Rápida aquisição de imagens 3D usando de alta resolução episc Microscopia

Resumo

We describe a detailed protocol using high-resolution episcopic microscopy to acquire three-dimensional (3D) images of mouse embryos. This improved protocol utilizes a modified tissue preparation method to enhance penetration of the fluorescent dye, thereby permitting morphometric analysis of both small and large-sized specimens.

Resumo

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) morphometric data. Here, we describe the detailed protocol to image the entire mouse embryo. The protocol consists of four major sections: sample preparation, embedding, image acquisition and finally, 3D visualization. The technology requires specimens to be stained with a fluorescent dye, which can be problematic for large or dense specimens. To overcome this limitation, we have improved the existing protocol to enhance tissue penetration of the dye by pretreating the specimen with a solution containing urea and sodium dodecyl sulfate. The protocol uses only routine laboratory equipment and reagents for easy adaptation in standard laboratory settings. We show that the resulting high-resolution 3D images faithfully recapitulate the detailed morphologic features of the internal organs of mouse embryos, thereby permitting morphometric analyses. Together, we present a detailed and improved protocol using standard laboratory equipment to acquire high-resolution 3D images of small and large sized specimens.

Introdução

The advent of 3D imaging technologies has opened the possibility of systemic analysis of detailed morphological features during fetal development. A variety of 3D imaging modalities is now available include micro-magnetic resonance imaging (micro-MRI), micro computed tomography, high frequency ultrasound, optical coherence tomography, optical project tomography and episcopic microscopy^1-4. Each modality has its own unique features in resolution, contrast, speed, cost, in utero capability and availability.

Episcopic fluorescence image capture (EFIC) and high-resolution episcopic microscopy (HREM) are episcopic microscopy imaging methods⁴. Here, high-resolution serial images are captured continuously from the block face instead of tissue sections. The resulting images faithfully reflect detailed morphological features with minimal or no tissue distortion. The acquired volumetric data is readily converted to high-resolution 3-D images suitable for accurate morphometric analysis. Because of relative low cost and high resolution, HREM and EPIC have become the superior alternatives for systemic assessment of mouse models of human birth defects^2,4-8.

Both EFIC and HREM methods require specimens to be embedded in the suitable medium. EFIC detects autofluorescence emitted from the embedded tissue. Because of this, it is limited to specimens emitting high levels of autofluorescence but not those with relatively weak autofluorescence such as early stage embryos⁹. To overcome the dependency of autofluorescence, specimens are stained with a fluorescent dye such as eosin for HREM imaging. The choices of dyes and staining methods also make HREM more compatible to detect molecular signals in the context of tissue architecture and morphology^4,10.

In this article, we present an improved HREM protocol suitable for whole body assessment of the late stage mouse embryos. To facilitate staining, we include a pretreatment step to increase tissue penetration, thereby enabling HREM imaging of older mouse embryos.

Protocolo

Todas as utilizações de animais são aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal do Hospital Infantil de Boston.

Preparação 1. Amostra

1. acasalamento cronometrada
   1. Coloque um C57BL6 tipo selvagem macho e uma fêmea juntos na mesma gaiola.
   2. Verifique para a formação de um tampão genital cedo na manhã seguinte. A ficha de acasalamento (aka, vaginal ou a ficha cópula) é uma deposição gelatinosa endurecido que bloqueia a vagina.
   3. Defina a data plugue como embrionária dia 0,5 (e0.5).
2. O isolamento de embriões de ratinho
   1. Eutanásia fêmeas grávidas por asfixia com _CO2.
   2. Coloque ratos supina sobre uma almofada absorvente e spray região abdominal com etanol 70%.
   3. Levante a pele e fazer uma incisão 5 milímetros inicial na região abdominal caudal usando uma tesoura cirúrgica. Cortar e remover a pele abdominal para expor totalmente os órgãos internos
   4. Corte perto vagina para remover todo o útero.
   5. Cortar entre locais de implantação ao longo do corno uterino. Cada segmento ou concepto deve ter apenas um embrião dentro.
   6. Manter os segmentos uterinas em 1x fosfato gelada solução salina tamponada (PBS).
3. dissecção embrião
   1. Coloque cada concepto em um prato separado com PBS gelado sob um estereoscópio.
   2. Remover os tecidos uterinos, placenta e, em seguida, membranas fetais utilizando sequencialmente fórceps de dissecação finas.
   3. Transferir o embrião dissecados para um tubo de 50 ml com 1 x PBS gelado utilizando uma pipeta de transferência grande. Evitar a captação de embriões diretamente com uma pinça para minimizar os danos do tecido.
4. Fixação
   1. Fixar os embriões dissecados em solução de formalina tamponada neutra a 10% a 4 ° C durante mais de 24 horas, com pelo menos 10 volumes de amostra de fixador.
5. Pré-tratamento
   1. Preparar a solução de Compensação: 4M de ureia, 10% glicerol, 4% de dodecilsulfato de sódio (SDS) em água duplamente destilada.
   2. Substitua o fixador com a Solução de Compensação.
   3. Rodar suavemente a amostra num agitador à temperatura ambiente durante 1 - 2 semanas. Trocar a solução de compensação uma vez que no segundo e no terceiro dia. O espécime lentamente torna-se clara e translúcida.
   4. Substitua a solução de Compensação com formalina a 10% e deixar em uma cadeira de balanço para 2 dias.
6. Desidratação
   1. Lavam-se as amostras pré-tratadas com 1x PBS 3 vezes durante 5 minutos cada.
   2. Desidratar as amostras em uma série de etanol ascendente à temperatura ambiente em uma cadeira de balanço suave. Para os embriões E15.5, usar uma série ascendente de etanol incluindo 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% e 100% de etanol, 2 horas cada passo. Para os embriões mais velhos, o tempo de incubação deve ser aumentada.
7. coloração
   1. Prepare Coloração Solução: adicione 0.1375 gramas de Eosina Y Disodium Sal e 0,0275 gramas de hemi laranja de acridina (cloreto de zinco) sal a 50 ml de etanol a 100%. Agita-se durante 2 h. Filtrar com papel de filtro. Armazenar à temperatura ambiente e evitar a luz, cobrindo com papel alumínio.
   2. Transferência da amostra para a solução de coloração, durante 1 h.
   3. Substitua com solução de coloração fresca e durante a noite mancha.
8. Infiltração
   1. Prepare Infiltração Solução: combinar 100 ml de solução A de JB-4 kit de incorporação, 1,25 g de Catalisador C, 0,275 g de sal dissódico Eosina Y e 0,055 g de hemi laranja de acridina (cloreto de zinco) sal. Mexa para misturar (200 rpm) em um balde de gelo, durante 2 horas, e em seguida, filtrar com papel de filtro.
   2. Guardar a solução A infiltração a 4 ° C e evitar a luz através da cobertura com uma folha de alumínio.
   3. Transferir os embriões à infiltração de solução: Solução de coloração (1: 1), e incuba-se durante pelo menos 3 horas num agitador rotativo a 4 ° C.
   4. Transferir os embriões à infiltração solução e incubar durante 3 hR num agitador numa sala fria.
   5. Substitua Infiltração Solution uma vez por dia, e deixar em uma sala fria em uma cadeira de balanço suave por mais três dias.

2. Embedding

1. Mantenha Solução B e infiltração Solution no gelo.
2. Faça Embedding Solution (01:25 de Solução B e infiltração Solution) imediatamente antes da incorporação.
3. Orientar a amostra em um molde de incorporação, em seguida, despeje Solution Embedding frio no molde incorporando delicadamente. Re-orientar com um pino, se necessário.
4. Use um pino para examinar se a solução Embedding é solidificado. Empurrar para fora o bloco da amostra, e prepará-la, se necessário.
5. Reorientar o bloco da amostra usando o molde separado para obter uma orientação cruzada.
6. Coloque um suporte de bloco em cima do molde de incorporação. Derramar delicadamente Embedding Solução para dentro do molde até que o molde e o suporte do bloco estão submersos por Incorporação Solution.
7. Mantenha a amostra em um recipiente secundário e deixá-loem gelo durante 3-4 horas numa hotte.
8. Armazenar as amostras solidificadas numa 4 ° C.
9. Descascar o molde de incorporação. Coloque o bloco sob o microscópio estereoscópico com iluminação oblíqua para inspecionar posição da amostra no bloco. Na face do bloco, linhas de grade marca ao redor do espécime.
10. Apare o bloco para remover montante acesso de material de incorporação utilizando as linhas de grade marcado como referências.

3. Aquisição de Imagem

1. Prender o bloco de amostra para o micrótomo e obter uma superfície de corte fresco. Definir espessura de corte (por exemplo, e9.5-10.5, 1,5 uM; e11.5-12.5, 2,0 uM; e13.5-15.5, 2,5 uM; E16.5-idosas, 3? M). Mantenha o espécime / bloco na posição inicial de micrótomo.
2. Montar o microscópio estéreo zoom horizontal voltada para a superfície do bloco de amostra.
3. Ligue o computador e microscópio, e iniciar o software de aquisição de imagem.
4. Visualizar e focar as óticas para o bloco-faceno modo "live view" do software de imagem.
5. Alinhar microscópio e micrótomo, se necessário, para que o bloco de face é no centro do visor.
6. Ajuste o zoom de modo que todo o bloco-face está dentro do visor.
7. Escolha filtro verde proteína fluorescente (GFP) (excitação 470 ± 20 nm, dicróica 495 nm, emissão de 525 ± 25 nm) e reorientar, se necessário.
8. Medir e definir o tempo de exposição manualmente (por exemplo, 80-400 mini-sec).
9. Adquirir imagens do bloco-face depois de cada corte fresco e guardar as imagens automaticamente, se possível.
10. Grave parâmetros importantes, incluindo resolução, espessura de corte e zoom.
11. Depois de terminar o espécime inteiro, exportação e converter todos os arquivos de imagem para o formato JPEG, se necessário.
12. Inverter todas as imagens originais usando um software de processamento de imagens e ajustar o brilho eo contraste.
13. Salve todas as imagens processadas em uma pasta separada.

4. 3DVisualização

1. Carregar todos os as imagens transformadas para um software de visualização 3D, seguindo as instruções.
2. Resolução de entrada e espessura de corte para converter todas as imagens para dados volumétricos (ou seja, o tamanho voxel) e salve o arquivo 3D.
3. Alinhar todas as imagens utilizando o modo automático. Ajustar imagens individuais manualmente, se necessário.
4. Salve a imagem alinhada com um novo nome de arquivo.
5. Analisar as características morfométricas da amostra usando o software de visualização 3D.

Resultados

Nós relatamos imagens HREM alta qualidade de embriões de rato entre E9.5 e E13.5 ^8. A qualidade de imagem dos embriões final faseada, no entanto, é significativamente comprometida devido à penetração nos tecidos limitada do eosina corante fluorescente. Para aumentar a eficiência de coloração, testámos vários métodos de pré-tratamento que são compatíveis com imagens fluorescentes ^11. Especificamente, os embriões de camundongos E15.5 foram tratados co...

Discussão

Aqui, apresentamos um protocolo modificado utilizando equipamentos de laboratório de rotina para obter imagens HREM de série que são compatíveis para uma rápida visualização 3D e análises morfométricas de estruturas complexas. Porque as imagens de alta resolução são tomadas diretamente da face do bloco, em vez de seções individuais, as características morfológicas finas são preservados e rapidamente reconstruída digitalmente em um programa de visualização 3D.

imagens 3D o...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	The Jackson Laboratory	C57BL6
Ethyl Alcohol	Pharmco-Aaper	111000200	200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade
Formalin	Sigma	HT501128-4L
Urea	Sigma	U5128	Clearing Solution
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	Clearing Solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Invitrogen	15525-017	Clearing Solution
Eosin Y Disodium Salt	Fisher scientific	BP241925	Infiltration Solution
Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt	Sigma	A6014	Infiltration Solution
Whatman paper	GE	3030-153
JB-4 Embedding Kit - Solution A	Polysciences, Inc.	0226A-800	Infiltration Solution
JB-4 Embedding Kit - Solution B	Polysciences, Inc.	0226B-30	Embedding Solution
JB-4 Embedding Kit - Catalyst	Polysciences, Inc.	02618-12	Infiltration Solution
Embedding Molds	Polysciences, Inc.	23185-1	16 x 8 mm
Peel-A-Way Sharp Embedding Molds	Polysciences, Inc.	18986-1	22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
JB-4 Plastic Block Holders	Polysciences, Inc.	15899
Disposable Graduated Transfer Pipes	VWR	414004-014
Petrl Dish	VWR	25384-088	Embryo dissection
Forceps Inox Tip	ROBOZ	RS-5015	Embryo dissection
Graefe Tissue Forcep	ROBOZ	RS-5153	Embryo dissection
Delicate Operating Scissor	ROBOZ	RS-6700	Embryo dissection
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes	Falcon	352059
50 ml Polypropylene Conical Tubes	Falcon	352098
Ice Bucket	Magic Touch Iceware International Corp.	R19-343
100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats	VWR	89106-766
330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats	VWR	89106-770
Sodium Chloride	MP Biomedicals	102892	PBS Solution
Potassium Chloride	Sigma	P0662	PBS Solution
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5405	PBS Solution
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	PBS Solution
Digital Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Microtome	Leica	RM2265
Illuminator	Carl Zeiss	HXP 200C
Fluorescence Stereo Zoom Microscope	Carl Zeiss	Axio Zoom.V16
Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Fiber Optic Light Source	Leica	KL 1500 LCD
Disposable Microtome Blade	VWR	95057-832
Single Edge Dispenser	Personna	62-0330-0000
ZEN	Carl Zeiss	pro 2012
Photoshop	Adobe	CS6 v13.0
Amira 3D Software	Visage Imaging	5.4
Computer	Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory
Rocking Platform Shakers	VWR	40000-304
Standard Hot Plate Stirrer	VWR	12365-382
Analytical Balance	Mettler Toledo	AB54-S