Indução de Aterosclerose Acelerada em Camundongos: O Modelo de "Lesão por Fio"

Resumo

Este estudo descreve um procedimento invasivo para a indução de aterosclerose acelerada em camundongos. Em comparação com outros métodos que utilizam lesões elétricas ou induzidas por criodes, a lesão induzida por mecânica imita a condição humana da restenose após terapias de revascularização e é ideal para o estudo dos mecanismos moleculares envolvidos.

Resumo

A aterosclerose é uma doença fibro-inflamatória proliferativa que se desenvolve na parede arterial, induzindo um fluxo sanguíneo deficiente ou falta de fluxo sanguíneo. Além disso, pela ruptura da parede vascular defeituosa, a aterosclerose induz a formação de trombos oclusivos, o que representa a principal causa de infarto ou derrame do miocárdio e a causa mais frequente de morte. Apesar dos avanços no campo cardiovascular, muitas perguntas permanecem sem resposta, e pesquisas básicas adicionais são essenciais para melhorar nossa compreensão dos mecanismos moleculares durante a aterosclerose e seus efeitos. Devido a estudos clínicos limitados, há necessidade de modelos animais representativos recriando condições ateroscleróticas, como a formação de neointima após implantação de stent, angioplastia de balão ou endarterectomia. Como o camundongo apresenta muitas vantagens e é o modelo mais utilizado para o estudo de processos moleculares, o presente estudo propõe um procedimento invasivo de desnudação endotelial, também conhecido como modelo de lesão de fio, que é representativo da condição humana de formação de neointima nas artérias após procedimentos de revascularização.

Introdução

A aterosclerose é a principal patologia subjacente a eventos cardiovasculares, como infarto do miocárdio ou derrame. Os principais mecanismos que desencadeiam síndromes cardiovasculares agudas são ruptura de placa, erosão superficial e formação de trombos. Existem múltiplas situações clínicas ligadas ao desenvolvimento da placa: placa aterosclerótica nativa, restenose após endarterectomia e restenose após angioplastia de balão com/sem implante de stent¹. Após lesão arterial, a supressão dos processos inflamatórios^2,3 e a recuperação do compartimento endotelial são essenciais para evitar novas complicações¹. A pesquisa clínica limita-se a amostras de tecidos e sangue devido a considerações éticas, custos e falta de conhecimento em mecanismos básicos. Por essas razões, é necessário estudar mecanismos moleculares nos modelos animais^4-6, que podem recriar as condições clínicas. Nosso modelo de formação acelerada de neointima no contexto da aterosclerose é resultado de muitos anos de experiência na implementação desses modelos em pequenos animais^7-11. O modelo de camundongos é o modelo mais atrativo para a pesquisa, devido à sua facilidade de manuseio, à capacidade de ter grandes grupos animais devido aos baixos custos relacionados à compra e cuidado animal, e à disponibilidade de várias cepas transgênicas e eliminatórias.

A maior desvantagem do modelo de camundongos é o pequeno tamanho das artérias principais submetidas à doença aterosclerótica (a artéria carótida, a aorta e a artéria femoral), que requer conhecimentos cirúrgicos qualificados e habilidades para manipular os vasos e induzir invasivamente uma placa aterosclerótica. Portanto, o modelo de formação acelerada de neointima, no contexto de restenose após a endarterectomia ou implantação de stent, proposto neste artigo é apresentado com uma diretriz passo a passo e sugestões para facilitar a introdução para o pessoal interessado. Outra desvantagem é que a desnudação é feita na parede arterial normal e, portanto, a formação neo-intima será moderada em comparação com a situação clínica. O alto nível de colesterol plasmético alcançado em apolipoproteína E nocaute(Apoe^-/-) camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura cria um ambiente pró-inflamatório adequado necessário para a formação neo-intima.

A cirurgia é realizada sob um estereótipo. A artéria carótida é exposta por uma incisão mediana na área cervical ventral. Estruturas anatômicas em cima e ao redor da artéria carótida são minimamente manipuladas para reduzir a inflamação pós-cirúrgica. A bifurcação da artéria carótida está exposta. Para induzir a formação acelerada de neointima, artérias carótidas internas e externas são preparadas para a cessação do fluxo sanguíneo e posterior desnudação da artéria carótida comum. Em conclusão, o método pode ser aprendido por pessoas com experiência mínima em cirurgias animais.

Protocolo

Os experimentos apresentados neste artigo são realizados de acordo com a legislação alemã e com as diretrizes europeias de cuidados com animais. Os animais são criados na instalação animal do Instituto de Ciência Animal do Laboratório de Zootecnia, Hospital Universitário de Aachen, Alemanha, sob supervisão do Prof. Dr. R. Tolba e do Dr. A. Teubner (oficial de bem-estar animal).

1. Cuidados com animais

1. Mantenha os camundongos em uma unidade de atendimento especializado, garantindo acesso adequado aos alimentos e controle e tratamento veterinário especializado. Se os animais forem movidos ou comprados de terceiros, por favor, garanta um período de acomodação de uma semana antes de se submeterem ao procedimento.

2. Indução de hiperlipidemia

1. Alimentação 6 - 8 semanas de idade, 18 - 20 g, fêmea (opcionalmente) ApoE^-/- camundongos com dieta aterogênica (21% de gordura, 0,15% colesterol, 19,5% caseína, wt/wt) uma semana antes do procedimento cirúrgico e continuar a dieta até que a análise da placa aterosclerótica seja realizada.

3. Preparação Cirúrgica

1. Anestesiar os camundongos usando uma injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de cetamina por peso corporal e 10 mg/kg de xilazina por peso corporal. Confirme a anestesia adequada antes da cirurgia pela falta de reflexos e movimento do bigode. Coloque uma pequena quantidade de pomada ocular estéril no olho para minimizar a secagem.
2. Certifique-se da manutenção de condições estéreis para evitar infecções durante a cirurgia usando materiais e instrumentos estéreis.
3. Raspe os ratos na região do pescoço ventral. Desinfete a pele com betadina antes da incisão. Faça uma incisão de pele de 1 cm na região mediana da região do pescoço, em cima da traqueia.
4. Separe os dois corpos gordos para garantir uma visão adequada sobre a região traqueal. Use retráteis para segurar a camada muscular e expor a artéria carótida. Se estiver presente, realize a dissecção contundente da fina camada muscular que cobre a artéria carótida.
5. Use fórceps curvos afiados para separar a artéria carótida do nervo vago e da veia jugular. Assim, a área de bifurcação com a artéria carótida interna e externa deve ser visível. Use 0,9% de NaCl para evitar o ressecamento do tecido durante o procedimento cirúrgico.

4. Lesão de fio

1. Coloque uma sutura de seda de 7 cm de comprimento 0/5 sob a artéria carótida, proximal ao arco aórtico. Faça um loop aberto, pronto para ser fechado a qualquer momento.
2. Coloque duas suturas de seda 0/7 (cada 1,5 cm de comprimento) ao redor da artéria carótida externa: uma alça perto do ponto de bifurcação e uma alça o mais distal possível. Prepare-os como um laço aberto, pronto para ser fechado a qualquer momento.
3. Coloque uma sutura de seda de 0/7 (1,5 cm de comprimento) sob a artéria carótida interna. Prepare-o como um laço aberto, pronto para ser fechado a qualquer momento.
4. Posicione a tabela do mouse com a cabeça do mouse em direção ao operador para garantir o posicionamento adequado para a inserção do fio-guia durante a desnudação(Figura 1A).
5. Sob a visão microscópica, pare o fluxo sanguíneo através da artéria carótida comum segurando e puxando as extremidades da sutura de seda 0/5 com fórceps hemostat.
6. Imediatamente após a ligadura da artéria carótida comum, feche as alças de sutura colocadas na artéria carótida interna e a sutura distal na artéria carótida externa firmemente(Figura 1B).
7. Realizar uma pequena incisão (arteriotomia, metade do diâmetro do vaso) distal à artéria carótida externa, entre as duas alças, utilizando tesoura pequena(Figura 1C). Se a incisão for muito grande, siga as instruções de solução de problemas (veja a Discussão).
8. Use fios-guia polidos comercialmente ou use pessoal especializado interno para polir os fios-guia. Desinfete o fio-guia flexível polido de 14 polegadas com álcool e umedeça-o em uma gota de 0,9% NaCl para garantir o deslizamento adequado no vaso.
9. Insira o fio-guia na artéria carótida comum através da arteriotomia transversal da artéria carótida externa(Figura 1D). Obtenha denudação endotelial passando o fio-guia ao longo do vaso enquanto gira. Repita este procedimento três vezes. Mantenha a mesma amplitude de movimento rotacional em cada mouse para aumentar a reprodutibilidade.
10. Feche o laço proximal na artéria carótida externa firmemente. Restaure o fluxo sanguíneo na artéria carótida cortando a sutura em torno da artéria comum e a sutura ao redor da artéria carótida interna.

5. Sutura e Recuperação

1. Remova os retráteis e devolva a camada muscular e os dois corpos de gordura à posição fisiológica.
2. Feche a pele com três suturas separadas 0/6, se forem necessárias medidas ecocardiográficas. Se não for necessário fazer uma imagem, use clipes metálicos para fechar a pele.
3. Coloque o mouse no lado esquerdo sob a luz infravermelha até acordar. Não deixe um animal sozinho nem na companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
4. Para identificação futura, marque o mouse usando o sistema local. Pergunte ao oficial de bem-estar animal da instituição local.

6. Análise da Placa Aterosclerótica

1. Anestesiar os camundongos no ponto final usando uma injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de cetamina por peso corporal e 10 mg/kg de xilazina por peso corporal. Confirme a anestesia adequada pela falta de reflexos e movimento do bigode.
2. Realize a exsanguinação por punção retro-orbital ou cardíaca e colete o sangue para análise posterior².
3. Desinfete a pele com betadina. Abra a cavidade torácica e remova o auriculo direito do coração. Solução tamponada de fosfato perfuse através do ventrículo esquerdo para remover o restante do sangue do vaso e, em seguida, perfundir 4% PFA para fixar o tecido.
4. Se não for necessária fixação, explane a artéria carótida imediatamente após a lavagem^{de 2,4,11}. Realizar protocolos padrão com análises de interesse: incorporação de parafina, criosection, mRNA ou análise de proteína, etc.
5. Para medições morfométricas, explane cuidadosamente a artéria carótida, incluindo a bifurcação, com manipulação mínima, como proximal ao arco aórtico usando fórceps curvas e tesouras pequenas.
6. Incorpore a artéria carótida no bloco de parafina usando protocolos de incorporação padrão. Para realizar a secção transversal, coloque a artéria carótida ereto sobre a bifurcação. Corte seções seriais de 5 μm de espessura começando com a bifurcação e colete todas elas em lâminas histológicas revestidas(Figura 2A).
7. Colorisse a cada 10^seções usando a coloração de Movat para destacar as lâminas^2,4,11. Após a coleta de imagens microscópicas de todos os vasos (utilizando um objetivo de 10X), meça o lúmen, bem como a lamina interna e externa para cada seção, utilizando um software especial^{projetado 2,4,11}, conforme mostrado na Figura 2B. Calcule o crescimento íntimo e a mídia dos vasos.
8. Analise células musculares lisas e teor de macrófago, ou recuperação endotelial em seções seriais, utilizando coloração imunohistológica usual² (Figura 2C).

Resultados

O procedimento de indução da placa aterosclerótica leva de 15 a 20 minutos e apresenta uma taxa mínima de mortalidade, principalmente devido ao sangramento ocorrido durante o procedimento. Após a cirurgia, os camundongos se recuperam da anestesia dentro de 20 - 25 min. Não foi observado prejuízo físico, como paralisia ou distúrbio alimentar após a cirurgia.

A lesão do fio induz uma desendotelialização, imitando lesões vasculares após desnudação do balão ou implantação de stent. Imediatamente após a lesão, a parede vascular desnudada será coberta com uma camada de trombocitos, que media e favorece a adesão dos monócitos¹². Células musculares lisas ativadas da mídia se proliferarão e migrarão para os espaços intimais, formando a neointima. Outros progenitores para células musculares lisas migrarão do sangue (estimado em 40%) e contribuir para o crescimento neointima. A formação da placa terminará após a reendotelialização completa, geralmente 4 semanas após a lesão no fio.

A formação de neointima pode ser avaliada usando manchas de Movat. O tamanho da placa é calculado para cada slide usando software como mostrado na Figura 2B. O tamanho total da placa (artéria carótida esquerda) pode variar entre 70.000 - 100.000 μm², enquanto o tamanho do vaso de controle (artéria carótida direita) pode variar entre 7.000 - 8.000 μm². Esses valores dependem em grande parte do cirurgião. Por isso, recomendamos fortemente o uso do mesmo cirurgião durante os experimentos para o mesmo estudo.

A placa desenvolvida se assemelha à restenose do stent, que consiste predominantemente em células musculares suaves proliferadas e migradas da mídia. A composição celular determinada por procedimentos de coloração imunológica mostra que o teor de células musculares lisas é de aproximadamente 30 a 40%, enquanto macrófagos são encontrados em 15 - 25% da neointima do vaso ferido. A re-endotelialização pode ser medida após a coloração de um marcador endotelial, e calculada como a porcentagem de circunferência manchada sobre toda a circunferência do lúmen. Normalmente, a reendotelialização atinge 80 - 90% após 3 semanas, e deve ser quase concluída após 4 semanas(Figura 2C). Para acompanhar o crescimento da placa durante seu desenvolvimento, a mesma análise pode ser repetida para cada ponto de tempo após a lesão do fio, dependendo do interesse e do sujeito estudado (ver Tabela 1).

Figura 1. Representação Esquemática do Procedimento Operacional. (A) O posicionamento da tabela de operação em direção ao operador durante o procedimento de lesão do fio (B) Visão ampliada da artéria carótida comum e seus ramos, como aparece sob o microscópio em 10X de ampliação(C) O tamanho da incisão na artéria carótida externa sob o microscópio na ampliação 10X(D) representação esquemática do procedimento de lesão por fio utilizando o fio-guia de 14 polegadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Análise da Placa de Restenose. (A) Representação esquemática da análise da placa na artéria carótida comum, 4 semanas após a indução de lesão por fio(B) Formação neointima 4 semanas após a lesão do fio e representação esquemática dos principais parâmetros utilizados para análise. Intima (área verde) é a diferença entre o lúmen (vermelho) e o lamina interna (linha verde). Mídia (área amarela) é a diferença entre a lamina externa (linha amarela) e interna (linha verde). Barra de escala 100 μm(C) Imagens representativas da coloração dos principais tipos de células envolvidas na formação de neointima. Células musculares lisas (actina muscular lisa -vermelho, barra de escala 100 μm), macrófagos (Mac 2- verde, barra de escala 100 μm) e células endoteliais (CD31- vermelho, setas, barra de escala 50 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Hora	Trombbus	Placa (μm²)	Macrófagos (% da Placa)	Células musculares lisas (% da Placa)	Re-endotelialização (% circunferência do lúmen)
1 dia	Presente	0	0	0	0
1 semana	-	< 30 000	> 10	< 50	< 50
2 semanas	-	< 50 000	> 10	< 50	> 50
3 semanas	-	< 70 000	15-25	30-40	80-90
4 semanas	-	70 000 – 100 000	15-25	30-40	Completa

Mesa 1. Desenvolvimento da placa dependente do tempo.

Modelo	Animais	Vantagens	Disanvantages
Aterosclerose nativa induzida por dieta	Pequeno	imita a patologia da aterosclerose facilidade de manuseio nenhuma cirurgia sem estresse para os animais baixos custos relacionados à compra e cuidados com animais disponibilidade de várias cepas transgênicas e eliminatórias	baixa reprodutibilidade alta variância aumento do número de animais necessários aumento do tempo de espera
	Grande	imita a patologia da aterosclerose facilidade de manuseio nenhuma cirurgia sem estresse para os animais	baixa reprodutibilidade alta variância aumento do número de animais necessários
Dilatação de balão	Pequeno	imita restenose após angioplastia de balão baixos custos relacionados à compra e cuidados com animais disponibilidade de várias cepas transgênicas e eliminatórias	tamanho pequeno das artérias principais requer perícia cirúrgica qualificada balões muito caro a desnudação é feita na parede arterial normal existência de equipamentos apropriados riscos de complicações como sangramento ou paralisia
	Grande	imita restenose após angioplastia de balão facilidade de manuseio uso de dispositivos para humanos	a desnudação é feita na parede arterial normal
Lesão de arame	Pequeno	imita restenose após angioplastia de balão facilidade de manuseio taxa mínima de mortalidade baixos custos relacionados à compra e cuidados com animais disponibilidade de várias cepas transgênicas e eliminatórias sem prejuízo físico	tamanho pequeno das artérias principais requer experiência cirúrgica menos qualificada a desnudação é feita na parede arterial normal existência de equipamentos apropriados
Implantação de stent	Pequeno	imita restenose e trombose após implantação de stent baixos custos relacionados à compra e cuidados com animais disponibilidade de várias cepas transgênicas e eliminatórias	tamanho pequeno das artérias principais requer perícia cirúrgica qualificada pequenos stents não disponíveis a desnudação é feita na parede arterial normal aumento da mortalidade existência de equipamentos apropriados riscos de complicações como sangramento ou paralisia
	Grande	imita restenose e trombose após implantação de stent facilidade de manuseio uso de dispositivos para humanos	a desnudação é feita na parede arterial normal

Mesa 2. Vantagens e Desvantagens de Modelos Existentes de Lesão Arterial.

Discussão

Neste artigo, fornecemos dicas úteis para realizar o procedimento de lesão por fio até mesmo por pessoas com experiência mínima em cirurgias animais. Existem duas etapas críticas na realização deste procedimento: a incisão da artéria carótida externa e a inserção do fio. A incisão na artéria carótida externa precisa ser realizada o mais longe possível da bifurcação, a fim de garantir material suficiente restante(Figura 1C). A incisão não deve ser muito grande, devido ao risco de cortar toda a embarcação. O segundo passo crítico é o alto risco de sangramento durante a arteriotomia e a inserção do fio-guia se o fluxo sanguíneo não for eficientemente descontinuado. Além disso, a denudação endotelial pode não ocorrer ou a ruptura arterial é possível se o fio guia não for introduzido adequadamente no vaso de lúmen. Para evitar isso, a superfície do fio-guia deve ser cuidadosamente polida antes da operação.

Para otimizar o protocolo, a posição da mesa de operação com o mouse-head em direção ao cirurgião garante uma melhor visão, acessibilidade e controle para a manipulação adequada do fio guia. Além disso, para aumentar a reprodutibilidade, use o mesmo fio-guia em todos os estudos. Como o tamanho do fio não muda, é importante considerar e eliminar todas as possíveis diferenças entre os camundongos usando o mesmo sexo, idade e peso para todos os camundongos incluídos em um estudo. Depois disso, a coloração Evans-Blue ajudará o cirurgião a determinar a eficiência da desnudação. A existência de equipamentos adequados é um pré-requisito para o sucesso do procedimento. Um estereómico 10X é essencial para a realização deste procedimento. A preparação adequada do fio-guia (por exemplo, polimento) é crucial. Por isso, recomendamos fortemente que a preparação do fio guia seja realizada por pessoal técnico especializado quando disponível.

Há muitas etapas de solução de problemas neste protocolo. Se incisar a artéria carótida externa perto da bifurcação, amarre cuidadosamente a externa, perto da bifurcação, para que não ocorra sangramento. Durante o corte, a artéria carótida externa não pode ser vista. Portanto, considere a bifurcação ao nível da sutura de seda. Colete seções quando a sutura de seda desaparecer. Se a incisão na artéria carótida externa for muito grande e o vaso for rompido, certifique-se de que o fluxo sanguíneo para a comuna carótida e artéria carótida interna seja efetivamente interrompido e tente encontrar a abertura do vaso usando fórceps. Depois de introduzir o fio guia e realizar a desnudação, amarre o vaso perto da bifurcação. Durante o corte, comece a coletar quando a seda da sutura começar a desaparecer. Se ocorrer ruptura arterial durante a desnudação com o fio-guia, verifique sob o microscópio se o fio guia está devidamente polido.

Apesar da semelhança do modelo de lesão de arame com situações clínicas, muitos grupos estão focados na aterosclerose nativa em camundongos, ou escolhem induções invasivas de aterosclerose, como angioplastia de balão em ratos ou coelhos, devido à falta de pessoal treinado que possa realizar pequenas cirurgias animais. Apesar dos benefícios do uso de coelhos/ratos, por exemplo, não há necessidade de equipamentos miniaturizados, nem modelos de ratos nem de coelhos oferecem uma variedade de diferentes cepas de knock-out, em termos de estudo de mecanismos moleculares envolvidos no crescimento de neointima e trombose de stent.

Os modelos existentes para estudar restenose de stent em camundongos são difíceis, requerem altas habilidades cirúrgicas e têm altos riscos de complicações, como sangramento ou paralisia. Por exemplo, a lesão mecânica ou implantação de stent na aorta torácica via artéria femoral é acompanhada por uma alta taxa de mortalidade (35%) devido à paralisia da perna traseira ou sangramento^13-15. Também descrevemos a implantação de stent na artéria carótida de um rato¹⁶. O procedimento é semelhante; no entanto, o processamento de tecidos para análise é complicado e não está disponível para todos os laboratórios¹⁶. A artéria carótida é diretamente acessível, não apenas para procedimentos de operação, mas também para métodos de imagem existentes, como a imagem de ultrassom. Outras induções de lesões nas artérias carótidas em camundongos podem ser feitas usando dispositivos elétricos¹⁷. Este método é fácil de executar e garante alta reprodutibilidade. No entanto, induz lesões em todas as camadas do vaso, que não é idêntica com lesão mecânica. As aplicações de balões têm benefícios, por exemplo, o ajuste ao diâmetro do vaso em consonância com a prática clínica e tem forte influência no desfecho patológico. Embora os balões de rato estejam disponíveis, eles são muito caros e, portanto, não são amplamente utilizados. Em vez disso, a lesão do fio é o método estabelecido, imitando estenose in-stent.

A desnudação é realizada na parede arterial normal, embora com um fundo aterosclerótico. Portanto, a formação de neointima será moderada em relação à situação clínica. O alto número de modelos pré-clínicos demonstra que nenhum dos modelos preenche todos os critérios necessários para descobrir a totalidade dos mecanismos celulares e moleculares que levam à fisiopatologia em humanos (ver Tabela 2).

Após a realização do procedimento de lesão por fio, outras análises biológicas e moleculares podem ser realizadas para identificar células, proteínas, mRNAs, microRNAs, genes ou outros biomarcadores, que podem ser usados como alvos terapêuticos para desenvolver novas estratégias de tratamento para aterosclerose, e em particular para a formação de neointima após lesão vascular. Se disponível, o crescimento da placa pode ser monitorado usando ultrassom de alta frequência ou outras técnicas de imagem de alta resolução. Além disso, dominar essa técnica daria ao operador a oportunidade de adaptar o protocolo a outros modelos invasivos de incentivo à aterosclerose, como colocação de coleira, ligadura parcial ou até mesmo implantação de stent.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope	Olympus	SZ/X9	-
Forceps	FST, Germany	91197-00	standard tip curved 0,17 mm
Hemostat forceps	FST, Germany	13007-12	curved
Scissors	FST, Germany	91460-11	Straight
Vannas scissor	Aesculap, Germany	OC 498 R	-
Retractors	FST, Germany	18200-10	2.5 mm wide
Retractors	FST, Germany	18200-11	5 mm wide
Ketamine 10%	CEVA, Germany	-	-
Xylazine 2%	Medistar, Germany	-	-
Bepanthene eye and nose cream	Bayer, Germany	-	-
Silicon tube	IFK Isofluor, Germany	custom-made  product	diameter 500 µm,
section thickness 100 µm,
polytetrafluorethylene catheter
PROLENE Suture 6/0	ETHICON	8707H	polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13 mm, 3/8 Circle
7/0 Silk	Seraflex	IC 1005171Z	-
Michel Suture Clips	FST, Germany	12040-01	-
Clip Applying Forcep	FST, Germany	12018-12	-
14”Wire for Catheter	Abbot	1000462H	Use 10 cm from stiff part and equalize the ends
Mice	Charles River	Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background	-