Visualizando os Efeitos de escarro no desenvolvimento de biofilmes usando um modelo Chambered lamela

Resumo

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Resumo

Os biofilmes consistem de grupos de bactérias embebidas em uma matriz auto-secretado. Eles desempenham um papel importante na contaminação industrial, bem como no desenvolvimento e persistência de muitas infecções relacionadas com a saúde. Um dos biofilmes mais bem descrita e estudada em doenças humanas ocorre na infecção pulmonar crónica de pacientes com fibrose cística. Ao estudar biofilmes no contexto do hospedeiro, muitos factores que podem influenciar a formação e desenvolvimento de biofilme. A fim de identificar como factores do hospedeiro pode afetar a formação de biofilme e desenvolvimento, foi utilizado um método lamela chambered estática para crescer biofilmes na presença de fatores derivados do hospedeiro na forma de sobrenadantes de escarro. As bactérias são semeadas em câmaras e expostos a filtrados de expectoração. Na sequência de 48 horas de crescimento, os biofilmes estão manchadas com um kit de viabilidade de biofilme comercial antes da microscopia confocal e análise. Após a aquisição das imagens, as propriedades do biofilme pode ser avaliada através de diferentes plataformas de software.Este método nos permite visualizar as propriedades fundamentais do crescimento do biofilme na presença de diferentes substâncias, incluindo antibióticos.

Introdução

biofilmes bacterianas são grupos de microrganismos que estão ligados uns aos outros e incorporados numa matriz auto-secretado. ^1,2 Classicamente, eles representam bactérias fisicamente ligados a uma superfície abiótica ou biótico formado sob condições de fluxo. Os biofilmes também têm sido mostrados para crescer em condições estáticas (ausência de fluxo) e distal de superfícies, tais como na interface ar-líquido de piscinas termais ou películas formadas nos tubos de ensaio. Estes biofilmes têm sido reconhecidos no meio ambiente e são um grande prejuízo para processos industriais, como eles podem se formar em reservatórios de água ou em tubos, resultando em biofouling, corrosão e entupimentos. ^3,4

Os biofilmes também são críticas em ambientes de cuidados de saúde, como têm sido mostrado estar envolvidas em infecções relacionadas com cateteres, infecções pulmonares em doentes com fibrose cística, bem como em numerosas outras infecções. ^5,6 Uma das marcas de infecções biofilme é a devincado susceptibilidade das bactérias aos antibióticos e auditivos depuração pelo sistema imune inato. ^7-9 O mais bem estudadas, cenários clinicamente relevantes envolvendo infecção baseada biofilme ocorre em pacientes com fibrose cística (FC), que estão cronicamente infectados com biofilmes de Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa podem ser submetidos a uma série de alterações durante o estabelecimento da infecção crónica que tornam muito difíceis de tratar. ^10,11 biofilmes pode diferencialmente ativar a imunidade inata e conduzir a inflamação. ^12-14 Como estas infecções levar ao aumento da morbidade e mortalidade em pacientes com FC, é crucial para entender fatores que podem afetar o desenvolvimento do biofilme neste contexto.

Um estudo recente sugere que hospedeiras-factores são importantes na formação de agregados de biofilme de P. aeruginosa. ¹⁵ Estes biofilmes contribuir para a redução da susceptibilidade aos antibióticos e os mecanismos de defesa do hospedeiro. o preseNCE de factores derivados do hospedeiro, tais como a elastase de neutrófilos, assim como produtos secretados a partir de microrganismos presentes no pulmão CF, tem o potencial de modular significativamente a formação de biofilme e de desenvolvimento. ¹⁶ Além disso, os biofilmes interagir com o hospedeiro para modular a expressão de numerosos caminhos e iniciar a inflamação. Enquanto os métodos de alto rendimento, tal como o ensaio de violeta de cristal padrão, podem fornecer alguma informação no que diz respeito ao processo de biofilme, a visualização do biofilme em resposta a estes factores proporcionam mais informação em profundidade.

Nesse artigo, nós descrevemos um método para a utilização de factores de expectoração de pacientes com FC para estudar o desenvolvimento de biofilmes in vitro. Este método permite a rápida visualização de biofilme expostos a expectoração contendo factores do hospedeiro, utilizando um kit comercial viabilidade do biofilme. Esta técnica pode ser usada para identificar visualmente as alterações que ocorrem durante o crescimento de biofilme, na presença de exógenonos produtos, e representa um método melhorado para analisar as alterações no desenvolvimento de biofilme sob várias condições.

Protocolo

Note-se que Conselho de Ética em Pesquisa (REB) é necessário para coletar e armazenar amostras de escarro de seres humanos. Esses estudos foram aprovados pelo Hospital para Crianças Doentes REB # 1000019444.

1. preparação de amostras de expectoração CF

1. Recolher amostra de escarro de pacientes durante as visitas de rotina à clínica fibrose cística e manter em gelo.
2. Transporte de amostra de escarro no gelo dentro da primeira hora da coleta, para o laboratório de pesquisa, submeter-se a tratamento.

2. escarro Processing

1. Registrar o volume da amostra de expectoração obtidos. Adicionar salina tamponada com fosfato (PBS) para 2x o volume da amostra (isto é, 2 partes de PBS, uma parte de amostra).
2. Misturar a amostra bem com uma pipeta de transferência. Vortex da amostra na potência máxima por 1 min para misturar completamente.
3. Aliquota de 1 ml da mistura acima referida sobre o número 1,5 ml tubos de microcentrífuga adequadas e girar a 5000 xg durante20 min a 4 ° C.
4. A seguir à centrifugação, o sobrenadante remover e descartar o sedimento.
5. Filtrar esterilizar o sobrenadante através de um filtro de 0,22? M e recolher num tubo de microcentrífuga limpo.
   NOTA: A esterilidade do filtrado é testado por plaqueamento em LB agar e inocular meio líquido.
6. Armazenar o sobrenadante expectoração a -80 ° C para uso futuro.
   NOTA: O escarro de vários pacientes também podem ser agrupados seguindo filtração.
7. Antes de utilizar, dilui-se expectoração filtrado 10/1 v / v (100 ul de expectoração, a 900 ul de meio), em meio desejado.
   NOTA: Aqui, foi utilizado caldo lysogeny padrão (LB) de mídia.

3. Chambered Método lamela para formação de biofilme

1. Cresça isolado bacteriano de interesse durante a noite em meio desejado a 37 ° C com agitação (200 rpm).
   Nota: Um número de bactérias diferentes foram usados, incluindo isolados clínicos Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Complexo Burkholderia cepacia e Achromobacter xylosoxidans. Escolha dos meios depende tensões e condições de interesse, no entanto meio LB podem ser utilizados em experiências iniciais.
2. A partir da cultura durante a noite, colocar 40 mL de cultura em 4 ml de meio fresco e crescer durante 3-4 horas a 37 ° C com agitação (200 rpm) para se obter uma cultura com uma densidade óptica a 600 nm _(OD600) de cerca de 0,5 -0.6.
3. Dilui-se a cultura a partir do passo 3.2 a 1/5 na mídia desejada com 10% filtrado escarro ou sem filtrado escarro (como controle). Outros concentração do filtrado expectoração pode ser testado (isto é, 50% ou 100%).
4. Utilizar 200 ul da diluição para semear poços das câmaras de deslizamento.
5. Permitir que as bactérias aderir durante 4 h a 37 ° C sem agitação.
6. Após 4 horas, remova a mídia e lavar cuidadosamente o biofilme por meio fresco 1x. Substitua por 200 mL de mídia fresco.
   NOTA: Para estudar os efeitos do escarro no biofilme, os fresh mídia deve conter escarro sobrenadante.
7. Permitir biofilmes a crescer para a quantidade desejada de tempo a 37 ° C sem agitação, substituindo todos os meios de comunicação 12 horas, sem a lavagem até que o tempo para microscopia.
   NOTA: Para estudar o efeito de sobrenadantes de escarro na susceptibilidade aos antibióticos biofilme, os antibióticos são adicionados à mídia após 24 horas de crescimento do biofilme e são mantidos nos meios de comunicação até a coloração e imagens de biofilmes.

4. Os biofilmes de coloração e microscopia confocal

1. Seguindo tempo de crescimento desejado (24-48 h, funciona melhor), remova a mídia de poços de câmara e lavar cuidadosamente cada câmara duas vezes com 300 ul de PBS estéril.
2. Prepare a mistura de coloração de biofilme por mistura de 1 mL de cada corante (fornecido no kit de viabilidade) por cada ml de solução necessário. Fazer a tintura em água ou meios solução.
   NOTA: A água é recomendado pelo fabricante.
3. Adicionar 200 ul de mistura de corante a cada cavidade de covergla septadasSS e incubar à temperatura ambiente, no escuro, durante 45 min.
4. Remover mistura de coloração das câmaras e lavagem de cada poço com 300 ul de PBS estéril. Remover PBS e substituir com água doce ou de mídia.
5. Proceda com visualização de biofilme através de microscopia confocal.

5. Visualizando biofilmes com microscopia confocal

1. Leia biofilmes manchado em câmaras imediatamente após a coloração (dentro de 1 hora). Minimizar atraso na visualização das lâminas por coloração de 1 a 2 câmaras de 8 poços de cada vez.
2. Realizar imagem usando microscópio confocal com lasers para excitação e filtros de conjuntos para a aquisição.
   NOTA: Aqui, o sistema confocal disco giratório com lasers borealis espectrais (verde: 491nm, Vermelho: 561 nm) foram utilizados para a excitação. conjuntos de filtros de emissão de 515/40 e 624/40 foram usadas para visualizar as manchas do kit de viabilidade do biofilme.
3. Captar imagens utilizando uma objectiva de água 25X no microscópio confocal com câmera.
4. Use Z-Pilhas para modelar o biofilme. Captar imagens a cada 0,5-1 mm a partir do primeiro plano em foco para o último quadro em foco do biofilme (tipicamente abrangendo 30-80 mm para 48 biofilmes hr)
5. Tome 3-5 imagens de cada poço.
   NOTA: Assim, para um 8 lamela bem câmaras, serão gerados 24-40 imagens.
6. Salvar imagens para análise.
   NOTA: As imagens devem ser salvas como arquivos OME-TIFF a ser analisado usando COMSTAT ^18,19. Instruções para a análise de imagem do biofilme pode ser encontrada em http://www.comstat.dk/. Uma vez que as imagens são importadas, parâmetros como a espessura média, biomassa e cobertura de superfície para cada canal (vermelho e verde) podem ser analisados.

Resultados

A concepção geral da experiência está representada na Figura 1. A utilização deste protocolo fornece um método conveniente para visualizar as alterações em biofilmes cultivadas por diferentes períodos de tempo (por exemplo, 24, 48 ou 72 horas). Importante, sinais exógenos, tais como expectoração filtrados, pode ser adicionado para visualizar as alterações no desenvolvimento de biofilme. Como pode ser visto na Figura 2, a presença...

Discussão

Os métodos aqui descritos permitem a visualização de biofilmes bacterianas cultivadas na presença de produtos exógenos. Não surpreendentemente, a produção dos exoproducts é de importância quando se utiliza este tipo de sistema. Por exemplo, ditiotreitol (DTT), é frequentemente utilizado em amostras de saliva humana para ajudar a liquefazer as amostras. No entanto, o efeito do DTT sozinho pode diminuir o desenvolvimento do biofilme e a viabilidade (dados não mostrados). Assim, controles adequados para todas a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit	Thermo Fisher Scientific	L10316
Blood agar plates	Thermo Fisher Scientific	R10215	Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTAT	Availble software online		COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standard media for overnight gowth/biofilm growth
Millex-GV Syringe Filters	Millipore	SLGV013SL	Filtering of sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Washing of biofilm chambers after media removal
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf