A fluorescência ensaio simples para a quantificação de Canine neutrófilos Extracelular Armadilha lançamento

Resumo

armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETS) são redes de ADN, histonas e proteínas de neutrófilos. Embora um componente da resposta imunitária inata, redes estão implicados na autoimunidade e trombose. Este protocolo descreve um método simples para o isolamento dos neutrófilos canino e quantificação de redes que utilizam um ensaio de microplaca de fluorescência.

Resumo

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Introdução

Há mais de 70 milhões de cães de estimação nos EUA sozinho ^1. Como membros da família valorizados, estes animais muitas vezes recebem corte cuidados médicos borda. Igualmente porque partilham o nosso ambiente, os cães podem fornecer insights sobre a patogênese e tratamento da doença humana ^1. No entanto, se a tradução descobertas na medicina humana em tratamentos veterinários, ou vice-versa, é importante caracterizar completamente as variações das espécies, mesmo em sistemas altamente conservadas, tal como a resposta imune inata. Exemplos de diferenças entre o canino e sistema imune inato humano incluem a alta expressão de CD4 no cão neutrófilos ^2; a ausência de um homólogo funcional do sensor de flagelina citoplasmática IPAF em cães e ³ a expressão de um híbrido da caspase 1/4 em carnívoros ^4.

Armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETS) são um componente relativamente recentemente descoberta da imunidade inata ^5. As redes são de redes de ADN proteínas, nuclear e granular liberados em resposta a uma ampla gama de estímulos inflamatórios ou infecciosos ^6. Estruturas de tipo rede foram demonstradas em muitas espécies, incluindo galinhas ^7, peixes, moluscos ^{8 9} e acoelomates ^10, mas há variações de espécies. Por exemplo, os neutrófilos murino respondem mais lentamente a estímulos NETosis do que os neutrófilos humanos, e formam NET menos difusa ^11. Há um grande corpo de evidências a partir de várias espécies que as redes aprisionam micróbios, e mais controversa pode ser diretamente envolvidos na eliminação de agentes patogénicos ^12,13. No entanto, os componentes NET também melhorar danos nos tecidos, promover a trombose e agir como auto-antígenos ^14,15. O equilíbrio entre os efeitos benéficos e deletérios da NET podem variar entre diferentes doenças e espécies diferentes, o que sugere que é importante investigar NET, tanto em espécie e condição de interesse.

Aqui nósdescrevem um protocolo simples para induzir e medir a libertação de redes por neutrófilos canino. Este método é semelhante às utilizadas para isolar os neutrófilos ¹⁶ e induzir NETosis em outras espécies, mas as condições, tais como a concentração de agonista e tempo de incubação foram optimizados para os neutrófilos canino. Um ensaio de libertação de uma rede similar quantificação do ADN foi também descrita em outras espécies, mas o método aqui apresentado é também optimizado para cães ^8,17,18.

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Protocolo

Todos os experimentos foram realizados com permissão ética do Comitê Animal Care Universidade Institucional e Use o Estado de Iowa.

Coleção 1. Sangue

1. Desenhar 9 ml de sangue de uma veia safena, cefálica ou jugular directamente em anticoagulante (por exemplo, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 1,8 mg _de K ₂ EDTA / ml sangue) VACUTAINERS, ou para uma seringa com a transferência imediata para tubos de sangue contendo EDTA. Delicadamente rolar ou inverter os tubos de sangue para assegurar a mistura adequada de sangue e anti-coagulante.

2. neutrófilos Isolamento

1. Em um tubo cónico de 50 mL, misturar o sangue com um volume igual de temperatura ambiente estéril de 3% de dextrano-500 (preparado em 0,9% de solução salina estéril) por inversão suave. Deixar de pé por 18-20 minutos à temperatura ambiente. Transferir a camada superior cor de palha para um tubo fresco, até que já não pode ser recolhido sem contaminação pela camada inferior vermelho. Os eritrócitos no the tubo original pode ser descartada.
2. Centrifuga-se o sobrenadante a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. Tirar e descartar o sobrenadante. Manualmente re-suspender o sedimento celular em 10 ml temperatura ambiente fosfato estéril tamponado salino (PBS). Note-se que vórtice não deve ser utilizado para re-suspender neutrófilos em qualquer fase deste protocolo. desenho manualmente fora, em vez de decantar os sobrenadantes também é recomendado durante todo o protocolo para maximizar o rendimento celular.
3. Adicionar 10 ml de uma solução de separação de células polissacarose temperatura ambiente e diatrizoato de sódio (por exemplo, de Histopaque 1077) para um tubo de 50 ml. Cuidadosamente camada a solução contendo as células através da solução de separação de células. Note-se que usando uma solução de separação de células que não atingir a temperatura ambiente podem reduzir a colheita de células.
4. Centrifugar a 300 xg durante 30 min à temperatura ambiente com o freio.
5. Como os neutrófilos estão na camada mais baixa do gradiente, desenhar e descartar a uppeR 3 camadas, composto por uma camada superior de plaquetas e de plasma, uma banda branca estreita de células mononucleares e uma camada transparente de meio de gradiente de densidade.
6. Para lisar quaisquer eritrócitos restantes, re-suspender o sedimento de neutrófilos em 10 ml de água à temperatura ambiente.
7. Após 30 segundos, restaurar a tonicidade pela adição de 10 ml de temperatura ambiente cloreto de sódio esterilizada 1,8% e misturar por inversão suave.
8. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Empate fora o sobrenadante e descartar.
9. Se o pellet é ainda vermelho, repita a etapa de lise. Se o sedimento é branco (ou se a lise já foi realizado duas vezes), as células suavemente re-suspensão em 10 ml de PBS estéril.
10. Contagem de células utilizando um contador automático ou um hemocitômetro. Os rendimentos típicos são de pelo menos 10 ⁶ culas por ml de sangue.
11. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Empate fora o sobrenadante e descartar.
12. células na concentração desejada em PBS estéril temperatura ambiente re-suspender. for o ensaio de liberação de DNA descrita na secção 2, ressuspender em 5 x 10 ⁶ células por ml.
13. Se desejado, transferir um pequeno volume das células directamente ou usando um citocentrífuga a uma lâmina de vidro. Permitir que as células para secar e mancha usando um kit de fixação e coloração rápida de acordo com a fabrica 'instruções. Se o isolamento de neutrófilos tenha sido bem sucedida, quando examinado sob o microscópio, pelo menos, 95% de células nucleadas deve ser granulócitos (neutrófilos, basófilos, eosinófilos) com contaminação por eritrócitos mínima.

3. DNA Ensaio de Libertação

1. Configure o ensaio de liberação de DNA imediatamente após o isolamento dos neutrófilos.
2. Se aglutinação celular está presente na análise da solução de reserva por microscopia de luz, passar a suspensão de células através de um filtro estéril de 70? M estéril imediatamente antes de montar o ensaio.
3. Para cada poço de teste de uma placa de 96 poços estéreis, adicionam-se 5 x 10 ⁴ células / poço; agonista e Memo Roswell Parkrial Instituto-1640 (RPMI) meio sem vermelho de fenol e suplementado com soro fetal de vitelo inactivado por calor a 0,5% para um volume final de 100-200 mL. Incluem, pelo menos, dois poços em branco por agonista em que a solução de estoque de neutrófilos é substituído por um volume igual de PBS. Note-se que a criação de poços em branco para cada agonista é importante para descartar a contaminação do DNA do agonista ou interferência pelo agonista com o ensaio de fluorescência.
4. Incubar a 39 ° C durante 30 min, num incubador de dióxido de carbono (4%).
5. Adicionar agonistas em concentrações desejadas e um corante ácido nucleico celular impermeável. Note-se a concentração óptima de corante impermeável células irá variar entre diferentes corantes ácidos nucleicos. Controlos não-estimulada em que agonistas são substituídos por um volume igual de meio devem ser incluídos em cada experiência.
   NOTA: É desejável diluir agonistas em volumes semelhantes de meio de cultura para manter as condições consistentes entre poços. volumes bem final de 200 &# 181; G têm sido usados ​​com sucesso e, se esta for alterada, bem volumes devem permanecer idêntica para todas as condições. Forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) (concentração final ≥0.1 uM) ou factor activador de plaquetas (PAF) (concentração final ≥31 uM) podem ser utilizadas como controlos positivos. Agonistas devem ser medidos pelo menos em duplicado.
6. Incubar a 39 ° C. Medir a fluorescência utilizando um leitor de microplacas, após 2 horas ou em intervalos desejados. Note-se que os intervalos de tempo óptimos vão variar com agonistas utilizados.
   NOTA: Comprimento de onda dependerá do corante empregado.
7. Subtrair fluorescência em branco antes de calcular fluorescência média.
8. Para permitir a comparação entre indivíduos e entre as placas, calcular uma mudança na fluorescência vezes dividindo a fluorescência média de poços estimulados por a fluorescência média de poços não estimuladas.

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Resultados

Usando este protocolo, não deve haver uma mudança forte dobra na fluorescência após estimulação de neutrófilos com os controlos positivos, PMA e PAF. Como ilustrado na Figura 1B, a estimulação de neutrófilos caninos com 31 uM de PAF 1 para resultados de RH num aumento significativo 4,0 vezes na fluorescência em comparação com células não estimuladas (intervalo 2,0-5,8, n = 5) ¹⁸ cães. PMA a 0,1 uM (Figura 1A) é um agonista mai...

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Discussão

O ensaio de libertação de ADN apresentadas é um ensaio prontamente quantificável para ADN extracelular. O método foi adaptado de técnicas semelhantes utilizadas para avaliar a formação de NET em outras espécies, mas as velocidades de centrifugação, as concentrações de agonista e os tempos de incubação foram alteradas para optimizar o processo para uso com neutrófilos canino ^8,17,18. ajustes similares poderiam ser feitas para adaptar o método para outras espécies. O ensaio é simples e barato...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA	BD	367835
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Dextran-500	Accurate chemical and scientific corp.	AN228410
Phosphate buffered saline	ThermoFisher scientific	20012043
Fetal bovine calf serum, heat inactivated	ThermoFisher scientific	10100139
RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine	ThermoFisher scientific	32404-014	Should be free from phenol red
96 well flat bottomed sterile polystyrene plate	Falcon	353072
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P1585
Platelet activating factor	Sigma-Aldrich	P4904
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	ThermoFisher scientific	S7020
Synergy 2 Multi-Mode Reader	BioTek	NA