. Além disso, o uso de luvas de mão é essencial para evitar a degradação do ARN por RNases.
6. Descongelar a amostra por incubação a 37 ° C durante 2 minutos num banho de água.
7. Adicionar 200 mL de clorofórmio e agitar vigorosamente à mão durante 30 segundos (para evitar a mistura agressiva de RNA em vórtice). Incubar 5 min à TA.
8. Centrifugar 15 min a 12000 xg, a 4 ° C.
9. Recuperar a fase aquosa para um novo tubo de microcentrifugação.
10. Adicionar 500 uL de isopropanol e inverter o tubo três vezes.
11. Incubar 10 minutos à temperatura ambiente e centrifugação durante 10 min a 12000 xg, a 4 ° C.
12. Descartar o sobrenadante por inversão.
13. Adicionar 1 ml de etanol arrefecido em gelo a 75% e centrifugar 10 min a 12000 xg, a 4 ° C.
14. Completamente descartar o sobrenadante e o sedimento de ARN secar, deixando a tampa do tubo aberto.
    NãoE: Neste ponto o sedimento não é claramente visível. Continuar mesmo assim.
15. Ressuspender o sedimento em 20 mL de água de grau molecular. Calcula-se a concentração e pureza dos ácidos nucleicos medindo a 260 nm e 280 nm de absorvância utilizando NanoDrop.
16. Proceder com cuidado para síntese de ADNc utilizando o kit da transcriptase reversa qualquer convencional e seguindo o protocolo MANUFACTURER'S.
    Nota: Aproximadamente 0,5-2 ug de ARN é obtido a partir de 4 x 10 ⁴ células T CD4 ⁺ naive. ADNc pode ser sintetizado a partir de 100 ng de ARN e utilizados em reacções de PCR em tempo real sem a necessidade de jogos de entrada de ARN de baixo.

Resultados

O protocolo descrito neste manuscrito torna uma boa qualidade de cultura e de repouso e aderiu células naive humanas activadas T CD4 ⁺ (Figura 1). As células T CD4 ⁺ activadas mostram o perfil característico proliferativa (Figura 1B), em comparação à condição de repouso (Figura 1A). O marcador de activação CD25 tarde é útil para avaliar a activação eficiente a 72 h observado por microscopia confocal

Discussão

O protocolo descrito pode ser usado para localizar gangliósidos ou proteínas em suspensões de células de células T CD4 ⁺ ou de outras células imunitárias (por exemplo, PMBC, figura 5) a partir de um pequeno número de células. Devido ao tamanho pequeno de células T e as propriedades não-aderentes, a aquisição de imagens microscópicas de fluorescência resulta em informação deficiente ou baixa qualidade, se as células não são correctamente aderida.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	12633-012	Suplemented with 3% FBS
mouse anti human CD3 antibody	eBioscience	16-0037-81	OKT3 clone
mouse anti human CD28 antibody	ebioscience	16-0288-81	CD28.6 clone
mouse anti human GD3  antibody	Abcam	ab11779	R24 clone
mouse anti human GD2 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-53831	14G2a clone
FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody	Abcam	ab97259
Alexa Fluor 488 conjugated antimouse	Thermo Fisher Scieni¡tific	A-21131
IgG2a antibody
Alexa Fluor 647 conjugated antimouse	Thermo Fisher Scieni¡tific	A-21241
IgG2a antibody
Hoechst 333258	Sigma-Aldrich	861405
Ficoll Paque-Plus	GE	17-1440-02
Trizol Reagent	Invitrogen	15596-026
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human	MACS Miltenyi Biotec	130-094-131
BD FACSAria II	BD Biosciences		Sorting
Nunc Lab-tek chamber slide system	Sigma-Aldrich	C7182
Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)	Olympus		Upright BX61WI and IX81
Forward sequence primer GD3 synthase	5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´		Ref. 7
Reverse sequence primer GD3 synthase	5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´		Ref. 7
Forward sequence primer GM2/GD2 synthase	5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´		Ref. 7
Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase	5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´		Ref. 7