Um sensor baseado em Polianilina de Ácidos Nucleicos

Resumo

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

Resumo

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Introdução

Conjugated polymers provide many options for molecular sensors. This includes fluorescence, electronic, and colorimetric responses¹. There have been many efforts to incorporate conjugated polymers in nucleic acid sensors. However, most systems require secondary detection, limiting sensing options². Recently, we reported a conjugated polymer-based sensor platform built on polyaniline (PANI) that exploits properties of this polymer, creating a label-free system³. PANI is an extensively conjugated electro-active polymer with properties such as fluorescence and resistance that are suitable for measuring biological systems⁴. The excitons within the structure are not localized leading to mobility of the positive charge between monomeric subunits. This provides a flexible scaffold of positive charges that can interact with the negatively charged backbone of DNA^5,6. Importantly, electrostatically attached DNA is orientated such that nitrogenous bases can participate in base pairing. Association with DNA alters the electronic properties of PANI, an effect that can be enhanced by UV irradiation (Figure 1)³. Using this system, oligonucleotides complementary to target nucleic acids can be immobilized on PANI. Multiple studies have demonstrated that upon hybridization electrostatically adsorbed oligonucleotides dissociate from PANI or other cationic matrices due to conformational changes caused by the switch to a double-stranded DNA structure^3,5,7.

In a sensor system where probe attachment modulates conjugated polymer properties, hybridization events can be transduced without labels or enzymatic modification of probes or target nucleic acids. Conjugated polymers offer great flexibility in detection methods, one of which is fluorescence. Through monitoring PANI fluorescence, concentrations of target nucleic acids as low as 10^-11 M (10 pM) can be detected³. Detection is rapid, occurring within 15 minutes of hybridization, and specific where a single mismatch in a target molecule can be differentiated³.

Fabrication of PANI-sensors is straightforward. High molecular weight PANI can be generated that is well-dispersed in water using standard synthesis procedures involving aniline monomer, surfactant, and controlled addition of an oxidant. Yield can be very high and unreacted oxidant removed by washing with water, ensuring no further PANI growth. PANI-probe association occurs spontaneously upon mixture, and complex formation is enhanced by mild UV exposure. Hybridization can be carried out immediately, and the changes in PANI fluorescence assayed following a short incubation. The simplicity of this technology makes it highly accessible to many laboratories.

Protocolo

1. processável PANI Síntese

1. Dissolve-se anilina (1 ml, 11 mmol) completamente em 60 ml de clorofórmio num balão de 250 ml de fundo redondo. Agita-se a 600 rpm durante 5 min e arrefecer a 0-5 ° C com gelo. Isso normalmente leva 15-20 min (Figura 2A).
2. Adicionar sulfonato de sódio dodecil benzeno (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) para a solução de anilina em um balão de fundo redondo, enquanto se agitava a 600 rpm.
3. Dissolver persulfato de amónio (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) em 20 ml de água e adicionar tudo isso gota a gota ao longo de 30 min para evitar o superaquecimento da reação.
4. Efectua-se a reacção a 0-5 ° C durante 24 h, e permitir-lhe atingir a temperatura ambiente durante mais 24 h.
5. Observe-se a mistura de reacção inicialmente transformar branca leitosa após 15 min, em seguida, castanho escuro após 2 horas, e, finalmente, para verde escuro após 24 h (Figura 2B-F).
6. Filtra-se a solução PANI-NaDBS com um funil de Buchner. Misturar com 80 ml de clorofórmio e 120 ml de água, em queeparation funil (Figura 2G).
7. Incubar a solução durante 24 horas à temperatura ambiente e recolher o PANI verde escuro a partir do funil de separação, deixando NaDBS que não reagiram e APS no sobrenadante aquoso.

2. A mistura PANI-sonda e irradiação UV

1. Diluir solução PANI 10x com clorofórmio-água (1: 3 v / v) e misturar 200 ul de PANI diluída com 6,4 pmol de oligonucleótidos de DNA sonda por agitação suave durante 15 min num tubo de microcentrífuga.
2. Irradiar a solução de ADN com 1.200 PANI μJ / cm ² de UV em um reticulador durante 2 min. É crítico que a exposição UV é limitado ao valor indicado. A exposição prolongada à radiação UV compromete a mudança de fluorescência no PANI, provavelmente devido à ligação covalente cruzada de PANI e ADN.
3. complexos por centrifugação a 17000 xg durante 6 minutos, e lava-se com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Sedimentar novamente, e re-suspensão em PBS.

3. Hybridization de PANI-sonda

1. Adicionar 8 uL de 100 uM oligonucleótidos de ADN complementares ou ácidos nucleicos alvo com 200 ul de complexos PANI-sonda.
2. Realizar hibridação por mistura de balanço solução durante 15 min a 40 ° C.
3. Agregar as complexos PANI por centrifugação a 17000 xg durante 6 min. Lavar com PBS e re-suspensão em água.

4. Emissão constante Medição Estado de fluorescência

1. Adicionar PANI de diferentes tratamentos para uma microplaca de 96 poços e medir a emissão de fluorescência na gama de 270-850 nm por excitação a 250 nm. Um pico de emissão para PANI devem ser observadas cerca de 500 nm.

5. Medição da Microscopia de Fluorescência duplex hibridado

1. Gota revestimento PANI sobre uma lamela de vidro de borosilicato e seco a 40 ° C durante 48 h.
2. Adicionar sonda (8 uL de 100 uM) num filme de PANI e secou-se irradiar com luz UV (1200 μJ / ^cm2 ) durante 2 min.
3. Lava-se a película PANI-sonda com PBS e seco a 40 ° C durante 48 h.
4. Realizar a hibridação durante 15 min pela adição de ácidos nucleicos alvo. Esta poderia ser uma amostra biológica, ou um oligonucleótido alvo de controlo (8 uL de 100 uM). Siga com uma lavagem PBS.
5. Obtenção das imagens fluorescentes em aumento de 40 vezes, com um filtro de passagem longa de 500 nm.

Resultados

Figura 2A capta a configuração de reacção no início do processo de polimerização, isto é, antes da adição APS. A formação de micelas é o passo inicial na reacção de síntese de processo de PANI ocorre na interface micelar. A Figura 2B mostra uma solução leitosa após 5 min. 30 min após a APS é adicionada a reacção se vira para uma cor ligeiramente castanha. A Figura 2C mostra a alteração de cor associada c...

Discussão

Um sensor baseado em ácidos nucleicos de PANI requer a solubilização do polímero em água, a fim de interagir com o DNA e RNA. A dispersão de PANI em água é realizada usando tensioactivos, formando micelas, como relatado previamente ^8. Além dos NaDBS utilizados aqui outros agentes tensioactivos aniónicos, como éster de dodecilo de ácido 4-sulfophthalic, tensioactivos não iónicos tais como etoxilato de nonil-fenol, ou tensioactivos catiónicos como brometo de cetiltrimetil amónio também pode ser...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aniline	Fisher Scientific	A7401-500	ACS, liquid, refrigerated
Ammonium peroxydisulfate	Fisher Scientific	A682-500	ACS, crystalline
Sodium dodecylbenzene sulfonate	Pfaltz & Bauer	D56340	95% solid
Chloroform	Fisher Scientific	MCX 10601	Liquid
DNA primers	MWG operon	n/a	custom DNA sequence ~20 bps
Microplate	USA Scientific	1402-9800	96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform
Microplate Adhesive Film	USA Scientific	2920-0000	Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-D	PANI coated on UV irradiated cover glass
UV crosslinker	UVP	HL-2000	Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min
Hybridization Oven	VWR	01014705 T	Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min
Glass Apparatus	Fisher Scientific		Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel
Microscope	Leica Microsystems	Leica IMC S80	Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6
Microplate Reader	Molecular Devices	89429-536