NOTA: Todos os procedimentos de recolha de sangue foram conduzidos de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB).
1. Recolha de Sangue Total
- Tenha um phlebotomist certificada tirar sangue de acordo com as diretrizes da Organização Mundial de Saúde.
- Tirar sangue em um 4 ml tubo de colheita de sangue contendo ácido Di-Potássio etilenodiaminotetracético (EDTA K 2). Inverta tubo de recolha de sangue de acordo com as instruções do fabricante. Mantenha tubo de coleta de sangue à temperatura ambiente num agitador de bancada até à separação.
2. Preparação de células alvo marcadas com DiO
- Crescer as células K562 em completa de Iscove Modified Meios de Dulbecco (IMDM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina estreptomicina durante várias semanas, antes do ensaio para assegurar a saúde das células. Ajuste o concentratde iões das células a 3 x 10 5 células / mL diariamente através da realização de uma contagem de células e subsequente passagem de células. Executar uma mudança de meio completo a cada 2 a 3 dias.
- No dia do ensaio, executar uma contagem de células utilizando uma mistura 1: 1 hemocitómetro.
- Retirar 10 mL do frasco K562 e coloque em 1,5 mL tubo.
- Adicionar 10 ul de corante azul de tripano para o mesmo tubo de 1,5 ml para um factor de diluição de 1: 1.
- Agite suavemente o tubo para misturar K562 células e tripan corante azul.
- Permitir K562 corante azul de tripano de células-se a incubar durante 1 minuto à temperatura ambiente.
- Remover 15 mL de células K562 coradas de tubo.
- Pipeta hemocitómetro para contagem de células.
- Contagem de células nas quatro esquinas, bem como o quadrado do meio para um total de cinco quadrados.
- Calcular a contagem de células utilizando a equação:
Total de células / ml = Total de células contadas X (fator de diluição / Número de quadrados) X 10.000 / mL
- Ressuspender as células alvo K562 a uma densidade final de 1 x 10 6 culas / ml em meio de cultura IMDM isento de soro.
- Para células alvo K562 não coradas, adicionar 10 ml de células alvo K562 para um tubo de 15 ml a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml para um total de 10 x 10 6 células K562. Colocar em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 até que esteja pronto para uso.
- Para células alvo K562 DiO manchado, adicionam-se 10 ml de células K562 alvo para um tubo de 15 ml a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml para um total de 10 x 10 6 células K562.
- Adicionar 1 mL de solução-DiO rotulagem de células por ml de suspensão de células em 15 ml de tubo designada por coloração DiO e suavemente vórtice. Por exemplo, adicionar 10 ul de solução de marcação celular DiO a 10 x 10 6 K562 células / ml num volume de 1 x 10 6 células / ml.
- Incubar solução K562-DiO durante 20 min a 37 ° C com 5% de CO 2 em um tubo de 15 ml.
- Segueing de incubação, adicionar 3 ml de solução salina à temperatura ambiente fosfato tamponada (PBS) a uma solução K562-DiO contendo 15 ml de tubo.
- Centrifugar durante 10 minutos a 135 xg à temperatura ambiente.
- Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o pelete de células com uma pipeta de volume ajustável 1000 ul.
- Adicionar 10 ml de IMDM fresco para pellet contendo células 15 mL tubo.
- Suavemente o tubo de vórtice para ressuspender as células.
- Repita os passos 2.7 a 2.10 por mais duas vezes.
- Células de loja em um 37 ° C incubadora com 5% de CO 2 até que esteja pronto para uso.
NOTA: As células podem ser armazenadas no incubador durante até 24 horas, mas é preferível usá-los no mesmo dia.
3. Preparação de Controles
- Transferir o seguinte em separados e devidamente rotulados tubos de 1,5 ml:
- Adicionar 500 mL de IMDM fresco contendo ressuspenso DIO-rotulados K562 células para o "Double positiva" rotuladas 1,5 tubo mL.
- Adicionar 500 mL de IMDM fresco contendo novamente suspensas células K562 DIO-etiquetados para a "única dio" rotulados 1,5 tubo mL.
- Adicionar 500 mL de IMDM fresco contendo células K562 não marcadas ressuspendidas em a "iodeto de propídio (PI), apenas" marcado tubo 1,5 mL.
- Coloque a ponta positiva Duplo e PI apenas tubos em um 55 ° C banho de água durante 5 minutos.
- Após a 5 min tiver decorrido, remover os tubos e limpe com 70% de etanol.
- Adicionar 10 L de PI ao Duplo positiva e PI apenas 1,5 tubos mL.
- Coloque todos os três controlos de células alvo K562 na incubadora a 37 ° C durante 30 min.
- Após os 30 min de incubação tiver decorrido, centrifugar os três controlos de células alvo K562 durante 2 minutos a 163 x g.
- Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular.
- Ressuspender cada controlo com 20 mL de meio fresco cultura de células IMDM, e deixar na incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 durante pelo menos30 min para o sinal DiO óptima.
NOTA: Os controles são agora pronto para ser executado através do fluxo de imagem citômetro.
4. NK celular separação automatizada
- Ligue separador de células e permitir que o ciclo de start-up para terminar.
- Certifique-se de que todas as garrafas iluminações de fluidos são verdes e que o frasco de resíduos está vazio.
- Obter uma temperatura de 15 mL suporte de tubos quarto.
NOTA: A seleção é baseado em volumes de amostra. Por exemplo, para um volume de menos do que 3 ml de utilizar um suporte de tubos de 15 ml e para um volume de mais de 3 mL usar um suporte para tubos de 50 mL. - tubos de amostra de etiqueta em conformidade (Repita por amostra / participante): Participante 1 Whole Amostra de Sangue; Participante 1 fracção negativa; Participante 1 fracção positiva.
- Gentilmente pipeta 1,5 ml de sangue total a partir do Passo 1.2 em "Whole Amostra de Sangue" tubo de 15 mL.
- Coloque 15 ml tubo adequadamente rotulado como "Whole Amostra de Sangue" do Passo 4.5 e rotulado 15 mL "fracção negativa" e"fracção positiva" tubos de Passo 4.4 no suporte de tubos. Utilize suporte de amostras thefollowing set-up: Fileira (R1) A: Whole Amostra de Sangue, Row (R2) B: fração magneticamente marcados positiva,: Negativo, fração não marcado, Row (R4) C.
- Insira o rack separador para o MiniSampler para autolabeling.
- Seleccionar "Reagente" no menu e realçar a posição em que o frasco vai ser colocado na prateleira de separação.
- Selecione "Ler Reagente" para activar o leitor de código 2D.
- Colocar o frasco do reagente apropriado em frente do leitor de código de 2D entre 0,5-2,5 cm da tampa do leitor de código.
NOTA: Por exemplo, o reagente necessário para a separação de células NK é CD56. - Segure frasco de reagente em um ângulo na frente do leitor de código 2D para leitura ideal.
- Colocar o frasco de reagente para a posição adequada cremalheira separador.
- Destacar as posições desejadas na aba Separação na tela.
- No submenu Labeling, atribuir um auprograma tolabeling.
- Atribuir a célula de separação MicroBeads Reagente CD56 para acumular posições 1, 2, 3 e 4.
- Selecione o programa de separação "posselwb".
- Selecione a opção "lavar" programa de lavagem.
- Inserir um volume de amostra de 1.500 mL no submenu "Volume" usando o teclado numérico.
- Selecione a opção "Enter" no teclado.
- Selecione "Executar" para iniciar a separação de células.
- Selecione "OK" para confirmar que tampão suficiente disponível para o processamento de todas as amostras.
5. Contagem de Células NK Separação Após celular
- Imediatamente após a separação de células com o separador de células, recuperar a fração positiva. Deixe em temperatura ambiente. Esta fracção contém a população de células NK puro desejado.
- Para cada amostra individual, executar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro, como por Etapa 2.2.
- Após os cálculos, registre a contagem de células.
6. Ensaio de Citotoxicidade Preparação da Amostra
- Preparar e rotular tubos de 1,5 ml para cada amostra / participante em conformidade.
- Pipeta desejada proporção de células NK e células K562 DIO-rotulados para cada tubo.
NOTA: Por exemplo, a proporção desejada de células alvo K562 e células efectoras NK é de 1: 5. - Centrifugar durante 5 minutos a 135 x g.
- Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular.
- Ressuspender NK-DiO marcado mistura de células K562 em 500? L de meio celular NK sem interleucina-2 (IL-2) e 2-mercaptoetanol (2-ME) (incompleta meios de cultura de células NK).
NOTA: O meio de cultura de células NK é incompleta Meio Essencial Mínimo de Eagle com bicarbonato de sódio, sem L-glutamina, ribonucleósidos e desoxiribonucleósidos. - Adicionar 5 mL de PI a cada tubo.
- Centrifugar durante 2 minutos a 163 x g.
- Incubar as células a 37 ° C durante 2 h.
- Após 2 h de incubação, centrifuGE durante 2 minutos a 163 x g.
- Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular.
- Ressuspender as células em 25 ul incompleta meios de cultura celular NK.
7. Preparação de espontânea ( "S") Amostra
- Pipetar 500 ul de células K562 DIO-marcados (concentração de 1 x 10 6 células / ml) no tubo de 1,5 mL.
- Adicionar 10 ul de PI de cada um dos tubos.
- tubo de centrifugação durante 2 minutos a 163 x g.
- Incubar as células a 37 ° C durante 2 h.
- Após 2 h de incubação, centrifuga-se durante 2 min a 163 x g.
- Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular.
- Ressuspender as células em 25 ul incompleta Meio Essencial (MEM-α) Meios de cultura de células alfa-mínimos.
8. Aquisição de Dados com imagens de fluxo Citómetro
- Pressione o botão verde no interior da porta da frente da imagem de citometria de fluxo para ligar o instrumento.
- Ligue all computadores associados com a imagiologia de fluxo FACSCalibur.
- Inicie o fluxo de imagem citômetro software.
- Clique no botão "Iniciar" para limpar o sistema e preparar a linha de amostra.
- Uma vez que o "Startup" estiver concluída, feche a janela "calibrações".
- Atribuir canais: no lado superior esquerdo, clique em cada canal, a fim de atribuir-lhes.
- No lado direito, clique no botão gráfico de dispersão para criar 4 scatterplots: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 e FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01.
- Comece analisando amostras usando primeiro o controle "Double positiva".
- Clique em "Load".
- Coloque o tubo de 1,5 ml com a amostra "Double positiva" de Passos 3,4 para 3,9 no carregador de amostra.
- Selecione o objetivo 40X sob a guia "Ampliação".
- Ligue a 405 mW e642 lasers MW.
- Ligue o canal "Brightfield".
- Clique em "Selecionar intensidade."
- Com base na amostra de controlo "Duplo positiva", determinar a intensidade desejada para o laser de 405 mW de modo que o detector não está sobrecarregado.
Nota: Por exemplo, a intensidade ideal para este experimento foi fixado em 11 mW.
- Após a desejada set-up é conseguido, adquirir dados.
- Sob a guia "Aquisição Arquivo", digite em um texto nome personalizado. Selecione uma pasta para salvar o arquivo (s) de dados.
- Digite o número de células de adquirir ao lado de "Collect". Tipicamente, este número varia entre 1.000 a 10.000.
- Clique em "Adquirir".
NOTA: Uma vez que o número desejado de células é adquirido, o arquivo de dados é salvo automaticamente na pasta selecionada anteriormente.
- Após a aquisição for concluída, carregar a amostra de controlo seguinte - DiO único controle.
- Clique em "Load".
- Coloque o tubo de 1,5 mL com o "único dio" amostra para o carregador de amostra.
- Deixar o objetivo 40X sob a guia "Ampliação" selecionado.
- Deixar o laser 405 mW ligado.
- Desligue a mW laser de 642 e o canal "Brightfield".
NOTA: Agora que a desejada configuração foi alcançado, os dados podem ser adquiridos. - Sob a guia "Arquivo Aquisição", digite em um texto nome personalizado e escolha uma pasta para salvar o arquivo (s) de dados. Digite o número de células de adquirir ao lado de "Collect.". Normalmente este número é de 1.000.
- Clique em "Adquirir".
NOTA: Uma vez que o número desejado de células é adquirido o arquivo de dados é salvo automaticamente na pasta selecionada anteriormente.
- Repita o passo 8,10 para o "único PI" amostra de controlo. As amostras experimentais estão agora prontos para serem recolhidos.
- Lidar com as remaining amostras experimentais, incluindo as "amostras" S "espontânea" da seguinte forma:
- Deixar o objetivo 40X sob a guia "Ampliação" selecionado.
- Ligue a 405 mW e 642 lasers MW.
- Ligue o canal "Brightfield".
- Clique em "Intensidade Set."
- Sob a guia "Arquivo Aquisição", digite em um texto nome personalizado e escolha uma pasta para salvar o arquivo (s) de dados. Digite em um texto nome personalizado.
- Digite o número de células de adquirir ao lado de "Recolha".
- Clique no botão "Acquire".
NOTA: Uma vez que o número desejado de células é adquirido o arquivo de dados é salvo automaticamente na pasta selecionada anteriormente.
- Repita o passo 8,12 para todas as amostras experimentais.
- Depois de todos os dados experimentais e arquivos foram recolhidos, clique no botão "Shutdown" para esterilizar o sistema.
9. ImaginAnálise de amostras g Citómetro de fluxo
- Abra o fluxo de imagiologia citómetro de aplicação de software de análise.
- Em "Arquivo", abra um arquivo .RIF experimental.
- Construir uma nova matriz usando os arquivos .RIF única cor (OID somente controlar e controle somente-PI, criado durante as etapas de 8.10 e 8.11), selecionando "Criar um novo Matrix" sob a guia de Compensação no fluxo de imagens citômetro software.
NOTA: O software irá pedir para a seleção dos arquivos de uma só cor e fundi-los para criar um arquivo de matriz (extensão de arquivo .ctm), que está a ser selecionado para aplicar a compensação de canal. - Criar gráficos de pontos utilizando a função de "blocos de construção" do software.
- Criar um ponto-plot (BrightFieldGradient_RMS vs frequência) para a porta do células focalizados. Ligue para o portão "Focus" (Figura 1A).
- Usando o portão "Focus", criar um gráfico de pontos de Bright Área Campo vs Campo brilhante proporção para g comeu as células singlet. Ligue para o portão "Single" (Figura 1B).
- Usando o portão "Single", criar um gráfico de pontos de Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Utilize este plano para identificar e células dupla positivos (metas, mortos) gate DIO-positiva apenas células (alvos, vivo) e PI-DiO (Figura 1C).
NOTA: Todas as parcelas descrito nos passos 9.4.1, 9.4.2 e 9.4.3 podem ser criados usando a função de "blocos de construção" do software.
- Clique na função de estatísticas do gráfico de pontos para acessar os números de células de cada portão.
- Calcula-se a percentagem de alvos na amostra mortas espontânea e amostras experimentais utilizando a seguinte fórmula:
% alvos mortos na amostra = (alvos #dead x 100) / (# viver alvos + #dead alvos) - Calcular a citotoxicidade utilizando a seguinte fórmula:
% Citotoxicidade = [(Experimental mortos mortos-espontânea) / (morto 100 espontânea)] x100
_content "fo: manter-together.within-page =" 1 ">
Figura 1: histogramas representativos, gráficos de dispersão e imagens para análise da atividade citotóxica. Análise
(A) células foco.
(B) Análise única célula. Análise
(C) coloração das células alvo. Todas as determinações são feitas usando a imagem anexada para cada evento. Isso pode ser acessado no software de análise, basta clicar sobre o evento nos gráficos.
(D) imagem representativa de um evento de gibão, mostrando uma célula NK apoptótica e um alvo K562 ao vivo. Ch01, Brightfield. CH02, a DIO. CH05, PI.
Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.