Tratamento de drogas e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Osteoblast-osteoclastos Interações em um modelo de Medaka Peixe Osteoporose

Resumo

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Resumo

Osso formando osteoblastos interagir com osteoclastos de reabsorção óssea para coordenar o volume de negócios da matriz óssea e para controlar a homeostase esquelética. Medaka e larvas de peixe-zebra são amplamente usadas para analisar o comportamento de células de osso durante a formação óssea, a degeneração, e reparação. A sua clareza óptica permite a visualização das células ósseas marcado fluorescentemente e corantes fluorescentes ligados à matriz óssea mineralizada. O nosso laboratório tem gerado Medaka peixes transgénicos que expressam o factor de indução de osteoclastos Activador do Receptor de factor nuclear kB-ligando (RANKL), sob o controlo de um promotor induzível de choque de calor. A expressão ectópica de RANKL resulta na formação de excesso de osteoclastos activados, que podem ser visualizados em linhas com expressão repórter nlGFP sob o controlo do promotor K (CTSK) catepsina. indução RANKL e formação de osteoclastos ectópica leva a fenótipos osteoporose-like graves. Composto li medaka transgênicones que expressam CTSK: nlGFP em osteoclastos, assim como mCherry sob o controlo do osterix (OSX) promotor em osteoblastos prematuros, pode ser utilizado para estudar a interacção de ambos os tipos de células. Isto facilita a observação in vivo do comportamento celular sob condições de degeneração óssea e de reparação. Aqui, nós descrevemos a utilização deste sistema para testar um fármaco utilizada em terapia de osteoporose humana e descrever um protocolo de imagens ao vivo. O modelo Medaka complementa os estudos em cultura de células e ratinhos, e oferece um novo sistema para a análise in vivo da acção do fármaco no sistema esquelético.

Introdução

O esqueleto dos vertebrados proporciona um suporte estrutural e a protecção de órgãos, permite a mobilidade, e serve como uma fonte de cálcio. Ao longo da vida, a matriz óssea extracelular é continuamente virado para manter a estabilidade óssea e rigidez. Este processo requer a actividade fortemente coordenada e interacção de osteoblastos de formação óssea e os osteoclastos de reabsorção óssea. Os osteoblastos são derivados de células progenitoras mesenquimais multipotentes e produzir colagénio para formar o osteóide, a parte proteica da matriz óssea ^10. Os osteoblastos interagir com osteoclastos para alcançar uma actividade equilibrada de ambos os tipos de células, que é necessária para controlar a homeostase óssea ^7. Devido a essas interações reguladoras complexas, as respostas ao tratamento medicamentoso e homeostase óssea não pode ser plenamente examinadas usando estudos in vitro. Deste modo, existe uma forte procura de modelos animais. Em comparação com as configurações de cultura de células, em modelos in vivo pode fornecerinsights valiosos sobre as redes multicelulares dentro do ambiente de osso.

Numerosos modelos de ratinho para existir uma variedade de perturbações ósseas, incluindo osteoporose humanos ^16. No entanto, o tamanho ea acessibilidade de embriões de camundongos representam limitações significativas para geração de imagens ao vivo de processos esqueléticos. Peixes teleósteos pequeno, por outro lado, servir como uma alternativa atraente para imagiologia in vivo. Peixe-zebra (Danio rerio) e medaka (Oryzias latipes) tornaram-se modelos animais populares para pesquisa esquelética durante as últimas duas décadas ^{17, 19, 22, 24.} Osso em peixes teleósteos e em mamíferos é muito semelhante, tanto em um estrutural como a nível fisiológico, e muitos dos genes reguladores-chave e as vias de sinalização são conservados ^3. Como em mamíferos, peixes teleósteos regular cuidadosamente a actividade dos osteoblastos e osteoclastos para equilibrar a formação óssea e reabsorção ^26. Mais importante ainda, a clareza óptica de fiSH larvas permite o uso de repórteres fluorescentes para marcar células ósseas e a matriz calcificada esquelético ^{8, 9, 12, 21, 23,} o que facilita a observação de processos celulares em animais vivos. Além disso, uma série de ferramentas genéticas foi gerado para facilitar a pesquisa biomedicamente relevante em peixes. Para medaka em particular, métodos para mutação do gene alvo de CRISPR / Cas9 ^2, rastreamento ^{de 6} células de linhagem, e site-specific transgênese ¹⁴ foram recentemente estabelecidas e são agora amplamente em uso ^15.

Larvas teleósteos pequena têm sido usadas com sucesso para as telas de químicos, o que levou à descoberta de várias drogas farmacologicamente relevantes ^{1, 18.}

Larvas de peixes são tolerantes a baixas concentrações de DMSO e são capazes de absorver compostos de seu ambiente aquático, através da pele ou através do tracto gastrointestinal ^{de 1, 5.} Nosso laboratório anteriormente reported medaka linhas transgénicas que expressam repórteres fluorescentes em células ósseas, sob o controlo de vários osteoblast- e promotores específicos de osteoclastos. Estes incluem osteoblastos prematuros (colágeno 10A1, col10a1; osterix, OSX) ^{20, 21,} osteoblastos maduros (osteocalcina, OSC) ^27, e osteoclastos (catepsina K, CTSK) ^24. Nós também gerou uma linha transgénica que expressa o factor de indução de osteoclastos Activador do Receptor de factor nuclear kB-ligando (RANKL), sob o controlo de um promotor induzível por choque ^térmico-24.

Indução de RANKL neste sistema resulta na formação ectópica de osteoclastos activos. Isto leva a um aumento da reabsorção óssea e um fenótipo semelhante a osteoporose grave, com mineralização drasticamente reduzida nos corpos vertebrais. Recentemente, mostrou que a actividade dos osteoclastos neste modelo pode ser bloqueada pelo etidronato bisfosfonatos e alendronato, TWO drogas comumente usadas no tratamento da osteoporose humana, validando assim medaka como um sistema modelo adequado para a osteoporose ^27.

Devido ao seu grande tamanho de ninhada, o rápido desenvolvimento, e pequeno tamanho de embriões, larvas Medaka transgénicos são exclusivamente adequados para o rastreio em larga escala de drogas da osteoporose e para a análise in vivo de comportamento de células ósseas. Estudos em medaka, portanto, pode eficientemente complementar experiências em culturas de células e em camundongos que visam a descoberta de novos alvos terapêuticos e novas terapias para doenças ósseas humanas.

No presente estudo, nós descrevemos um protocolo para tratar larvas osso repórter medaka com a droga osteoporose comum, o alendronato. Nós também descrevem em detalhes como larvas tratadas estão montados e preparados para a imagens ao vivo da matriz óssea e células ósseas. Estes protocolos podem ser facilmente adaptada a outros compostos químicos pequenos, que tanto trabalho como anabolizante do tecido ósseo ou drogas anti-reabsorção.

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Protocolo

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) da Universidade Nacional de Cingapura (R14-293).

1. Os peixes Pecuária e à colheita de embriões

1. Levante WT, CTSK: nlGFP ^24, RANKL: HSE: PCP ^24, e OSX: mCherry ²¹ simples ou peixe medaka composto transgénico a 26 ° C sob um ciclo de luz controlada (14 h de luz, 10 h escuro) para induzir a desova.
2. desova diária ocorre durante os primeiros 30 minutos após a luz é ligado. Os ovos ficar juntos através de filamentos e anexar ao abdômen da fêmea por várias horas. Use uma rede de malha fina para pegar uma fêmea adulta que transporta um conjunto de ovo. Deixe o peixe descansar brevemente na rede e, em seguida, massageie suavemente o abdômen do peixe para retirar cuidadosamente o cluster óvulo fertilizado do abdome da fêmea.
   NOTA: Uma fêmea medaka saudávelpode produzir 10 - 20 ovos por dia durante cerca de 5 meses.
3. Coloque os ovos em uma 60 mm plástico placa de Petri. Usar uma pipeta de plástico para lavar os embriões com 5-10 ml de de 0,3x Danieau forma de solução (peixe; NaCl 19,3 mM, KCl 0,23 mM, _MgSO4 0,13 mM, Ca 0,2 mM (NO _{3) 2,} e 1,7 mM de HEPES, pH 7.0). Adicionar 1 ml de uma 0,25% (w / v) de solução azul de metileno estoque para 2,5 L de meio de peixes para prevenir o crescimento de fungos.
4. Rode ligeiramente aglomerado de ovo para formar um nó de filamentos de fixação. Use uma pinça para remover cuidadosamente os filamentos de fixação dos aglomerados de ovos fertilizados para obter embriões individuais (Figura 1A).
5. Estágio os embriões de acordo com Iwamatsu 2004 ^13.
6. Cultura 20 - 30 embriões por 60 milímetros de plástico em placas de Petri de 28 ° C incubadora. Alterar a média diária para assegurar o desenvolvimento normal dos embriões.
   NOTA: O tempo em volta do palco para incubação (8-9 d pós-fertilização,DPF) é especialmente crítica para a sobrevivência. Remover córions de livre flutuação para manter o meio limpo e para garantir boas taxas de sobrevivência das larvas.

2. Rastreio Embryo Transgenic

1. Use um estereomicroscópio equipado com uma lâmpada de mercúrio para imagens de fluorescência e GFP, RFP, e os filtros da PCP para a tela embriões transgênicos para a expressão repórter fluorescente utilizando 40X.
2. Identificar visualmente OSX: embriões mCherry por expressão repórter mCherry no início de formação de ossos cranianos, tais como o cleitro, em ambos os lados da cabeça posterior (Figura 1B, seta), e o parasphenoide, numa posição central no crânio ventral ( Figura 1B, cabeça de seta).
   NOTA: expressão Reporter começa a partir de 5 DPF em diante ^21.
3. Identificar CTSK: embriões nlGFP por expressão nlGFP forte na cabeça (Figura 1C, seta) e uma cauda (Figura 1C, seta), a partir de6 DPF.
   NOTA: osteoclastos endógenos formam apenas depois de 21 DPF. células neste estágio inicial (6 DPF) nlGFP expressando não são osteoclastos, mas outra, até agora não caracterizada, CTSK células -positivas ^24.
4. Identificar RANKL: HSE: PCP embriões transgénicos por expressão ubíqua PCP depois de um tratamento a curto choque térmico durante 20 min a 39 ° C, conduzida em duas DPF ou posterior para fins de rastreio.
   NOTA: A RANKL e PCP transgenes estão sob o controle do mesmo bidirecional Choque elemento térmico (HSE). Expressão PCP indica indução bem-sucedida RANKL ^24.
5. Executar uma 1,5-2 h tratamento de choque térmico a 9 DPF ou mais tarde, para induzir um grande número de osteoclastos ectópica na região do tronco, o que consequentemente resulta em um fenótipo osteoporose-like ^24.
   NOTA: expressão RANKL Transgenic induzida em 9 resultados da DPF em uma ativação ectópica de células progenitoras osteoclastos dormentes, que endogenamente não é acionadoantes de 21 de DPF. Usar um banho de água para se obter condições estáveis ​​a 39 ° C. Deixe as placas de Petri contendo embriões medaka flutuar na superfície da água. Certifique-se a tampa da placa de petri é seco, para impedir o afundamento do prato.
6. Embriões de tela de linhas compostas, tais como RANKL: HSE: PCP / CTSK: nlGFP double-transgênica e OSX: mCherry / RANKL: HSE: PCP / CTSK: nlGFP triple-transgênica, de acordo com o padrão de cada transgene indivíduo expressão.
   NOTA: embriões transgênicos hemizygous e homozigotos foram distinguidos por diferentes níveis de fluorescência do transgene repórter. embriões homozigóticos tinham uma intensidade de fluorescência que aproximadamente duplicou em comparação com a de transgênicos hemizigóticas. Linhas de compostos que eram homozigotos para ambos RANKL: HSE: PCP e CTSK: nlGFP foram obtidos por incrossing repetido ao longo de várias gerações. Para triple-transgênica OSX: mCherry / RANKL: HSE: PCP / CTSK: peixes nlGFP, RANKL homozigoto: HSE: PCP / CTSK: peixes nlGFP foram cruzados com OSX homozigoto: portadores mCherry. A progênie triple-transgênico heterozigoto resultante foram levantadas e incrossed obter embriões homozigotos para RANKL: HSE: PCP. O RANKL: HSE: PCP transgene deve ser homozigótica, a fim de obter a indução eficiente de osteoclastos ectópicas.

Figura 1: WT e Transgenic Medaka embriões em 7 D pós-fertilização (DPF). Uma. embriões WT observado com iluminação de campo claro. B. Embriões transgênicos mostrando OSX: Expressão mCherry em torno do cleithrum (seta) e paresfenóide (ponta de seta). C. Embriões transgênicos mostrando CTSK: Expressão nlGFP na cabeça (seta) ea cauda (ponta de seta). Barras de escala: 500 mm.025 / 55025fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Tratamento com bisfosfonatos de Medaka Larvas

1. Prepare soluções contendo concentrações diferentes de bisfosfonatos (BPS) para os estudos de dose-resposta.
   NOTA: A BP exemplar utilizado neste protocolo é alendronato.
   1. Dissolve-se o alendronato em forma de peixe a uma concentração de 100 ug / mL para preparar uma solução de reserva.
   2. Usar um misturador de vórtice para garantir a dissolução completa. Guardar a solução estoque a 4 ° C.
   3. Preparar soluções de trabalho diferentes por diluição da solução de estoque com meio peixes a uma série de concentrações (isto é, 25, 37,5, 50, 62,5, e 75 ug / mL).
      NOTA: Diferentes drogas podem ter diferentes absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) parâmetros, que devem ser considerados durante o teste usando este sistema larvas medaka. Além disso, a solubilidade do fármaco e a estabilidade pode variar quandoaplicado como uma solução aquosa. compostos menos solúveis em água pode ser necessário primeiro ser dissolvido em solventes orgânicos, tais como DMSO. Neste caso, uma solução de reserva é preparada em DMSO, que é, em seguida, diluídas em meio de peixe. Note-se que as soluções de trabalho em água (meio de peixe) podem ser armazenadas no frigorífico durante várias semanas. No entanto, as soluções contendo DMSO deve ser armazenado à temperatura ambiente para evitar a cristalização.
2. Transferência larvas Medaka em placas de seis poços (seis larvas / poço) para o tratamento subsequente BP (alendronato).
3. Remover cuidadosamente a forma de peixe, usando uma pipeta de plástico limpo e adicionar um pequeno volume (aprox. 0,5 mL) de uma solução de alendronato a cada poço.
4. Evite médio de peixe de sobra, como a solução BP acrescentou pode ser diluído, o que é especialmente crítico para soluções de alendronato menos concentradas.
5. Retirar uma pequena quantidade da solução de alendronato (até 0,5 ml) de cada poço com uma pipeta de plástico limpo e substituí-la com um volu maior-me (4 mL) de uma solução de alendronato.
6. Alterar média diária para assegurar o desenvolvimento normal embriões.

4. Coloração ao vivo de matriz mineralizada-bone

1. Dissolve-se 0,5 g de Alizarina complexona (ALC; ácido alizarina-3-metiliminodiacético) ou 0,05 g de calceína em 50 mL de meio de peixe para preparar 1% e 0,1% de soluções de reserva, respectivamente. Usar um misturador de vórtice para garantir a dissolução completa.
   NOTA: médio dos peixes sem a adição de azul de metileno é utilizado neste e nos passos subsequentes para reduzir autofluorescência nas larvas.
2. Usar um filtro de seringa e de utilização única (0,2 uM) para filtrar a solução de coloração. Guardar a solução filtrada no escuro à temperatura ambiente.
   NOTA: A cor da solução de coloração filtrada, claro ALC é amarelo escuro ao laranja. A cor da solução filtrada calceína, é claro amarelo brilhante. As soluções podem ser utilizadas para vários meses.
3. Diluir a ALC ou estoque calceína solução filtrada 1:10 em meio peixese incubar as larvas Medaka durante 1,5 - 2 h (0,1% de solução de ALC) ou 2 - 2,5 h (solução calceína 0,01%) numa incubadora de 28 ° C se larvas entre 9 e 17 são utilizados DPF. Manter as amostras no escuro.
4. Transferir as larvas e médio peixe fresco com uma pipeta de plástico limpo.
5. Remover o meio peixe com uma pipeta de plástico limpo e adicionar meio de peixe fresco. Repita este passo para 3 - 4 vezes até que nenhuma solução vermelhos ou amarelo-manchado (ALC ou calceína, respectivamente) é mais de esquerda. Deixar as larvas de peixe no meio durante 30 - 60 minutos antes da sua montagem para evitar a imagiologia de epifluorescência a partir do meio.
   NOTA: 0,1% de solução de coloração ALC é prejudicial para as larvas medaka para tempos de exposição prolongados. Os tempos de incubação de 2 h mais longo do que afectam a sobrevivência das larvas. A concentração e o tempo de coloração, por conseguinte, precisa de ser optimizada para diferentes fases de modo a atingir óptimos de sobrevivência de embriões de coloração e resultados.

5. Ao vivo Fluorescência de imagem p>

1. Anestesiar as larvas Medaka com 0,01% tricaina (acetato de metanossulfonato de 3-aminobenzoato de metilo) em forma de peixe.
   NOTA: Anestesiados larvas ficam imobilizados após 5 - 10 min em solução tricaina e, geralmente, estão encontrando-se tanto em seus lados ou as costas.
2. Usar um microloader plástico para orientar as larvas de acordo com a região de interesse. A orientação das larvas utilizadas no presente protocolo é lateral.
3. Use uma lupa com iluminação de fluorescência para imagiologia. Use ampliação alta quando tirar fotografias, com foco em diferentes partes do larvas (cabeça, tronco anterior, posterior do tronco e cauda). Costure imagens individuais juntos em regiões de sobreposição usando um software de processamento de imagem adequado (inserções na Figura 3G).
   NOTA: Isso ajuda a melhorar a qualidade de imagem de todas as partes do corpo relevantes no plano focal correto.
4. Retornar as larvas para o meio dos peixes para a recuperação após Imaging.

TLE "> 6. Viva Imagem Confocal

1. Anestesiar as larvas com 0,01% tricaina em meio peixe para 5 - 10 min até que eles ficam imobilizados.
2. Dissolver baixo ponto de fusão de agarose a 1,5% em meio de peixe por aquecimento num forno de microondas. Arrefecer esta solução a aproximadamente 30 ° C.
3. Adicionar 0,5-1 mL de líquido de 1,5% baixo ponto de fusão de agarose em meio peixe para uma placa de Petri com fundo de vidro. Transferir as larvas anestesiados para dentro da solução, utilizando uma pipeta de plástico limpo.
   NOTA: Tome precaução especial que a temperatura da agarose de baixo ponto de fusão líquida é suficientemente baixa para não prejudicar as larvas.
4. Antes de os solidifica agarose, usar um microloader plástico para empurrar as larvas para o fundo da placa de Petri e orientar as larvas de acordo com a região de interesse. A orientação das larvas utilizadas no presente protocolo é lateral.
   NOTA: As amostras estão prontas para geração de imagens ao vivo confocal após a agarose solidifica completamente.
5. Use um microscópio confocal para ACQimagens ùire.
6. Use uma linha de laser 543 nm para análises mCherry e ALC coloração. Use uma linha de laser 488 nm para nlGFP e analisa coloração calceína.
7. Após a imagiologia, adicionar meio de peixe para a placa de Petri e usar um par de agulhas finas de seringa (27 G x 1½ "), para remover cuidadosamente as larvas da agarose. Transferência das larvas com residualmente ligado agarose para uma placa de Petri com meio de peixe para recuperar .
8. Processar as imagens usando uma imagem de software de análise ^27.

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Resultados

Abundante número de ovos, bem como o pequeno tamanho das larvas, fazer Medaka um excelente modelo para o rastreio de drogas. Uma placa de seis poços único foi utilizada para a cultura até 36 larvas, o que foi suficiente para proporcionar dados estatisticamente significativos. Outra grande vantagem do uso de peixes para análise esquelético é a possibilidade de fazer imagens ao vivo. A transparência das larvas de peixes permite a utilização de proteínas fluorescentes para marcar as células ósseas, bem como a ...

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Discussão

Passos críticos dentro do Protocolo

É essencial que as condições para o tratamento de choque térmico são consistentes e estável quando se comparam amostras diferentes. Condições de temperatura estáveis garantir níveis semelhantes de indução RANKL nas larvas transgénicos e, consequentemente, a formação de osteoclastos comparável, que pode ser confirmada por rastreio para CTSK: nlGFP expressão. Em última análise, isso leva a um grau semelhante de reabsorção óssea i...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alendronate	Sigma	A4978
alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone	Sigma	A3882
Calcein	Sigma	C0875
ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma	A5040
ImageJ (1.4.3.67)	National Institute of Health (NIH)		https://imagej.nih.gov/ij/
LSM 510 Meta confocal	Zeiss
LSM Image Browser (4.2.0.121)	Zeiss		http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html
Micro-loader	Eppendorf	5242956003	Eppendorf ep T.I.P.S 20 μL
NIS-Elements BR 3.0 software	Nikon
Photoshop CS6 (13.0.0.0)	Adobe
SMZ1000 stereomicroscope	Nikon