Uma abordagem alternativa para preparação de amostras com baixo número de celular de Análise TEM

Resumo

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Resumo

microscopia eletrônica de transmissão (TEM) fornece detalhes sobre a organização celular e ultra-estrutura. No entanto, a análise TEM de populações de células raras, especialmente as células em suspensão, tais como células estaminais hematopoiéticas (HSCs), permanece limitada devido à exigência de um elevado número de células durante a preparação da amostra. Há um cytospin ou monocamada algumas abordagens para a análise de MET a partir de amostras escassos, mas estas abordagens não conseguem obter os dados quantitativos significativos do número limitado de células. Aqui, uma abordagem alternativa e inovadora para preparação de amostras em estudos TEM é descrito para populações de células raras que permite a análise quantitativa.

Um número de células relativamente baixa, ou seja, 10.000 HSCs, foi utilizado com sucesso para a análise de TEM em comparação com os milhões de células, tipicamente utilizados para estudos TEM. Em particular, Evans azul coloração foi realizada após paraformaldeído-glutaraldeído (PFA-GA) de fixação para visualizar o pequeno pel celularvamos, o que facilitou a incorporação de agarose. Aglomerados de numerosas células foram observadas em seções ultra-finas. As células tinham uma morfologia bem conservada, e os detalhes de ultra-estruturais das mitocôndrias e vários complexos de Golgi eram visíveis. Este protocolo eficiente, fácil e reprodutível permite a preparação da amostra a partir de um número de células de baixo e pode ser usado para a análise TEM qualitativa e quantitativa sobre as populações de células raras a partir de amostras biológicas limitados.

Introdução

Detalhes ultra-estruturais e sub-organela das células foram revelados principalmente por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) estudos de tecidos ou pellets de células ^1,2. peças sólidas de tecidos pode ser facilmente utilizada para estudos de microscopia electrónica. No entanto, análises de MET ^1,3 em células em suspensão e necessitam de permanecer desafiador números elevados de células, isto é, milhões de células. Devido a isso, análises de ultra-estruturais das populações de células raras em suspensão, por exemplo, células estaminais hematopoiéticas (HSCs), não são facilmente avaliados. Várias tentativas para análise de TEM de amostras usando escassos cytospin ou monocamada abordagens não conseguem obter os dados quantitativos significativa do número limitado de células. Deste modo, a exigência de um elevado número de células limita a utilização desta ferramenta poderosa para compreender os detalhes ultraestruturais subcelulares de populações de células raras.

Uma limitação fundamental para estudos TEM com um número limitado de célulass em suspensão, é a localização das células para o processamento e, portanto, a partir de estudos TEM células limitadas com tamanhos especialmente pequenos permanecem desafiador. Várias abordagens alternativas foram adotadas para contrariar esta limitação: a BSA / bisacrilamida (BSA-BA) polimerização mediada de suspensão de células, a coloração das células com um corante para torná-los visíveis num suporte de película fina incluindo lamelas, e analisa MET a partir de preparações de Cytospin ^4-6. No entanto, o sucesso muito limitado foi alcançado, como muito poucas células foram encontrados nas secções após ultra-seccionamento. O principal desafio de identificar células esparsas persiste porque a monocamada de células permanece praticamente invisível no gel solidificado para seccionamento. Além disso, a preparação Cytospin de células pode alterar a sua organização celular devido ao espalhamento das células e a fragilidade da estrutura celular. Por conseguinte, estes inconvenientes inerentes garante uma nova abordagem para a realização de estudos de MET a partir de populações de células raras com maisconsistência. Para ultrapassar este problema, nós descrevemos um método novo e preparação de amostras alternativa para estudos TEM de populações de células raras ^7.

Aqui, descrevemos um protocolo de preparação da amostra eficiente para realizar TEM de amostras biológicas escassos com resultados qualitativos e quantitativos consistentes. O azul de Evans foi realizada a coloração após a fixação de localizar um pequeno agregado de células a partir de células baixo número, ou seja, 10.000 tronco hematopoiéticas da medula óssea e células progenitoras que de outra forma teriam permanecido invisível, e o sedimento foi incorporado em agarose antes de processos de desidratação e de resina de incorporação. Este método agrupa as células em conjunto e permite a análise eficiente da ultra-estrutura e organização subcelular das células estaminais hematopoiéticas (identificado como Lin ^- Sca-1 ⁺ c-kit ⁺ Flt3 ^- CD34 ^-; HSC), um raro 0,2 - população de células 0,5% na medula óssea. Este pro experimentalprotocolo pode ser útil para realizar estudos ultra-estruturais e obter resultados quantitativos sobre muitas populações raras, mas muito importantes.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo comitê de animais institucional a Fundação de Pesquisa Infantil de Cincinnati. Para este estudo, as células estaminais hematopoiéticas foram isoladas a partir da medula óssea de ratinhos C57BL / 6 com idade consanguínea 2 - 4 meses. Separação de células utilizando FACS após coloração da BM com diferentes fabricantes de superfície, incluindo Linhagem, c-kit, Sca-1, Flt3 e CD34 foi utilizada para a purificação de HSC baseado em Lin Sca-1 ⁺ Flt3 c-kit ^{+ -} estratégia gating ^- CD34 como protocolo padrão descrito anteriormente ^8.

CUIDADO: Vários produtos químicos altamente tóxicos são utilizados durante este procedimento. Estes são tóxico por inalação e contato com a pele. Por favor, use luvas e vestuário de protecção. Trabalhar no exaustor ao trabalhar com esses produtos químicos.

1. células, a fixação, coloração e Pré-incorporação

1. Classificar 10.000 células-tronco hematopoéticas (usando Lin ^- Sca-1 ^{+ c-Kit + Flt3 - CD34 - gating estratégia; LT-HSC população) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 600 ul de Iscove modificado por Dulbecco Médio (IMDM) com soro fetal bovino a 10%, utilizando FACS.}
2. Girar HSCs ordenadas a 1.000 xg durante 10 min num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, utilizando uma centrífuga com baldes swing-out. Remova o meio por aspiração suave e deixar 200 � de meio nos tubos em cada etapa. Nesta fase, o sedimento celular permanece invisível no tubo.
3. Fixar as células por adição de 0,2 ml de solução fixadora 2x à temperatura ambiente (TA) durante 1 h ^1,9.
   1. Faça a solução fixadora fresco antes da utilização. Em 1x, a solução é composta por 3% de paraformaldeído e 2,5% de glutaraldeído em tampão de cacodilato 0,1 M.
4. Centrifugar as células a 1000 xg durante 10 min a 30 ° C, utilizando uma centrífuga com baldes swing-out.
5. Lavar as células com 600 uL de tampão de 0,1 M de cacodilatousando centrifugação e deixar tampão 200 ul no tubo após centrifugação.
6. Corar as células fixadas pela adição de 200 ul de solução de 2 mg / ml de azul de Evans em tampão cacodilato e incubar durante 20 min à TA. As células serão de cor azul.
7. Lavar as células 3 vezes com 600 ul de tampão de cacodilato 0,1 M utilizando a centrifugação e deixar tampão 200 ul no tubo de cada vez.
8. Re-suspender as células em 200 ul de tampão e transferir a suspensão de células para um tubo de 0,5 ml. Centrifugar a 1.000 xg durante 10 min usando uma centrífuga de bancada. Remover tampão suavemente, sem perturbar o sedimento celular pequena agora visível, e deixar tampão 50 ul no tubo.
9. Adicionar 200 mg de baixo ponto de fusão de agarose a 5 ml de tampão de cacodilato 0,1 M no tubo de 15 ml de uma solução de agarose a 4%. Derreter a agarose por transferência do tubo de água fervente em uma garrafa de vidro de 100 ml e manter morno até ser utilizado.
10. Adicionar 200 mL de 4% baixo ponto de fusão agarose dissolvido em cacodyla 0,1 Mtampão TE para a suspensão de células em tubos de 0,5 ml e imediatamente centrifugar a 1000 xg durante 10 min a 30 ° C usando uma centrífuga de bancada.
11. Depois de confirmar que as células sedimentadas no fundo do tubo de 0,5 ml em agarose semi-sólida após a centrifugação, transferir imediatamente o tubo a 4 ° C ou de gelo durante 20 minutos para solidificar a agarose. Este passo é muito crítica, como um pequeno agregado de células visíveis nesta etapa resulta num bom grupo de células sob o microscópio electrónico.
12. Transferir cuidadosamente a agarose solidificada contendo o sedimento de células a partir do tubo de plástico para uma placa de Petri de 35 mm contendo tampão usando uma agulha de 27 G ^3,10.
13. Aparar a agarose solidificadas contendo o sedimento de células em um pedaço de cerca de 1 - 2 mm com um bisturi. Transferir o pedaço de agarose contendo o sedimento de células para um novo tubo de 1,5 mL.
14. Lave 2 - 3 vezes usando 600 ul de tampão de 0,1 M de cacodilato, adicionando e removendo tampão que usa a pipeta sem centrifugação. Use este pedaço de agarose contendo o sedimento de células para o próximo passo. Nesta etapa, a amostra pode ser armazenada a 4 ° C durante a noite, antes de passar ao passo seguinte.

2. Osmification, desidratação, Embedding

1. Remover o tampão de cacodilato a partir do tubo de 1,5 ml com o sedimento celular contendo agarose, utilizando uma pipeta. Adicionar 1,0 ml de 1% de tetróxido de ósmio _(OsO4) solução num exaustor de fumos, e incubar durante 1 hora a 4 ° C.
2. Lavar três vezes com 600 ul de tampão de cacodilato 0,1 M e transferir a amostra para um frasco de cintilação de 20 ml de vidro com uma tampa.
3. Processar a amostra para a desidratação, infiltração e embutir em resina (por exemplo, LX-112) com as mudanças de série dos seguintes soluções em uma placa de 6 bem. Mover a peça de agarose de células-pellet usando uma pinça.
   1. Imergir a amostra em 25% de etanol à temperatura ambiente durante 15 min.
   2. Imergir a amostra em 50% de etanol à temperatura ambiente durante 15 min.
   3. Imergir a amostra em 75%etanol à temperatura ambiente durante 15 min.
   4. Imergir a amostra em 95% de etanol à temperatura ambiente durante 15 min.
   5. Imergir a amostra em 100% de etanol à temperatura ambiente durante 15 min, duas vezes.
   6. Imergir a amostra em etanol: resina (3: 1) à temperatura ambiente durante 30 min.
   7. Imergir a amostra em etanol: resina (1: 1) à temperatura ambiente durante 30 min.
   8. Imergir a amostra em etanol: resina (1: 3) à temperatura ambiente durante 30 min.
   9. Imergir a amostra de resina pura à temperatura ambiente durante 60 min, duas vezes.
4. Transferir a amostra para a parte inferior da ponta em forma de pirâmide do molde de borracha com a pinça e cuidadosamente adicionar mais resina pura no topo da amostra para encher o molde. Incubar a amostra a 60 ° C durante 72 horas, para a polimerização da resina.
5. Retirar a pirâmide de resina polimerizada a partir dos moldes, torcendo o molde de borracha. Um pequeno aglomerado negro de células devem ser visíveis na pirâmide resina polimerizada, conforme descrito anteriormente ^7. Anexar a pirâmide de resina polimerizada no cilindro de montagem usando cianoacrilato.

3. Seccionamento e Microscopia Eletrônica de Transmissão

1. Apare o bloco de pirâmide com uma lâmina de barbear e uma faca de diamante após a montagem do bloco em um ultra-micrótomo. Adicione uma forma trapezoidal de largura curto com a parte superior e a parte inferior do bloco paralelas entre si, e com os lados uniformemente inclinada. Esta forma de pirâmide ajuda para o seccionamento em série.
2. Além disso, cortar o bloco em torno do pellet celular com a faca de diamante e remover os perfis de plástico ao redor do pedaço de agarose pellet celular.
3. Corte 1 mm seções usando um ultra-micrótomo. Mova os 1 mm seções do barco da água para uma lâmina de vidro usando uma ferramenta de cílios e uma ferramenta alça de metal conforme relatado anteriormente ^7. seções de transferência em slides e slides de transferência para a placa de aquecimento (37 ° C) para a secagem.
4. Adicionar uma gota de solução de azul de toluidina para as secções, utilizando uma seringa equipada com filtro de 0,22 um e incubar durante 3 min. Lavar as lâminas com água destilada e let as secções secar. Verifique com um microscópio de luz para identificar a posição das células.
5. Cortar seções ultra-finas (70 - 100 nm) usando uma faca de diamante. Mova 2 - 3 seções sobre grelhas de 200 malha do barco da água para uma placa de Petri de vidro usando uma ferramenta de cílios.
6. Transferir a placa de Petri de vidro contendo grades com secções sobre uma placa quente a 30 ° C para secar secções durante 30 min.
7. Corar as grades com gotas de 1% de acetato de uranilo à TA durante 10 min e, em seguida, lavar em água destilada 6 - 8 vezes. Mancha com citrato de chumbo de Reynolds, à TA, durante 5 min e lavar em água destilada 6 - 8 vezes. Transferir a placa de Petri de vidro contendo as grades sobre uma placa quente a 37 ° C para secar secções.
8. Analisar as seções com um microscópio eletrônico, a 80 kV ^7.

Resultados

Um protocolo eficiente e consistente para a preparação da amostra para realizar a análise TEM de baixo número de células é descrito. Coloração pós-fixação com azul de Evans e da transferência de células para um tubo de 0,5 ml de microcentrífuga ajudou a visualizar o pequeno pellet celular ^7. Osmification com tetróxido de ósmio em agarose levou a uma detecção fácil do sedimento celular escuro durante a desidratação e a incorporação.

Discussão

Este método permite a análise TEM em números de celulares de baixo, usando Evans coloração azul e agarose a incorporação de localizar um pellet de células pequenas durante a desidratação, inclusão em resina e seccionamento processos. É importante notar que mantém agrupamentos de células em conjunto e preserva a ultra-estrutura celular, o que é desejável para examinar várias células para quantificação de dados.

Em estudos TEM, um sedimento celular, contendo milhões de cé...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln	Electron microscopy Sciences	15713	CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.
Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln	Electron microscopy Sciences	16350	CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.
Cacodyladate buffer	Electron microscopy Sciences	12300	Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 °C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood.
Evans Blue	Sigma	E-2129
Low melting agarose	Sigma Aldrich	A-5030
Osmium tetraoxide	Electron microscopy Sciences	19130	1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood.
LX-112 Embedding Kits (LADD®)
DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)	LADD	21340	Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30
NMA (Nadic methyl anhydride)	LADD	21350
Epoxy Resins Epon 812 (LX-112)	LADD	21310	CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood.
DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol)	LADD	21370
Reynolds lead citrate (EM Stain II)	Leica		CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.
Uranyl acetate (EM Stain I)	Leica	8072820	CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	ATCC	30-2005	composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx
Pyramid tip mold	Ted Pella	10585
mounting cylinders	Ted Pella	10580
Ultra-microtome	(Leica EM UC7)
200 mesh grids (nikil)	Electron microscopy Sciences	G-200 Ni
Electron Microscope	Hitachi model H-7650
Image capture engine software	AMT-600
35 mm plastic Petri dishes	Fisher scientific
Quick Bond Super glue Cyanoacrylate	Electron microscopy Sciences	72588
Razor blades
Glass scintillation vials	Fisher scientific	03-337-14
Glass slides
Eyelash tool
Metal Loop tool