A fabricação de um UV-Vis e espectroscopia Raman de plataforma Imuno

Resumo

Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.

Resumo

Os imunoensaios são usados ​​para detectar as proteínas com base na presença de anticorpos associados. Devido à sua ampla utilização na pesquisa e na clínica, uma grande infra-estrutura de instrumentos e materiais de imunoensaio pode ser encontrado. Por exemplo, 96 e 384 poços placas de poliestireno estão disponíveis comercialmente e têm um desenho padrão para acomodar máquinas de espectroscopia de ultravioleta-visível (UV-VIS) de vários fabricantes. Além disso, uma grande variedade de imunoglobulinas, etiquetas de detecção, e os agentes de bloqueio para os desenhos de imunoensaio personalizadas, tais como ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) estão disponíveis.

Apesar da infra-estrutura existente, kits de ELISA convencionais não satisfazem todas as necessidades de pesquisa, o que requer o desenvolvimento de imunoensaio individualizado, o que pode ser caro e demorado. Por exemplo, kits de ELISA têm baixa multiplexação (detecção de mais do que um analito ao mesmo tempo) como capacidades que geralmente dependem de fluorescência ou colorimetric métodos para a detecção. Colorimétrico e análises fluorescentes baseados em ter capacidades de multiplexação devido a grandes picos espectrais limitados. Em contraste, os métodos baseados em espectroscopia Raman tem uma capacidade muito maior para a multiplexação devido a picos de emissão estreitas. Outra vantagem da espectroscopia Raman é que os repórteres Raman experimentar significativamente menos fotodegradação do que marcadores fluorescentes ^1. Apesar das vantagens que os repórteres Raman têm mais de marcadores fluorescentes e colorimétricos, protocolos para fabricar imunoensaios baseados em Raman são limitadas. O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo para preparar sondas funcionalizadas para usar em conjunto com placas de poliestireno para detecção direta de analitos por análise de UV-Vis e espectroscopia Raman. Este protocolo permitirá aos investigadores ter uma abordagem do-it-yourself para a detecção futuro multi-analito enquanto capitalizando sobre a infra-estrutura pré-estabelecida.

Introdução

imunoensaios de sanduíche típicos indirectamente detectar a presença de um antigénio utilizando dois anticorpos. O anticorpo de captura está ligada a uma superfície sólida e forma um complexo anticorpo-antigénio quando em proximidade com um antigénio apropriado. Um anticorpo de detecção é então introduzida e liga-se ao antigénio. Após a lavagem, o anticorpo / antigénio / anticorpo e continua a ser complexo é detectada pelo anticorpo de detecção marcado, como demonstrado na Figura 1A. Detecção típica é feita por um detector fluorescente ou colorimétrico, o que limita a multiplexagem 10 substância a analisar devido aos picos largos espectrais ^2,3. Em contraste, os sistemas baseados em Raman têm picos de emissão muito estreitos, resultando em capacidades de multiplexação reforçadas com fontes que reivindicam a detecção simultânea de até 100 analitos ^2,3.

Muitas fontes bibliográficas estão disponíveis, que abrangem aspectos importantes relacionados com imunoensaios ^4-6, como passo-a-passodetalhes para criar kits personalizados ELISA. Infelizmente, estes protocolos são para a detecção fluorescente ou colorimétrico, limitando a capacidade de multiplexação de imunoensaios personalizadas. Para atender a essa necessidade, apresentamos um procedimento detalhado para fabricar o UV-Vis / Raman imunoensaio publicado anteriormente ⁷ para um imunoensaio directo conforme ilustrado na figura 1B.

Este protocolo inclui a fabricação de sondas de nanopartulas de ouro baseia-funcionalizado, ilustrada na Figura 2. O procedimento para fazer as sondas / UV-Vis Raman começa pela ligação repórteres Raman para a superfície de nanopartículas de ouro (AuNPs). Os AuNPs são depois funcionalizadas com anticorpos que estão associadas com polietileno glicol (PEG). Os restantes locais de ligação no AuNPs são bloqueadas por ligação tiol metoxi polietileno glicol (mPEG-SH) para AuNPs para evitar a ligação não-específica subsequente durante a análise. As sondas AUNP preparadas são testada por ligação a antigéniosfixa-se aos poços de uma placa de poliestireno, tal como ilustrado na Figura 1B. Após lavagem da placa, as sondas AUNP são detectados utilizando espectroscopia de UV-Vis, enquanto os repórteres Raman associados são detectados com espectroscopia de Raman. Combinando os dados UV-Vis e Raman espectral fornece dois métodos de análise, reforçando as capacidades deste imunoensaio.

Protocolo

1. Preparação de buffers

1. Tampão fosfato salino (PBS)
   1. Dilui-se 50 ml de 10x PBS com 450 mL de água de grau HPLC para fazer uma concentração de 1 x PBS. Filtrar em condições estéreis a solução com um filtro de 0,22 um.
   2. Guardar a solução à temperatura ambiente.
2. Preparação de solução salina tamponada TRIS + Tween 20 (TBST)
   1. Dilui-se 50 ml de 10x tampão salino Tris (TBS) com 450 ml de água de grau HPLC para fazer uma concentração 1x. Adicionar 250 ul de Tween-20 para uma 0,05% (v / v) de Tween-20. Filtrar em condições estéreis a solução com um filtro de 0,22 um.
   2. Armazenar em temperatura ambiente.
3. Preparação de Albumina de Soro Humano (HSA) solução de bloqueio
   1. Pesar 0,45 g de HSA em 15 ml de PBS estéril filtrada 1x para fazer um 3% w / v de solução de HSA. solução de HSA Vortex até estar completamente dissolvido.
   2. Loja solução de HSA a 4 ° C.
      NOTA: Albumina de Soro Bovino(BSA) também pode ser usado como uma solução de bloqueio.
4. Preparação de anticorpo PEGuilado (PEG-Ab)
   NOTA: A solução de anticorpo deve ser isento de transportador ou de estabilização de proteínas, tais como BSA, que possam interferir com reacções de conjugação competindo para o n-hidroxissulf (NHS) sítios de ligação. Se o anticorpo entra em uma solução de Tris ou tampão de glicina, ela deve ser submetida a uma permuta de tampão para evitar que as aminas ou sais de amónio de interferir com a reacção de conjugação NHS. Se o anticorpo está numa forma liofilizada, que pode ser novamente suspenso de acordo com a recomendação do fabricante, a uma concentração de 1-10 mg / ml.
   1. Para os anticorpos em um tampão Tris ou glicina, realizar uma permuta de tampão de bicarbonato de sódio a 100 mM usando uma coluna de dessalinização. Utilizar o tampão 100 mM para aumentar o pH para aproximadamente 8,5 a acelerar a reacção de conjugação.
   2. Hidrato de orto-piridildissulfureto-PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS) com 100 mM soídio bicarbonato para um volume de 1 ml a uma concentração de 1 mg / ml ou maior.
      NOTA: OPSS-PEG-NHS deve ser feita e usada dentro de aproximadamente 20 min. O grupo NHS do OPSS-PEG-NHS tem uma meia-vida de aproximadamente 20 min, numa solução aquosa a pH 8,5.
   3. Adicionar OPSS-PEG-NHS para a solução de anticorpo a uma proporção 2: 1 (PEG: Anticorpo) proporção de conjugação para ser utilizado para as amostras de teste. Num tubo de microcentrífuga separados, adicionar OPSS-PEG-NHS para a solução de antigénio numa proporção de 2: 1 a conjugação a ser utilizado para o controlo.
      NOTA: A proporção de 2: 1 está assumindo uma eficiência de 50% a conjugação. O objectivo é o de identificar cada anticorpo com uma cadeia de PEG. Nesta etapa, o excesso de rotulagem é melhor do que sob a rotulagem. Utilize a seguinte equação para determinar os volumes apropriados de OPSS-PEG-NHS e solução de anticorpo:
      
      em que V é o volume, C é a concentração expressa em moléculas ou umtibodies por ml. Subscritos PEG e Ab são OPSS-PEG-NHS e anticorpo, respectivamente. O volume final deve ser de aproximadamente 250 ul.
   4. Incubar solução de PEG-Ab a 4 ° C durante 8 horas ou durante a noite. solução de loja em alíquotas de aproximadamente 25 ul trabalhando a -20 ° C para limitar os ciclos de descongelamento congelamento e certifique-se de usar tubos de ligação baixas.

2. Prepare UV-Vis / Raman Sondas

1. Preparar a solução AUNP nua
   1. Prepara-se uma solução de AuNPs 2 ml com uma concentração de aproximadamente 1 x 10 ¹¹ partículas por ml.
      1. Se os AuNPs precisa de ser concentrada, encher tubos de centrifugação de baixa ligação com 2.000 ul de estoque AUNP e centrifugar a 5000 xg durante 20 minutos ou até que o sobrenadante é clara. Retire o sobrenadante por pipetagem, tomando cuidado para não perturbar o pellet AUNP.
      2. Juntar as soluções AUNP restantes em um tubo e estimar a Concentração mediante a obtenção de uma medição de UV-Vis e comparando os valores de concentrações conhecidas como esta é uma relação linear.
2. Determinar a proporção rotulagem repórter adequado Raman
   1. Preparar uma solução de trabalho do repórter de Raman dissolvido em metanol. Esta concentração irá ser dependente do repórter utilizada. Neste trabalho, preparar iodeto de 3,3'-diethylthiatricarbocyanine (DTTC) a uma solução de trabalho de 200? M.
   2. Assumindo um volume final de 100 uL de cada poço, adicione uma quantidade de solução de trabalho repórter a cada cavidade da primeira fileira de uma placa de 96 poços de modo a que o repórter Raman irá variar em concentrações de 0,2 uM a 10 uM. Adicionar água suficiente qualidade para HPLC a cada cavidade tal que o volume é de 80 ul. Adicionar 20 ul de cada poço AUNP para fazer um volume final de 100? L para cada cavidade. Um exemplo é apresentado na Tabela 1.
   3. Medir a espectros UV-Vis a partir de 400 a700 nm utilizando uma placa de leitura de UV-Vis. A concentração adequada é a concentração mais elevada com picos definidos para os espectros de UV-Vis. Repita o passo 2.2.2 em concentrações crescentes até o mais alto índice de concentração de repórteres Raman para AuNPs é encontrado.
      NOTA: O corante e o AUNP forma, tamanho, e fabricante influenciar a concentração apropriada. Por conseguinte, os passos indicados devem ser avaliados e alterada, dependendo dos componentes usados. Este protocolo envolve a utilização de um corante com carga positiva. Como tal, a ligação entre o AUNP e repórter foi melhorada através da utilização AuNPs carregados negativamente. Isso foi feito através da utilização de citrato tampado AuNPs. Consulte a seção de discussão para mais detalhes.
3. Encadernação repórter Raman e PEG-Ab para AUNP
   1. Preparar dois lotes de 1,5 ml AUNP repórter e Raman, na concentração previamente determinada, permitindo que o repórter Raman para se ligar aos AuNPs durante 30 min à temperatura ambiente.
   2. Adicionar o anticorpo PEGuilado (PEG-Ab) para um lote de solução repórter AUNP e Raman para criar um 200: 1 razão de anticorpos às partículas. Esta solução será para as amostras de teste. Num tubo de microcentrífuga separados, adicionar o antigénio PEGuilado para o outro lote da solução repórter AUNP e Raman de cada 200: 1 razão de anticorpo de partículas para ser utilizado como o controlo. Incubam-se as soluções durante 30 minutos a temperatura ambiente.
      NOTA: O rácio de anticorpos às partículas serão específicos para os AuNPs e corante utilizado e deve ser optimizada para cada caso individual. O objectivo aqui é o de ter a maior proporção de anticorpos para as sondas AUNP para se ligar a, evitando a agregação das partículas. Use a seguinte equação para determinar os volumes apropriados para adicionar juntos:
      
      em que V é o volume, C é a concentração expressa em partículas ou anticorpos por ml. a barbatanavolume de al deve ser de aproximadamente 1,5 ml.
4. Bloco restantes locais na superfície da AUNP com mPEG-SH.
   1. Prepare mPEG-SH por dissolução de sólido metoxi polietileno glicol tiol a uma concentração de 200 pM utilizando água. Vortex a solução até mPEG-SH está completamente dissolvido.
   2. Adicionar mPEG-SH num 40.000: 1 razão para a solução AUNP-PEG-Ab feita no passo 2.3. Incubar a solução à temperatura ambiente durante 10 minutos para assegurar que os locais remanescentes no nanopartículas de ouro são bloqueados. Use a seguinte equação para determinar os volumes apropriados para adicionar juntos:
      
      em que V é o volume, C é a concentração expressa em partículas ou anticorpos por ml. O volume final deve ser de aproximadamente 1,5 ml.
5. Recuperar sondas Raman funcionalizados.
   1. partículas de centrifugar a 5000 xg durante 20 minutos em baixa de ligação centrifuge tubos ou até que o sobrenadante é clara. Retire o sobrenadante por pipetagem tomando cuidado para não perturbar os AuNPs.
   2. Ressuspender as partículas com 1 ml de solução de PBS 1x que foi feita previamente. Estimar a concentração AUNP por uma medição de UV-Vis de um pequeno volume de solução (3 mL) e comparar os resultados com as medições de concentração AUNP conhecido. Ajustar o volume de tal modo que a solução final é de pelo menos 1 x 10 ¹¹ partículas por ml.
   3. soluções armazenar a 4 ° C até que seja utilizado para a funcionalização da placa de imunoensaio. Use as soluções dentro de uma semana.

	Volumes a adicionar de cada componente (ml)
DCTC concentração final (mM)	Solução de trabalho de DTTC (200 mM)	AUNP	água
0,2	0,1	20	79,9
0,6	0,3	20	79,7
1	0,5	20	79,5
2	1.0	20	79
5	2.5	20	77,5
7	3,5	20	76,5
10	5	20	75

Tabela 1. DCTC exemplo diluição. Várias diluições de DCTC e os volumes associados de estoque DCTC, solução de nanopartículas de ouro e água.

3. Imunoensaio placa preparação

1. Ligar o antigénio desejado para a placa de imunoensaio.
   1. Prepare antigénio diluído suficiente (50 ug / ml) para encher os poços de poliestireno. Vortex a solução,e adicione imediatamente a solução para os poços da placa. Permitir que o antigénio para se ligar às placas durante 1 hora à temperatura ambiente.
2. Lavar antígenos não ligados.
   1. Remover a solução com excesso de antigénio pelo dumping solução em um recipiente adequado e batendo a placa contra uma mesa de papel-coberto de toalha.
   2. Adicionar TBST aos poços para lavar a superfície, em seguida, remover a lavagem da mesma maneira como indicado previamente. Repita este passo mais duas vezes.
3. Bloco restantes locais de ligação na placa para evitar a ligação não específica.
   1. Adicionar 70 ul de solução de bloqueio de HSA a cada poço da placa e incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
   2. Remover e lavar a placa usando o mesmo procedimento, tal como especificado no passo 3.2. Cobrir a placa e seco para guardar a 4 ° C até que esteja pronto para uso posterior.
4. Funcionalizar placa de imunoensaio.
   1. Adicionar 70 ul de tele sondar nanopartículas preparada na secção 2 para a primeira coluna de uma placa de 96 poços e diluir colunas subsequentes usando uma diluição de 1: 2 em série. Permitir que a placa a incubar durante pelo menos 1 h. Um exemplo de como preparar a placa de imunoensaio é dada na Figura 3.
   2. Lavar a placa com TBST cinco vezes, conforme detalhado nas etapas 3.2, certificando-se de dispor dos AuNPs adequadamente. Após a lavagem final, adicionar 70 ul de 1x PBS a cada poço e cobrir com um selo de placa.
      NOTA: As amostras de controlo deve ser clara. Se tiver ocorrido a ligação não específica, as amostras de controlo terá uma cor semelhante à das amostras de ensaio.
5. Teste de sensibilidade do ensaio por UV-Vis e espectroscopia Raman.
   1. Para cada poço, medir o espectro de UV-Vis que varia de 400 a 700 nm utilizando uma placa de leitura de UV-Vis.
   2. Utilizando um microscópio invertido de Raman, concentrar o objectivo para a superfície do poço que tem as sondas AUNP. obtain um espectro de Raman do bem. Recolhe um espectro variando de 1.800 ^cm-1 e 400 ^cm-1. Repita este passo para todos os poços.
   3. Usando um software de espectro adequado, executar uma ordem de correção de linha de base polinomial 11 ^th para os espectros Raman e uma polinomial ^{de 3ª} ordem para o UV-Vis.
   4. Usando um software de espectro adequado, normalizar o Raman e UV-Vis. Defina o valor máximo a 1 e escalar todos os outros valores em conformidade. Para normalizar os espectros Raman, selecione um pico de poliestireno única e defini-lo igual a 1 e escalar todos os outros valores em conformidade.
   5. Usando um software de espectro adequado, realizar a integração de pico para cada espectro. Para espectros de Raman, o pico representando o repórter Raman deve estar ausente numa região de picos de poliestireno. Para realizar a integração de pico, especifique os limites integrais para o pico desejado e gravar a área do pico desejado para todas as amostras, incluindo os controles.
   6. Plot a área média de pico de interesse como uma função do log da concentração AUNP com barras de erro para cada ponto indicando o seu desvio padrão associado. Encaixe estes pontos de calibração para uma curva logística de 4 parâmetros.
   7. Determinar o valor médio da peça em bruto através da média da área do pico de interesse para uma amostra em branco. Determinar o desvio padrão destas áreas; este é o desvio padrão da peça em bruto.
   8. Para o mesmo pico analisados ​​na etapa anterior, encontrar o desvio padrão do que a área de pico para a concentração mais baixa.
   9. Calcular o limite do limite branco e inferior de detecção, conforme especificado na seção de resultados Representante. Use esses valores com as curvas de calibragem 4PL para determinar a LLOD em termos de concentração AUNP.

Resultados

Neste estudo, 60 nm de partículas de ouro foram utilizados para a espectroscopia UV-Vis. UV-Vis espectros de absorção de 400 a 700 nm foram recolhidos e as áreas dos picos correspondentes a cada concentração AUNP foram determinados utilizando um software de análise espectral de fonte aberta ^8. Antes de se atingir o pico de integração, os espectros recolhidos foram submetidos a correcção da linha de base utilizando um ajuste polinomial de três pontos. As áreas de pico foram usadas para gerar uma c...

Discussão

No protocolo detalhado, existem vários pontos críticos para tratar. Uma questão é a escolha do repórter Raman e nanopartículas de ouro. Embora o protocolo foi escrito para ser adaptado para o uso individual, a Raman DCTC repórter foi utilizada como um exemplo. DTTC é um repórter carregado positivamente e se liga a superfícies tais como citrato tampado AuNPs carregado negativamente. Este protocolo pode ser adaptado para repórteres negativamente carregados usando nanopartículas de ouro com uma carga de superf?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 nm Gold Nanoparticle	Ted Pella, Inc.	15708-6	These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter.
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Methanol	Pharmco-Aaper	339000000
Tris Buffered Saline (10x) pH 7.5	Scy Tek	TBD999
Bottle Top Filtration Unit	VWR	97066-202
Tween 20 (polysorbate 20)	Scy Tek	TWN500	Used as an emulsifying agent for washing steps.
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate, pH 7.4	Scy Tek	PBD999
Protein LoBind Tube 2.0 ml	Eppendorf Tubes	22431102	LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes.
Protein LoBind Tube 0.5 ml	Eppendorf Tubes	22431064	LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes.
Microplate Devices UniSeal	GE Healthcare	7704-0001	Used for sealing and storing functionalized plates.
Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom	Costar	3370
HPLC grade water	Sigma Aldrich	270733-4L
3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC)	Sigma Aldrich	381306-250MG	Raman reporter
mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 gram	Laysan Bio, Inc.	MPEG-SH-5000-1g
OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 - 1 gram	Laysan Bio, Inc.	OPSS-PEG-SVA-5000-1g	OPSS-PEG-SVA has an NHS end.
Mouse IgG, Whole Molecule Control	Thermo Fisher Scientific	31903	Antigen
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody	Thermo Fisher Scientific	31164	Antibody
Human Serum Albumin Blocking Solution	Sigma Aldrich	A1887-1G	Bovine serum albumin can be used instead.
Mini Centrifuge	Fisher Schientific	12-006-900
UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 2000c
UV-Vis Spectrophotometer	BioTek	Synergy 2
Desalting Columns	Thermor Scientific	87766
In-house built 785 nm inverted Raman microscope unit	N/A	N/A	An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used.