Caracterização de complexos multi-subunidade de proteína de humano utilizando MxA não desnaturante em gel de poliacrilamida-electroforese

Resumo

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

Resumo

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

Introdução

A estrutura quaternária de uma proteína desempenha um papel crucial em muitos processos celulares. Vias de sinalização, a expressão do gene e enzima de activação / desactivação todos contam com a montagem adequada de complexos de proteínas ^1-4. Este processo também conhecido como homo- ou hetero-oligomerização é devido à covalente irreversível ou interacções proteína-proteína electrostáticas e hidrofóbicas reversíveis. A oligomerização não só diversifica os diferentes processos celulares sem aumentar o tamanho do genoma, mas também fornece uma estratégia para construir proteínas de complexos estáveis que são mais resistentes à desnaturação e degradação no sentido ^5. Defeitos na oligomerização ter um impacto sobre a função de proteínas e pode levar ao desenvolvimento de doenças. Por exemplo, a enzima fenilalanina hidroxilase forma um complexo tetramérico. Algumas mutações dentro do complexo de proteína pode enfraquecer a formação tetrâmero e conduzir à doença fenilcetonúria ^6.

A proteína MxA humano é um interferão (IFN) induzida por proteína efectora antiviral exercendo uma ampla actividade antiviral contra diversos ARN, bem como vírus de ADN ^7. Ela pertence à superfamília de grandes GTPases dinamina semelhante e tem a capacidade para formar grandes estruturas oligoméricas ⁸ in vitro. A oligomerização tem sido sugerido para proteger da degradação rápida MxA ^9,10. Apesar dos intensos esforços por vários grupos de pesquisa, o mecanismo molecular de ação permanece difícil e o papel do estado de oligomerização de MxA para a sua função antiviral está em debate ^9,11,12. A este respeito, Gao e colegas propuseram um modelo onde MxA exerce a sua actividade antiviral, interagindo com nucleoproteínas virais em forma de grandes estruturas oligoméricas em forma de anel ^11. No entanto, mais recentemente, demonstrou-se que os dímeros MXA exibem actividade antiviral e interagir com a nucleoproteína do vírus influenza A ^12. Bduziu sobre a estrutura de cristal de MxA, Gao e colaboradores identificaram vários resíduos de aminoácidos nas regiões de interface que são críticos para a sua oligomerização in vitro e a sua função antiviral ^11,13. Portanto, a fim de elucidar qual oligomérica estado de MxA exerce atividade antiviral, procurou-se estabelecer um protocolo simples para determinar rapidamente o estado oligmeric de mutantes de interface MXA expressos em células humanas, bem como endógena MxA expressa após a estimulação IFN.

Embora existam muitas técnicas que são comumente usados para investigar a interação entre proteínas, tais como a proteína split-Verde Fluorescente (split-GFP) ensaio de complementação ^14, ressonância de plasma de superfície ¹⁵ e Förster transferência de energia de ressonância (FRET) ^16, eles não fornecem informações da estequiometria exacta de um complexo de proteína oligomérica. Para a investigação deste aspecto particular, tal como técnicasmulti-ângulo de espalhamento de luz (MALS) ¹⁷ e ^{18 de} ultracentrifugação analítica são muito úteis. Geralmente, as proteínas analisadas usando estes métodos são proteínas purificadas. processos de oligomerização pode também depender de outros fatores celulares. Se estes factores são desconhecidas, a análise é mais difícil. Além disso, algumas proteínas são difíceis de expressar em E. coli e de purificar. Por conseguinte, estes métodos não são a escolha óptima para analisar a oligomerização de proteínas no meio celular. Além disso, essas técnicas exigem instrumentos dispendiosos que não estão facilmente disponíveis.

Não electroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (PAGE), cromatografia de exclusão por tamanho ou por reticulação química convencional seguido de dodecil sulfato de sódio (SDS) -Página são ferramentas úteis para a caracterização da formação de oligómeros a partir de lisados de células ^2,19,20. Estes métodos não requerem equipamento especializado e podem ser facilmente PErformed num laboratório padrão. Nós inicialmente avaliados vários protocolos químicos de reticulação que invariavelmente levaram a agregação e precipitação de MxA não específica. Portanto, o próximo testados protocolos PRINCIPAL não desnaturante. Como não-PAGE desnaturante exclui a utilização de SDS, a migração das proteínas depende da sua carga nativa. PAGE nativa utiliza-Azul de Coomassie G250 azul brilhante para carregar proteínas com uma carga global negativa, semelhante a SDS, mas não desnaturar a proteína de ^21. Infelizmente, precipitados coomassie azul brilhante na presença de altas sais e catiões divalentes (por exemplo, Mg ²⁺⁾ que são muitas vezes incluídos em tampões de lise. Dependendo dos tampões utilizados, pode ser difícil de analisar a amostra sem mais passos de optimização que podem ter um efeito sobre o complexo de proteína oligomérica.

Aqui é apresentado um protocolo simples baseado num método anteriormente publicado em ²² para determinar de oligomerizaçãoproteína MxA humana derivada a partir de lisados ​​celulares usando não desnaturante PAGE.

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Protocolo

NOTA: Este protocolo é baseado no não desnaturante protocolo de PAGE publicado anteriormente ^12. Neste estudo, o estado oligomérico da proteína MxA foi avaliada utilizando quer de células Vero ou de células que sobre-expressam MxA A549 IFN-ct-estimuladas expressam MxA endógena. O protocolo abaixo descrito pode ser utilizado para analisar o estado oligomérico da proteína em qualquer além MxA. No entanto, uma maior optimização pode ser necessária.

1. Preparação de lisado celular para PAGE não desnaturante

NOTA: Para analisar o estado oligomérico da proteína MxA humana tanto em células Vero ou A549, 1,0 x 10 ⁶ células foram colhidas. Dependendo do tipo de célula ou a abundância da proteína a analisar, o número de células deve ser ajustado. É também importante para proteger o tampão de lise da exposição à luz, logo que a iodoacetamida sensível à luz é adicionado.

1. Semente de 0,3 x 10 ⁶ ou Vero A549 células por poço em6 bem-pratos. Manter as células em 2 ml de meio de crescimento por poço (ver Tabela 1). Incubar as células durante a noite numa incubadora de cultura de células (37 ° C, 5% CO _2).
2. Colher as células por lavagem com 1 ml de fosfato salino tamponado (PBS) e separar por adição de 0,5 ml de 0,25% de tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1 x solução durante aproximadamente 5 min à temperatura ambiente.
3. Assim que as células destacar do prato, adicionar 0,5 ml de meio de crescimento e mistura-se cuidadosamente, pipetando para cima e para baixo.
4. Transferir as células de cada poço para um tubo de 2 mL e o pellet-los usando uma centrifugadora de bancada (5000 x g, 4 ° C, 5 min).
5. remover cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem sem perturbar o sedimento celular.
6. Lavam-se as células com PBS, 1 ml de gelo-frio, pipetando cuidadosamente a suspensão de células para cima e para baixo.
7. células de pelotas em uma centrífuga de bancada (5.000 x g, 4 ° C, 5 min).
8. Remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem without separar o sedimento celular.
9. Ressuspender as células em 200 de tampão gelado lise ul (ver Tabela 1) por pipetagem cima e para baixo e colocar no gelo.
10. Imediatamente, proteger lisado proveniente de luz, cobrindo os tubos utilizando folha de alumínio e incubar durante 30 min em gelo.
    NOTA: Após a incubação durante 30 min em gelo, já não é essencial para proteger o lisado proveniente de exposição à luz, uma vez que a protecção dos grupos tiol livres é irreversível.
11. Remover os detritos celulares por centrifugação numa centrifugadora de bancada de pré-arrefecida (13000 xg, 4 ° C, 20 min).
12. Equilibrar colunas de diálise em tampão de diálise (Tabela 1) na câmara fria a 4 ° C durante 20 min durante o passo de centrifugação. Utilizar uma coluna com um peso molecular de corte de 10.000.
    1. Fixe as colunas a uma bóia flutuante e colocá-los num copo cheio com tampão de diálise. Para assegurar agitação suave, usar um agitador magnético. Não toque na membrana.
       NOTA: Dialysé colunas podem ser comprados ou preparados a partir de tubos de 1,5 ml de acordo com o protocolo descrito por Fiala e colegas de trabalho ^19.
13. Remover as colunas do tampão de diálise e a bóia flutuante. Transfira os lisados ​​límpidos para a coluna de diálise preparados por pipetagem sem tocar na membrana. Fixe as colunas a uma bóia flutuante e colocá-los de volta para o copo cheio com tampão de diálise.
14. Dialisar o lisado num copo contendo tampão de diálise gelada (Tabela 1) durante pelo menos 4 horas (durante a noite ou, de preferência), a 4 ° C enquanto agitando cuidadosamente utilizando um agitador magnético. Utilize pelo menos 100 ml de tampão de diálise por um ligado de 200 mL.
15. Transfira a amostra de dialisado para um tubo de 1,5 ml. Remover os precipitados por centrifugação numa centrífuga de bancada (13000 xg, 4 ° C, 20 min). Para evitar que a dissociação da proteína oligomérica complexos continuar com o protocolo (seção 2) imediatamente após a diálise. Não congeleos lisados ​​preparados.

2. Eletroforese

NOTA: A electroforese foi realizada conforme descrito antes, com algumas modificações ^22. No protocolo descrito abaixo, foram utilizados geles de gradiente pré-fundidos (4-15% gradiente). Alternativamente, os géis podem ser preparados em laboratório. É muito importante excluir qualquer agente desnaturante, como SDS para evitar a dissociação dos complexos de proteínas oligoméricas. Tempo de electroforese foi optimizada para diferentes estados oligoméricos da proteína MxA humano. No entanto, pode variar para outras proteínas, dependendo do tamanho do complexo oligomérico, bem como o intervalo de separação que é suposto ser alcançado para analisar o complexo. Portanto, o tempo óptimo de electroforese deve ser determinada empiricamente. Para melhor resolução dos oligómeros a ser analisado a corrente não deve ser superior a 25 mA.

1. Montar o gel PAGE não-desnaturante em gel da câmara. Encha tele câmara interior e exterior com tampão de operação de pré-arrefecida (Tabela 1).
2. Pré-correr o gel com o tampão de corrida previamente arrefecido a 25 mA por gel durante 15 minutos numa câmara fria a 4 ° C.
3. Misturar 15 ul dos lisados preparados acima com 5 ul de tampão de amostra 4x (Tabela 1). Não ferva a amostra.
4. Carregar 15 ul de amostra e um padrão de proteína nativa de escolha no gel. Submeter o gel a 25 mA durante 4 horas na câmara fria a 4 ° C.
   NOTA: Para a análise semi-quantitativa de um protocolo de quantificação de proteínas (por exemplo, um ensaio de proteína de Bradford ²³⁾ pode ser realizada a fim de garantir um carregamento de quantidades iguais de proteína total por pista.

3. Western Blot

NOTA: descrito abaixo é o protocolo de um sistema de transferência de western molhado. Qualquer membrana de mata-borrão pode ser usado. Ative fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas em 100% de metanol antes de equilíbrio no mata-borrão buffer. A técnica de Western blot semi-seco pode ser usado como alternativa, mas tem que ser optimizado para grandes complexos oligoméricos.

1. Desmontar o gel e transferi-la cuidadosamente em tampão de SDS (Tabela 1).
2. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente enquanto agitando suavemente.
3. Prepare 2 esponjas, 4 folhas de papel de filtro de celulose e uma membrana absorvente por gel. Mergulhe-os em tampão de transferência (Tabela 1).
4. Montar o sanduíche como se segue (de baixo para cima): uma esponja, duas folhas de papel de filtro de celulose, membranas, gel, duas folhas de papel de filtro de celulose, uma esponja.
5. Coloque o sanduíche para o tanque blotting. Certifique-se de que a membrana enfrenta o pólo positivo, enquanto o gel enfrenta o pólo negativo.
6. Encha o tanque mata-borrão com tampão de blotting pré-refrigerados.
7. Seque a 90 mA durante a noite a 4 ° C para obter os melhores resultados de transferência de proteínas.
8. Desmontar a sanduíche e visualizar o padrão de proteína, por incubação da membrana em Poncsolução eau S durante 5 min à temperatura ambiente.
9. Destain a membrana com cuidado lavando fora do Ponceau S com água deionizada até que você pode ver claramente as bandas do padrão de proteína.
10. Marcar as bandas do padrão de proteína, usando uma caneta.
    NOTA: residual Ponceau S pode interferir com a imunocoloração. Para evitar isso, a membrana pode ser descorada adicional por incubação em NaOH 0,1 M durante 1 min e subsequente lavagem com água desionizada.
11. Bloquear a membrana com tampão de bloqueio (ver Tabela 1) durante pelo menos 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
12. Visualizar proteína (s) de interesse por imunocoloração utilizando anticorpos dirigidos contra a proteína a ser analisada.
    NOTA: A proteína humana MxA foi visualizada usando o anticorpo policlonal de coelho específico para Mx1 humano diluído 1: 1000 em tampão de bloqueio (Tabela 1). A solução de anticorpo foi incubada durante a noite a 4 ° C. Alternativamente, o anticorpo monoclonal umnti-MxA anticorpo (clone 143) pode ser utilizada (dados não mostrados) ^24.

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Resultados

Usando não-PAGE desnaturante, analisou-se o estado oligomérico do tipo selvagem humana MxA, os mutantes diméricas de interface MxA (R640A) e MxA (L617D), bem como o mutante de interface monomérica MxA (M527D) a partir de lisados celulares ^12. As células foram lisadas num tampão contendo 1% de octilfenoxipolietoxietanol (NP-40) e iodoacetamida para assegurar a solubilização da proteína e a protecção dos grupos tiol livres (ver Figura 1). Conforme descrito antes, sal e pequenos metab...

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Discussão

Descrevemos aqui um método simples que permite a determinação rápida do estado oligomérico de proteínas expressas em células de mamíferos por PAGE não desnaturante seguido por análise Western Blot. A principal vantagem desta abordagem é que o estado oligomérico de uma dada proteína pode ser determinada a partir de lisados ​​de células inteiras sem purificação de proteína antes. Isto pode ser importante para proteínas que oligomerizar ou exercem a sua função em associação com factores auxiliares...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 ml	Thermo Fisher Scientific	69570	Pre-equilibrate in dialysis buffer (if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well,	Bio-Rad	456-1083	Pre-run in running buffer to adjust buffer system
cOmplete, Mini, EDTA-free	Roche	11836170001	use 1 tablet per 50 ml
PBS, pH 7.4  bottle a 500 ml Gibco	Thermo Fisher Scientific	14190-094
Ponceau S solution	Sigma-Aldrich	P7170	TOXIC wear gloves and protect eyes
NativeMark Unstained Protein Standard  50 µl	Invitrogen	P/N 57030	load 5 µl/well
A549 cells	ATCC	ATCC CCL185	Grow in growth medium (see Table 1)
Vero cells	ATCC	ATCC CCL81	Grow in growth medium (see Table 1)
anti-Mx1 antibody	Novus Biologicals	H00004599_D01P	Use at a 1:1,000 dilution
ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey)	GE-Healthcare	NA934V	Use at a 1:10,000 dilution
0.5% Trypsin-EDTA (1x)        Life Technologies	Thermo Fisher	15400-054
Iodoacetamide   5 g	Sigma-Aldrich	I-6125	stock  100 mM
Bromphenolblue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies	Thermo Fisher Scientific	41966-029
Pen  Strep 100 x     100ml               life technologies	Thermo Fisher Scientific	15140 - 130
Glutamax 100x Stock, 100 ml     life technologies	Thermo Fisher Scientific	350500-038
Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500 ml Gibco Lot:42G9552K	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Cellulose filter paper	Bio-Rad	1703965
PVDF blotting  membrane	GE-Healthcare	10600022
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Biosolve	0020092391BS
sodium fluoride (NaF)	Sigma Aldrich	S-7920
NP-40	Calbiochem	492015
cOmplete, Mini, EDTA-free	Roche	11836170001
Tween 20	Calbiochem	6555204
CHAPS 10% solution	Amresco	N907
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	43819
Glycine	Biosolve	0007132391BS
sodium orthovanadate (Na3VO4)	Sigma Aldrich	450243
Glycerol	Sigma Aldrich	G7757
β-Glycerophospate	Sigma Aldrich	G9422
Milk powder	Migros/Switzerland
Methanol	Millipore	1.06009
sodium cloride (NaCl)	Sigma Aldrich	71380
magnesium chloride (MgCl2)	Amresco	288
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma Aldrich	L4509
sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S-8045