Dissecção e Observação de Honey Bee Dorsal navio de Estudos da função cardíaca

Resumo

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Resumo

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

Introdução

O objetivo geral desta metodologia é permitir que o investigador rapidamente e facilmente observar e quantificar o efeito que um agente farmacológico tem sobre o ritmo cardíaco das abelhas. As abelhas, como outros insectos, tem um sistema circulatório aberto que divulga hemolinfa, o equivalente de insectos de sangue, através da cavidade corporal, conhecido como o hemocelo. A circulação de hemolinfa é essencial para o transporte de nutrientes, factores do sistema imunológico, produtos de resíduos, bem neuro-hormonas e outras moléculas de sinalização ^1. A circulação é facilitada pelo vaso dorsal, que se estende ao longo da linha média dorsal de insecto, bem como órgãos acessórios pulsáteis. O vaso dorsal é dividida em duas partes funcionalmente distintas, designou o coração no abdômen e na aorta no tórax e na cabeça. contrações propagadas na hemolinfa bomba do coração em direção ao tórax e cabeça, enquanto órgãos pulsátil acessórias garantir o fluxo de hemolinfa para as extremidades.

função cardíaca insecto pode ser observada usando uma variedade de métodos, dependendo do tamanho, fisiologia fase, ou de vida do insecto. Uma abordagem comum para a observação da frequência cardíaca em larvas ou insetos menores é o uso de imagens intravital ^2. Este método é menos útil em abelhas adultas, no entanto, uma vez que pode ser difícil de visualizar claramente o vaso dorsal através da parede abdominal. Uma abordagem estabelecida para gravar a frequência cardíaca em uma variedade de insectos, incluindo abelhas, é o uso de termografia de contacto, que utiliza termistores aplicado ao exterior do insecto para detectar pulsações cardíacas ^3,4. A frequência cardíaca em abelhas adultas também foi gravada usando uma técnica eletrofisiológica para medir um sinal de ^4,5 impedância elétrica. Esta técnica requer a inserção dos eléctrodos no animal ao lado do coração e a utilização de um conversor de impedância para gravar pulsações ^4. Da mesma forma, electrocardiogramas foram usadas para detect sinais elétricos produzidos pelo coração e combinados com gravação de vídeo da abelha para observar mudanças na atividade cardíaca ^6. Uma vantagem distinta para estas abordagens é que a frequência cardíaca é avaliada em, uma abelha viva intacta, em vez de em um espécime dissecado, que contribui para garantir a disponibilidade de toda a gama de respostas fisiológicas do sujeito. Os desafios destas abordagens incluem contabilidade para imobilização ou anesthetization do assunto, a necessidade de limitar as variáveis ​​externas e estímulos que podem alterar o ritmo cardíaco, bem como para determinar um método de entrega adequado ao testar agentes farmacológicos.

Outra abordagem que tem sido utilizado para estudar a atividade cardíaca abelha é dissecar parcialmente o inseto, a fim de expor o coração, em seguida medir contrações vaso dorsal, utilizando uma força de deslocamento transdutor ^7. Neste protocolo, o coração é continuamente banhado com soro fisiológico em execução e co testempounds pode ser dissolvido nesta solução para aplicação sobre o assunto ^7. Uma diferença significativa entre este método e os anteriormente descritos é que o cordão nervoso ventral é removido, eliminando o papel que o sistema nervoso central tem mostrado desempenhar na modulação da frequência cardíaca ^5. O resultado é que a pulsação da linha de base, o qual geralmente é bastante errático, estabiliza a uma frequência muito mais baixa e a amplitude do que o tipicamente observado em um insecto vivo ^5,7. O que todos estes métodos têm em comum é que eles exigem equipamento altamente especializado e, muitas vezes caros, além de um certo nível de perícia, a fim de ser conduzido. Talvez a maior desvantagem é que nenhuma destas abordagens são particularmente bem adequado para experiências que envolvem o teste de um grande número de sujeitos, tais como o rastreio de uma biblioteca de compostos potencialmente cardiomodulatory.

A maior força da abordagem aqui descritaé a sua simplicidade. O protocolo é relativamente fácil de dominar, a instalação requer pouco espaço, e apenas uma entrada financeiro mínimo é necessário. O método requer pouco mais de cerca de abelhas, alguns instrumentos cirúrgicos, uma solução isotónica, e quer um microscópio digital ou um microscópio tradicional com uma câmara digital. As abelhas são dissecados para visualizar o vaso dorsal e vídeos digitais são usados ​​para gravar a frequência cardíaca antes e após o tratamento com agentes farmacológicos. Embora a gravação de vídeo não é realmente necessário observar alterações do ritmo cardíaco, ele irá aumentar o rendimento muito (ou seja, o número de indivíduos que podem ser processados em um determinado período de tempo). O investigador pode maximizar a eficiência através da gravação de um grande número de vídeos de uma só vez e depois marcando esses vídeos em um momento mais conveniente. Outra vantagem dessa abordagem é que os vídeos permitem que o investigador de começar de novo, deve o processo de pontuação ser interrompido, e torná-lo mais fácil para o viewer ser cegos para o tratamento, a fim de reduzir o desvio.

Protocolo

1. Recolha e Preparação de assuntos de teste

1. Coletar o número apropriado de abelhas da colônia.
   NOTA: O número necessário depende não só do tamanho e escopo do experimento, mas também da habilidade do investigador. Por exemplo, se existem 2 grupos de tratamento com um tamanho de amostra desejada de 10 abelhas em cada grupo, um investigador razoavelmente habilidoso pode recolher pelo menos 30 abelhas para explicar dissecções sem sucesso e acabar com 20 vídeos úteis para marcar.
2. Minimizar a quantidade de tempo que passa entre a recolha e dissecção.
   Nota: Embora as abelhas podem ser alojados no laboratório para os dias anteriores à dissecção, a taxa de sucesso de dissecção (isto é, a probabilidade de manter uma taxa cardíaca estável num vaso dorsal dissecados) foi observada para diminuir em relação à quantidade de tempo que abelhas estão alojados longe da colônia.
   1. Fornecer abelhas com uma fonte de água e comida, enquanto alojada no laboratório. para example, no mínimo, proporcionar o acesso a uma 50% de solução de sacarose em água (v / W) (isto é suficiente para durações de menos de 6 horas). Para períodos mais longos, fornecer abelhas acesso ao mel.
   2. abelhas casa na noite de laboratório a uma temperatura de aproximadamente 32 ° C e 60-80% de umidade relativa para reduzir o estresse e evitar a desidratação.
3. Antes de dissecação, anestesiar abelhas brevemente para auxiliar no manuseio.
   NOTA: Isso pode diminuir a taxa de sucesso das dissecções e reduzir a taxa de transferência.
   1. Relaxar as abelhas, quer por colocá-los em gelo ou em uma geladeira por apenas o tempo suficiente para reduzir o movimento, a fim de auxiliar no manuseio.
   2. Alternativamente, expor brevemente abelhas ao CO _2, a fim de auxiliar no manuseio.
      NOTA: A exposição prolongada ao frio pode reduzir a taxa de sucesso de dissecações. Estendida ou repetida exposição ao CO ₂ também pode reduzir a taxa de sucesso de dissecações.

2. Dissecçãoda Dorsal da parede abdominal

NOTA: As abelhas devem estar vivo no momento da dissecção.

1. Utilizando uma pinça e / ou tesoura de microdissecção, retire as pernas e asas para facilitar a dissecção do abdômen. Manter um pequeno copo ou recipiente semelhante preenchido com água destilada nas proximidades para fins de enxaguamento instrumentos entre dissecações.
2. Enquanto restringem a abelha com uma pinça, utilizar a tesoura para cortar microdissecção lateralmente ao longo da parede abdominal dorsal entre as primeira e segunda tergites (ver Figura 1).

Figura 1: Vista dorsal do abdômen abelha. A incisão inicial pode ser feita entre os primeiro e segundo tergites, como indicado pela linha vermelha. Escala da barra = 1 mm. Por favor, clique delae para ver uma versão maior desta figura.

3. Enquanto levemente agarrando a borda posterior do segundo tergito com a pinça, cortado longitudinalmente ao longo de cada lado da abelha da incisão inicial para o aguilhão (ver Figura 2). Tenha cuidado ao cortar para evitar a perfuração do trato gastrointestinal.

Figura 2: Vista lateral do abdômen abelha. Os segundo e terceiro incisões devem ser feitas ao longo de cada lado do abdómen, como indicado pela linha vermelha. Escala da barra = 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Trocar a tesoura para um segundo conjunto de pinça fina e utilizá-los para separar cuidadosamente parede abdominal dorsal do resto of abdômen. Suavemente remover o ferrão e qualquer parte do tracto gastrintestinal que se mantém ligado à parede abdominal dorsal. Evitar a ruptura do intestino, como o conteúdo pode revestir a parede abdominal e impedir a visualização do vaso dorsal.

Figura 3: Vista do vaso dorsal. Uma vez que o intestino e ferrão ter sido removida, o vaso dorsal é visível ao longo da linha média da parede abdominal dorsal dissecados. Escala da barra = 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Organizar a parede abdominal dorsal na orientação desejada por baixo da câmara de modo que o vaso dorsal é visível (veja a Figura 3). Utilizar a tesoura de microdissecção para aparar qualquer excesso de abdominal parede impede que a visualização do vaso dorsal. A forma da parede abdominal dorsal deve se assemelhar a um copo ou tigela rasa quando bem situado.
   1. Uma vez que o vaso dorsal não se estender para o segmento abdominal mais atrás da abelha, remover o tergito final a fim de melhorar a visualização do vaso dorsal.
6. Utilizando uma micropipeta de volume ajustável, cobrir o vaso dorsal com 10 ml de uma solução isotônica para manter as condições fisiológicas e facilitar uma pulsação constante.
   NOTA: A solução recomendada é de solução de Ringer força trimestre (0,120 g de cloreto de / L de cálcio, 0,105 g / L de cloreto de potássio, 0,050 g / L de bicarbonato de sódio e 2,250 g / L de cloreto de sódio), o qual foi encontrado para facilitar um estábulo, batimento cardíaco contínuo.

3. Observação e Modulação de Frequência Cardíaca

1. Permitir que o vaso dorsal para repousar até que um batimento cardíaco estável, contínua é alcançada(Geralmente dentro de 300 segundos).
   NOTA: A pulsação do coração é visualizado como contrações rítmicas do vaso dorsal. Inicialmente, pode não parecem ser batimento cardíaco, especialmente se a abelha foi anestesiado, mas o coração bater normalmente será retomada após o repouso em solução isotónica durante vários minutos, e pode continuar a bater por hora, desde que se mantenha banhadas em solução.
2. Medir o ritmo cardíaco em termos do número de batimentos por minuto (BPM).
   1. Grave o número de contrações observados durante um período de 60 segundos. Use um contador de contagem de mão e um temporizador para facilitar este processo.
3. Medir a alteração da frequência cardíaca pelo registro da BPM observados antes e após o tratamento com um composto cardiomodulatory.
   Nota: Embora o tempo necessário para se observar um efeito sobre a frequência cardíaca pode variar dependendo do composto a ser testado, as mudanças no ritmo cardíaco pode tipicamente ser observado no prazo de minutos.
   1. Determinar a frequência cardíaca basal imediatamente antes daa adição de qualquer composto de ensaio.
      NOTA: frequência cardíaca pós-tratamento geralmente pode ser determinada após 90 a 120 segundos.
   2. Prepare cardiomodulators potenciais (por exemplo, octopamina) por dissolução do composto na mesma solução isotónica utilizados para banhar o vaso dorsal.
   3. Adicionar os compostos de teste para a solução envolvente do vaso dorsal utilizando um micropipetter.
4. Para maior precisão e maior rendimento, faça uma gravação de vídeo de cada assunto de teste e, em seguida, usar os vídeos para marcar frequência cardíaca em um momento posterior.
   NOTA: Este permite que um único investigador para escalonar dissecações, a fim de facilitar a produção quase contínua de vídeos. Ao gravar vídeos, o comprimento mínimo recomendado é de aproximadamente 240 segundos com qualquer composto de teste que está sendo adicionado à marca dos 60 segundos. Isso garante que o investigador tem uma janela 60 seg para conseguir frequência cardíaca linha de base e, em seguida, uma outra janela 60 seg para conseguir pós-tratamento taxa cardíaca de 120 segdepois do tratamento.

Resultados

Uma vez que muitos dos compostos farmacologicamente activos que podem ser testados utilizando este protocolo não são solúveis em água, é necessário ter um solvente fiável que permita que os compostos de teste a ser entregue através da solução isotónica utilizados para banhar o vaso dorsal. Dimetil sulfóxido (DMSO) é um solvente que é comumente utilizado como um veículo para a entrega de drogas e outros compostos experimentais em animais ^8, e que tem sido usado c...

Discussão

The protocol presented here provides a simple and effective approach to testing pharmacological compounds for their effects on honey bee heart rate. As observed in prior experiments that either transect the ventral nerve cord of a living insect⁵ or dissect out the ventral nerve cord when exposing the dorsal vessel⁷, the loss of central nervous system regulation results in a stable, low frequency heartbeat. The low frequency of beats allows the investigator to visually assess heart rate without havin...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments