Tridimensional Super Resolution Microscopia de filamentos de actina F por Interferometric fotoativado Localization Microscopy (iPALM)

Resumo

Nós apresentamos um protocolo para a aplicação de interferometria fotoativado Localization Microscopy (iPALM), um método de microscopia de super-resolução 3-dimensional única molécula localização, à imagem do citoesqueleto de actina em células de mamíferos aderentes. Esta abordagem permite a visualização à base de luz de características estruturais em nanoescala que, caso contrário permanecem sem solução por microscopia óptica limitado por difração convencional.

Resumo

microscopia de fluorescência permite a visualização direta das biomoléculas específicas dentro das células. No entanto, para a microscopia de fluorescência convencional, a resolução espacial é limitada por difracção para ~ 200 nm, dentro do plano de imagem e> 500 nm ao longo do eixo óptico. Como resultado, a microscopia de fluorescência tem sido severamente limitada na observação das características ultra-estruturais dentro de células. O recente desenvolvimento de métodos de microscopia de super-resolução tem superar essa limitação. Em particular, o advento dos fluoróforos foto induzida permite microscopia de super-resolução à base de localização, que fornece poder de resolução que se aproxima a escala de comprimento molecular. Aqui, descrevemos a aplicação de um método de microscopia de super resolução tridimensional baseado em microscopia de localização única molécula e interferometria multifásico, chamada interferometria fotoativado Localization Microscopy (iPALM). Este método oferece resolução quase isotrópica naordem de 20 nm em todas as três dimensões. Os protocolos para visualizar o citoesqueleto de actina filamentosa, incluindo a preparação da amostra e o funcionamento do instrumento iPALM, são descritos aqui. Estes protocolos são também prontamente adaptável e instrutiva para o estudo de outras características ultra-estruturais nas células.

Introdução

A visualização das estruturas celulares complexas, desde há muito integrante a insights biológicos e descoberta. Embora a microscopia de fluorescência pode células de imagem com especificidade molecular elevado, o seu poder de resolução é limitada por difracção para ~ 200 nm, no plano de imagem (x, y, ou dimensão lateral) e> 500 nm ao longo do eixo óptico (Z, ou dimensão axial) ^1,2. Assim, a observação de características ultra-estruturais historicamente tem sido limitada a microscopia electrónica (ME). Felizmente, o recente desenvolvimento da microscopia de super-resolução tem contornado este limite, permitindo a resolução espacial no 10-100 gama nm ^1-6. Em particular, super resolução abordagens baseadas em localização única molécula, conhecida por siglas como PALM (fotoativado Localization Microscopy) ^4, FPALM (Fluorescência fotoativado Localization Microscopy) ⁵ (d) STORM (direto Stochastic Optical Reconstrução Microscopia) ^6,7, PINTURA ( PoAcumulação int para imagens em nanoescala Topografia) ^8, GSDIM (Estado Chão Depleção Microscopia seguido de retorno moleculares individuais) ^9, ou SMACM (Single-molécula activa-Control Microscopia) ^10, bem como as suas três dimensões implementações (3D), tal como PALM interferométrico (iPALM) ¹¹ ou 3D-STORM ^12, têm sido valiosos em revelar novos insights sobre a organização nanoescala de numerosas estruturas biológicas, incluindo os axônios neuronais e sinapses ^13, adesões focais ^14,15, junções célula-célula ^16, nuclear poros ¹⁷ centrossomas, e ^18-20, para nomear alguns.

Outra característica ultra-estruturais em células para as quais a microscopia de super-resolução é potencialmente útil é o citoesqueleto de actina. O complexo de malha filamentosa (F) -actina no córtex celular desempenha um papel essencial no controlo da forma e propriedades mecânicas celular ^21. A organização of f-actina é activa e dinâmica regulada embora numerosas proteínas reguladoras que influenciam fortemente a polimerização, reticulação, volume de negócios, estabilidade e topologia de rede ^22. No entanto, embora a caracterização da arquitectura malha de actina F é importante para percepções mecanísticos em uma grande variedade de processos celulares, o pequeno tamanho (~ 8 nm) dos filamentos F-actina dificulta a sua observação por microscopia de luz limitado por difração convencional; Assim, a visualização da estrutura fina actina tem sido até agora exclusivamente realizada por EM. Aqui, nós descrevemos protocolos para a visualização do citoesqueleto de actina F em células de mamífero aderentes, usando a técnica de microscopia de super-resolução iPALM para tirar partido da sua capacidade muito alta precisão em 3D ^11,23. Embora o instrumento iPALM é altamente especializada, instruções sobre a criação de um tal instrumento foi descrito recentemente ^23, enquanto o acesso ao microscópio iPALM organizada pelo Hoala Hughes Medical Institute, também foi disponibilizado para a comunidade científica com um custo mínimo. Além disso, os métodos de preparação de amostras aqui descritas são directamente aplicáveis aos abordagens alternativas 3D Super resolução, como aquelas baseadas em desfocagem astigmatic da função de propagação do ponto (PSF) ^{de 12} ou bi-plano de detecção ^24, que são mais amplamente disponível.

Notamos que um ingrediente necessário para a microscopia de super resolução baseada em localização única molécula, em geral, é o fluoróforo foto induzida ^25, que permite que os três requisitos essenciais para a microscopia de super-resolução com base em localização única molécula de ser cumprido: i) alta single-molécula brilho e contraste em relação a sinais de fundo; ii) distribuição esparsa de moléculas individuais em um determinado quadro de imagem; e iii) densidade espacial de alta rotulagem suficiente para capturar o perfil da estrutura de base (também conhecida como Nyquist-Shacritério de amostragem nArquivos não) ^26. Assim, para obter resultados satisfatórios, a ênfase deve ser colocada igualmente em ambos a preparação adequada das amostras para otimizar fluoróforo photoswitching e preservar a ultra-estrutura subjacente, bem como sobre os aspectos de instrumentação e aquisição dos experimentos.

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Protocolo

1. Criação de Imagens Preparação de Amostras

1. Uma vez que os sinais de fluorescência de fundo interferir com fluorescência a partir de fluoróforos etiquetas, limpar os esfregaços por primeiro enxaguar em água desionizada _(ddH2O) e, em seguida, ar-secando-os com ar comprimido. Subsequentemente, executar gravação por plasma num dispositivo de limpeza de plasma durante 15 seg, ou mais longo, se necessário.
2. Para ativar a correção de deriva e calibração iPALM, utilize # 1.5 round (22-mm de diâmetro) esfregaços pré-limpos incorporados com nanopartículas fluorescentes como pontos de referência, que servem fiducials como altamente fotoestável para calibração confiável e correção de drift. Devido ao tempo de aquisição muito tempo necessário para acumular suficiente densidade fluoróforo (> 15 - 30 min), a deriva de amostra é inevitável.
3. Colocar cada lamela fiducialed em uma placa de cultura de tecidos de 6 poços. Esterilizá-los por radiação ultravioleta (UV) numa câmara de fluxo laminar durante 15 min.
4. Em uma capela de fluxo laminar estéril, prepare fibroNectin solução para revestimento lamela por diluição de 1 mg / ml de solução stock de f ibronectina em solução salina tamponada com fosfato estéril de Dulbecco (DPBS) a uma concentração final de 2-10 ug / ml. Lavar cada lamela três vezes com DPBS e incubar com 2 ml da solução de f ibronectina durante a noite a 4 ° C. Posteriormente, aspirar a solução fibronectina e lave uma vez com DPBS.
5. Lavar as células brevemente com DPBS. Incubar por 1 - 2 ml de tripsina durante alguns minutos a 37 ° C até as células separar e extingue-se com ~ 10 mL de meio de cultura celular contendo soro fresco. Por exemplo, para as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), utilizar o meio de cultura endoteliais dos vasos grandes suplementado com grandes factores endoteliais dos vasos e penicilina ou estreptomicina.
   1. Replate as células sobre a lamela revestida de fibronectina (para uma densidade de esparso, placa <50.000 células por lamela) e manter a cultura numa incubadora a 95% de humidade, 5% de CO _2, e 37 & #176; C.
6. Para a preservação adequada dos finas estruturas do citoesqueleto de actina F, utilizar soluções tampão baseadas em reagentes tampão de Good ^27.
   1. Por exemplo, preparar tampão PHEM como uma solução 2x da (PIPES 120 mM, HEPES 50 mM, EGTA 20 mM, MgCl ₂ 4 mM, pH 7,0 com KOH) por dissolução de 6,5 g de HEPES, 3,8 g de EGTA, e 190 mg de MgCl ₂ em ~ 300 ml de _ddH2O, com o pH ajustado para 7,0 por adição gota a gota de uma solução de KOH concentrado; em seguida, adicionar _ddH2O para levar o volume até 500 ml. Esteriliza-se o tampão através de um filtro de 0,22 mícrons, armazená-lo a 4 ° C, e dilui-lo 1: 1 com _ddH2O antes da utilização.
7. Para obter os melhores resultados com a rotulagem de alta densidade de F-actina, o uso faloidina conjugada com fluoróforos orgânicos, tais como Alexa Fluor 647. No ponto de tempo desejado após replating célula, fixar as células como se segue:
   1. Aspirar a mídia de cada poço de cultura contendo o ceespécime ll. Suavemente, mas rapidamente dispensar 2 ml de fixadores de extracção quentes (37 ° C) contendo 0,25% de glutaraldeído em tampão de PHEM com 0,25% de Triton X-100. Incubar-la à temperatura ambiente durante 1-2 minutos. Para obter as etapas subsequentes, use 2 ml de fixador ou extinguir buffer por lamela, salvo indicação em contrário.
   2. Substitua o fixador extracção com um fixador de glutaraldeído 2,5% em tampão PHEM e deixar que as amostras incubar por 10-12 min. Este e todos os seguintes passos são realizados à temperatura ambiente.
   3. Aspirar os fixadores e gentilmente substituí-los com tampão PHEM. Tilt e homogeneizar suavemente, e depois lavar novamente com PHEM. Repita duas vezes.
   4. Para extinguir autofluorescência de glutaraldeído, o que pode sobrecarregar os sinais a partir de fluoróforos desejadas, incubar as amostras com um tampão de têmpera recentemente preparada com _NaBH4 a uma concentração de massa de 0,1% em PHEM. será observado bolhas profusas. tocar ocasionalmente o prato de amostra suavemente para DISLodge as bolhas. Deixe-a incubar durante 5 - 10 min.
   5. Aspirar o buffer de têmpera e gentilmente substituí-lo com tampão PHEM. Lavar algumas vezes para limpar as bolhas. Pipetar em 2 ml de tampão PHEM e deixá-lo incubar no escuro durante 5 min. Repita duas vezes e deixar o resto da amostra em tampão PHEM quando terminar.
   6. Preparar uma câmara de humidade durante phalloidin incubação utilizando um grande plástico de Petri preenchido com um pedaço de papel toalha generosamente humedecido com 5 - 10 ml de DDH ₂ O. Coloque uma grande folha de Parafilm limpa em cima da toalha de papel molhado.
   7. Devido ao custo relativamente elevado de faloidina etiquetada, usar um pequeno volume para cada rotulagem. Para a etiquetagem de alta densidade, começam com uma concentração de 0,3 uM. Prepara ~ 60 ul por lamela utilizando faloidina-Alexa Fluor 647 em tampão PHEM.
   8. Pipetar 55 - 60 ul de solução a faloidina para a folha de Parafilm na câmara de humidade. Usando uma pinça fina, remover suavemente a coverg espécimemoça. Seja cuidadoso ao observar a face contendo as células corretas.
   9. Rapidamente e bata suavemente o excesso de tampão por tocar a borda da lamela com um pedaço de papel dobrado delicado absorvente, e, em seguida, colocar o lado das células para baixo lamela sobre a gota de solução de faloidina na Parafilm. Certifique-se de que não existem bolhas de ar pela lamela.
   10. Coloque a tampa na câmara de humidade. Enrole a câmara em folha de alumínio para protegê-lo da luz ambiente, e deixe a amostra incubar durante a noite a 4 ° C. A amostra pode ser mantidas nesse estado durante vários dias. Certifique-se de que a câmara de umidade permanece úmido se o armazenamento de longa está prevista.
8. Antes da imagiologia, suavemente colocar lado a célula lamela para cima sobre uma nova placa de 6 cavidades contendo 2 mL de tampão de PHEM por poço.
9. Preparar tampões de imagem à base de tiol-scavenged oxigénio utilizando as seguintes soluções de reserva: 1 M de glicose, cisteamina 1 M, e 100x de glucose oxidase / MIXT enzima de catalaseure (4 mg de catalase e 10 mg de glucose oxidase em 100 ul de tampão de PHEM, bem misturado por vórtex ^28). Logo antes de imagiologia, misturar 75 mL de solução 1 M de glicose, 30 ml de solução 1 M de cisteamina, e 3 ul de mistura enzimática da 100x. Ajustar o volume para 300 ul com tampão de PHEM e utilizar imediatamente após a mistura para montagem da amostra.
10. Para iPALM, preparar a amostra de imagem usando um pré-limpeza # 1.5 lamela (22 mm de diâmetro).
    1. Em alternativa, usar uma lâmina de vidro (3 "x 1") com um espaçador de dupla face adesiva para auxiliar na montagem se baseia-astigmatismo 3D-TEMPESTADE ¹² é para ser utilizado em vez disso.
    2. Para montar a amostra de imagem, use uma pinça fina para remover delicadamente a lamela espécime do buffer bem. Em seguida, rapidamente e bata suavemente o excesso de tampão por tocar a borda da lamela com papel absorvente dobrada.
    3. Coloque o lado das células lamela voltado para cima em um pedaço de papel de lente limpa. Lavar a amostracolocando 30 - 50 ul de tampão de amostra de imagem para o, e remover o excesso de tampão através da inclinação e batendo com papel absorvente dobrada.
    4. Repetir o passo de enxaguamento algumas vezes, e, em seguida, colocar 30 - 50 ul de tampão de imagem sobre a amostra. Secar a extremidade da lamela e colocar vários pontos muito pequenos de epoxi de cura rápida na área seca.
    5. Lentamente, abaixe outra # 1.5 lamela pré-limpeza (normal, lamela redondo, de 18 mm de diâmetro) para o centro da lamela contendo células de 22 mm. Deixe o tampão de imagem molhar ambos os esfregaços por acção capilar. Os pequenos pontos de epóxi de cura rápida devem aderir a ambos os esfregaços.
    6. Pressione suavemente sobre a amostra montada com papel absorvente dobrado para espalhar a pressão uniformemente. Utilize uma pressão suficiente para fazer célula-fina da amostra e até mesmo (<15 um), mas não tanto quanto para esmagar as células. Medir a espessura adequada, observando padrão de anéis de Newton. Além disso, certifique-se de executar esta stEP suavemente para minimizar as bolhas de ar. Se necessário, praticar com esfregaços vazias várias vezes de antemão.
11. Selar a amostra com derreteu vaselina-lanolina em parafina (valap, estoque preparado a partir de 100 g cada de vaselina, lanolina e parafina derretida em conjunto) ^29, enxaguar a amostra selada com DDH ₂ O, e seque com ar comprimido. A amostra está agora pronto para montagem sobre o microscópio para a imagem latente.

2. A colocação da amostra e Alinhamento iPALM

1. Mover a lente objectiva topo carregados por mola para cima para permitir a remoção do suporte da amostra. Coloque a amostra lacrados, preparados na etapa 1.10 no suporte da amostra e seguro, com vários pequenos ímãs de terras raras. Aplicar o óleo de imersão em ambos os lados da amostra de imagem. Coloque o suporte de amostra de volta para o caminho óptico e delicadamente abaixar a lente objetiva superior.
2. Ligue os lasers de excitação. Ligue o dispositivo Electron Multiplicando Charge-Coupled (EMCCD) câmera no modo de transferência de quadro.
   1. Gire nos filtros de emissão adequados. Ativar um obturador mecânico para bloquear o topo caminho do feixe (Figura 1A) e abrir o caminho do feixe de fundo. Traga a lente objetiva de fundo em foco pela tradução em pequenos incrementos usando o atuador piezo.
   2. Uma vez que o fiducial está em foco, abrir o percurso de feixe superior, bloqueando o percurso do feixe de fundo e trazer a lente objectiva topo para o foco de um modo semelhante. Monitorar a largura da fiducial no monitor do computador para a focagem ideal.
3. Para centração adequada, aberta tanto a superior e percursos de feixes de fundo. ajustar manualmente a lente objetiva topo, enquanto o objetivo do fundo é mantido constante usando um par de parafusos de ajuste micro-fino, até que as imagens fiduciais são sobrepostas, tanto quanto possível, de preferência dentro de um pixel.
   1. Posteriormente, realizar ajustes finos para que as imagens de referência no passo 2.3 sobreposição dentro de um décimo de um pixel de EMCCD. Ajuste o topo2 eixos espelhos montados em piezo através do software de controle, mantendo ambas as lentes objetivas ea reflexão de fundo espelha constante. Compare os centros das fiducials do topo e no fundo visualizações objetivas através da tela do computador para orientar o processo.

3. A calibração do Setup iPALM

Observação: Uma vez que a emissão de fluorescência é incoerente, por interferência a ser observado em iPALM, a comprimentos de percurso através da parte superior e inferior objectivos devem estar próximos uns dos outros, dentro de poucos microns. Isto pode ser conseguido como segue:

1. Com os lasers no, as câmaras de fluxo contínuo, ea parte superior e inferior caminhos do feixe aberto, oscilar o suporte de amostras Z-piezoeléctrica, que utiliza uma forma de onda de tensão sinusoidal gerada pelo software de controlo para uma oscilação do eixo z contínua ao longo de uma amplitude de 400 nm .
2. Tirando vantagem do facto de que, quando fora de um alinhamento óptimo, a intensidade fiducial varia pouco com tele oscilação, traduzir manualmente o conjunto divisor de feixe motorizado para cima ou para baixo até que a intensidade das oscila fiduciais devido ao efeito de interferência de fóton único desejado. Isto significa a próxima correspondência dos comprimentos de percurso óptico. Um rácio de pico a vale de> 10 pode ser conseguida em casos ideais (Figura 1D).
3. Para garantir que tanto a amplitude ea fase em cada superfície são tão uniforme quanto possível em todo o campo, ajustar o espelho inferior do conjunto divisor de feixe em pequenos passos para ajustar a distância e os ângulos de inclinação. Execute divisor de feixe fino de alinhamento, traduzindo a amostra em 8 Nm z-passos acima de 800 nm.
   1. Monitorar a intensidade fiducial entre câmeras # 1 - 3. Ajuste a altura, posição e inclinação do espelho inferior dentro do conjunto divisor de feixe em pequenos passos, de modo que a fase de oscilação da câmera # 1 em relação à câmera # 2 é maximizada, idealmente a 120 ° C (Figura 1B-D).
   2. Uma vez que o inicialalinhamento estará completo, traduzir a amostra para verificar se há um campo adequado de vista que contém ambas as células a imagem e várias fiducials nas proximidades. Coloque um invólucro em torno do sistema para bloquear a luz difusa e perturbações ambientais. Uma vez que a área de imagem for encontrado, realizar o procedimento no passo 3.4 novamente, e registrar a curva de calibração para uso em subsequentes extracções coordenada z utilizando o comando "Adquirir calibração Scans vs Piezo Amostra Position" na interface principal.

4. Aquisição de Dados

1. Uma vez que uma área desejada é encontrado e a curva de calibração é obtida, digite os nomes de arquivos apropriados para o software. Abra a parte superior e percursos de feixes de fundo. Aumentar a energia de excitação do laser de 642 nm para o máximo. Para Alexa Fluor 647, um período inicial de fluoróforo de desligar pode ser necessário (Figura 2A).
   1. Expor com uma constante de excitação 642 nm durante 5 min, ou mais, se necessário, até Simolécula ngle piscar é observado (Figura 2B). O software permite um aumento automático da activação do foto-405 nm durante o curso da aquisição. Um grande número de quadros de aquisição são geralmente necessários para recursos filamentosos a ser claramente visível (> 50.000 quadros). Quando estiver pronto, começar a aquisição de conjuntos de imagens em bruto utilizando o comando "Start iPALM Aquisição" na interface principal.
2. Durante a aquisição, ajustar o nível de fotoactivação ajustando a intensidade do laser de 405 nm para manter a densidade intermitente adequado, conforme necessário (ver exemplos na Figura 2B).
   NOTA: Uma vez que a aquisição for concluída, o software irá automaticamente converter os arquivos de imagem para o formato binário adequado. O repositório de dados no servidor de computação é montado como uma unidade de rede, permitindo que os dados a ser copiado directamente lá para processamento adicional.

5. Processamento de Dadose Análise

1. Executar análise de localização utilizando um software customizado para extrair os parâmetros de melhor ajuste para todas as moléculas individuais, bem como para os fiduciais ^11,15,23. Obteve-se não só os X, coordenada y, mas também a intensidade que é usado para a análise da curva de calibração.
   1. Importe os dados de calibração matérias adquiridas no passo 3.5 utilizando o comando "Extrair Picos várias etiquetas" no menu "File" para executar a localização única molécula. Após a análise de localização inicial, coordenadas obtidas a partir de câmaras # 1 - 3 estão presentes em canais vermelho, verde e azul, respectivamente, e pode ser guardado para posterior análise usando o comando "Guardar processado como IDL (sav)" sob o título " menu arquivo ".
2. Para trazer os dados das câmeras # 1 - 3 em registo com as fiducials fluorescentes embutidas nas lamelas, selecione vários fiducials brilhantes para fornecer cobertura da imagem central (por exemplo,Figura 1B), utilizando o comando "Anchor Fiducial Pontos" no menu "Transformações de Imagens". Use os conjuntos triplos de localização de coordenadas a partir de câmeras # 1 - 3 obtidos a partir dos fiducials brilhantes no passo 5.1 para calcular a rotação e a matriz de escala que vai trazer câmeras # 1 e # 3 no registrador com câmera # 2. Com um número suficientemente grande de fiducials, de ordem superior deformação polinomial pode ser realizada para melhor se encaixa.
3. Uma vez que a matriz de transformação é calculada, transformar os dados brutos de câmaras # 1 - 3 em conjunto para obter os dados não processados ​​somados. Realizar outra rodada de análise de localização para produzir um mais precisas x, y-coordenar e determinar a contribuição relativa de cada canal da câmera para os dados brutos somados; use o comando "Transformar Raw, Salvar e Salvar Sum (.dat)" sob o menu "Transformações de Imagens". Esta relação da intensidade contém a informação coordenada z.
4. Selecione um fiducial brilhante e executar z-calibração montagem usando a função "Test Wind Point 3D" na caixa de diálogo pop-up, clicando em "Z-coordenar as operações" sob o menu "Funções especiais". Isso vai caber funções de 3 senoidais para as intensidades dos 3 canais de câmera para determinar a curva de calibração. O arquivo de calibração é então guardado para uso posterior sobre os principais conjuntos de dados.
5. Para testar a qualidade da curva de calibração, efectuar a extracção coordenada z, tal como descrito anteriormente ^23. Para fiducials bem-comportados em um sistema bem calibrado, o coordenada z deve escalar linearmente, uma vez que os conjuntos de dados de calibração são tomadas com um movimento linear em z-position. Além disso, o Z-posições de todos os fiduciais deve ser dimensionada com uma inclinação semelhante.
6. Uma vez que uma calibração satisfatória é obtida, execute localização e análise de transformação para os conjuntos de dados de imagem não processados ​​adquiridos na etapa 4 a seguir procedimento idêntico ao descrito nos passos 5,1-5,3. Quando terminar, carregue o arquivo de calibração a partir do passo 5.4 e realizar a extração coordenada z utilizando as funções "Pick WND Arquivo" e "Extrair Z coordenadas" na caixa de diálogo pop-up, clicando em "Z-coordenar as operações" sob o menu "Funções especiais".
   Observação: Uma vez que o tempo de aquisição é> 15 min, desvio mecânico é de se esperar.
7. Para realizar correção de desvio em x, y, selecione um fiducial brilhante a partir das coordenadas de localização. Este fiducial deve estar presente em todos os quadros. Em seguida, use o x, a deriva do fiducial coordenada y para alinhar todas as outras coordenadas dentro do mesmo quadro de volta para o registro (Figura 3A-B) usando a função "Test / Escrever Estrela Guia" sob o menu "Transformações de Imagens". Registro coordenada Z pode ser realizada de forma semelhante, acessando o "Test Guide Star" e "Write Estrela Guia" funções na caixa de diálogo pop-up, clicando em "Z-coordenar as operações" sob o menu "Funções especiais".
8. Como a amostra pode apresentar ligeira inclinação, faça a correção de inclinação, fornecendo os x, y, z-coordenadas de 3 pontos de referência que define o plano que deve ser definido nível usando a função "Remover XYZ Tilt" na caixa de diálogo pop-up, clicando em " Z-coordenar as operações "sob o menu" Funções especiais ".
9. Subsequente à deriva e inclinação correções, gravar as coordenadas de localização. Reconstruir uma imagem de super resolução para análise posterior (Figura 4A-D), usando o comando "render" na interface principal. A cor pode ser usado para indicar a coordenada z. Alternativamente, uma vista lateral da área seleccionada também pode ser processado. As coordenadas de localização podem ser exportados como arquivos de texto para posterior quantificação, ou a imagem reconstruída pode ser salva como um arquivo .tif.

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Resultados

requisitos críticos para iPALM são o alinhamento, registro e calibração dos sistemas ópticos. Estes são necessários para garantir a interferência adequada dentro do 3-way divisor de feixe requisito para extração coordenada z. Para permitir a monitorização contínua, fontes pontuais constantes de fluorescência são necessárias. Isto pode ser conseguido usando fluorescente Au ou nanopartículas bimetálicas ²³ cuja fotoluminescência surgir de ressonância de plasm...

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Discussão

O sistema óptico de iPALM baseia-se no objectivo de criação de uma dupla-4-oposição π, como mostrado na Figura 1A. A configuração é construído usando peças tanto custom-usinados e comerciais opto-mecânico, como descrito anteriormente ²³ e listados na Tabela 1. Além da nossa configuração, o Howard Hughes Medical Institute (HHMI) hospeda um sistema que é acessível à comunidade científica no Imaging Center avançada no Campus Janelia Research....

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
optical table	Newport, CA	RS4000	iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators
vibration isolator for optical table	Newport, CA	S-2000
laser-642	Newport, CA	1185055	output power=100 mw
laser-561	Newport, CA	1168931	output power=200 mw
laser-488	Newport, CA	1137970	output power=200 mw
laser-405	Newport, CA	1142279	output power=100 mw
broadband dielectric mirrors	Thorlabs, NJ	BB1-E02	laser combiner
dichroic beamsplitter	Semrock, NY	LM01-427-25
acousto-optic tunable filter	AA Opto-Electronic, France	AOTFnC-VIS-TN
Linear polarizer	Newport, CA	05LP-VIS-B
baseplate	local workshop	customized
turning mirror (22.5°)	Reynard Corpporation, CA	customized	22.5° mirror
motorized optic mounts	New Focus, CA	8816
motorized XYZ translation stage	Thorlabs, NJ	MT3/M-Z6	sample holder
T-Cube DC servo motor controller	Thorlabs, NJ	TDC001
Piezo Phase Shifter	Physik Instrumente, Germany	S-303.CD
objective lens	Nikon, Japan	MRD01691	objective. Apo TIRF 60X/1.49 oil
translation stage	New Focus, CA	9062-COM-M
Pico Motor Actuator	New Focus, CA	8301
rotary Solenoid/Shutter	DACO Instruments, CT	5423-458
3-way beam splitter	Rocky Mountain Instruments, CO	customized	beamsplitter
Piezo Z/Tip/Tilt scanner	Physik Instrumente, Germany	S-316.10
motorized five-axis tilt aligner	New Focus, CA	8081
Picmotor ethernet controller	New Focus, CA	8752
Piezo controllers/amplifier/digital operation module	Physik Instrumente, Germany	E-509/E-503/E-517
band-pass filter	Semrock, NY	FF01-523/20	filters
band-pass filter	Semrock, NY	FF01-588/21
band-pass filter	Semrock, NY	FF01-607/30
band-pass filter	Semrock, NY	FF01-676/37
notch filter	Semrock, NY	NF01-405/488/561/635
motorized filter wheel with controllter	Thorlabs, NJ	FW103H
EMCCD	Andor, UK	DU-897U-CSO-#BV	3 sets
Desktop computers for controlling cameras and synchronization	Dell	Precision T3500	PC, 4 sets
coverslips with fiducial	Hestzig, VA	600-100AuF	sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available
fibronectin	Millipore, MT	FC010
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences, PA	15710	fixation. 16%
glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences, PA	16220	25%
triton X-100	Sigma aldrich, MO	T8787
HUVEC cells	Life Technologies, CA	C-015-10C
Medium 200	Life Technologies, CA	M-200-500
Large Vessel Endothelial Factors	Life Technologies, CA	A14608-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline		14190367
Pennicillin/Streptomycin		15140122
Trypsin/EDTA	Life Technologies, CA	25200056
PIPES	Sigma aldrich, MO	P1851	PHEM
HEPES	1st base, Malaysia	BIO-1825
EGTA	Sigma aldrich, MO	E3889
MgCl2	Millipore, MT	5985
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Invitrogen, CA	A22287	staining
sodium borohydride (NaBH4)	Sigma aldrich, MO	480886	quenching
glucose	1st base, Malaysia	BIO-1101	imaging buffer
glucose oxidase	Sigma aldrich, MO	G2133
catalase	Sigma aldrich, MO	C9322
cysteamine	Sigma aldrich, MO	30070
Epoxy	Thorlabs, NJ	G14250
vaseline	Sigma aldrich, MO	16415	sample sealing
lanolin	Sigma aldrich, MO	L7387
parafin wax	Sigma aldrich, MO	327204
Immersion oil	Electron Microscopy Sciences, PA	16915-04	imaging. Cargille Type HF