O Poder da Simplicidade: Sea Urchin embriões Na Vivo Modelos de desenvolvimento para estudar células de células-complexo de sinalização de rede Interações

Resumo

Este artigo de vídeo detalha uma simples em metodologia in vivo que pode ser utilizado para caracterizar de forma eficiente e sistematicamente componentes de vias de sinalização complexas e redes reguladoras em muitos embriões de invertebrados.

Resumo

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

Introdução

redes de genes reguladores (GRNs) e vias de transdução de sinal estabelecer a expressão espacial e temporal dos genes durante o desenvolvimento embrionário que são usados ​​para construir o plano de adulto corpo do animal. Célula-a-célula vias de transdução de sinal são componentes essenciais destas redes reguladoras, que proporciona os meios pelos quais as células comunicam. Estas interacções celulares estabelecer e aperfeiçoar a expressão de genes reguladores e diferenciação dentro e entre os vários territórios durante a embriogênese ^{1, 2.} Interações entre os moduladores secretadas extracelulares (ligantes, antagonistas), receptores e co-receptores controlar as atividades de vias de transdução de sinal. Uma variedade de moléculas intracelulares transduz estas entradas resultando na expressão alterada do gene, divisão, e / ou a forma de uma célula. Enquanto muitas das moléculas-chave utilizadas nos níveis extracelulares e intracelulares nas vias principais sãoconhecido, é um conhecimento incompleto, devido em grande parte à complexidade das vias de sinalização individuais. Além disso, diferentes vias de sinalização, muitas vezes interagem uns com os outros, positivamente ou negativamente na extracelular, intracelular, e os níveis de transcrição ^{de 3, 4, 5, 6.} É importante ressaltar que os principais componentes de vias de transdução de sinal são altamente conservadas em todas as espécies de metazoários, e, curiosamente, a maioria das principais vias de sinalização, muitas vezes executar funções de desenvolvimento semelhantes em muitas espécies quando se comparam os organismos de filos intimamente relacionados, em especial, ^{7, 8, 9, 10, 11.}

O estudo da sinalização durante o desenvolvimento é uma tarefa difícil em qualquer organismo, e hávários desafios significativos para estudar vias de sinalização na maioria dos modelos deuterostomia (vertebrados, cordados invertebrados, hemichordates, e equinodermes): 1) Em vertebrados há um grande número de possíveis ligandos e as interacções receptor / co-moduladores, moléculas de transdução intracelular, bem como potenciais interacções entre diferentes vias de sinalização, devido à complexidade do genoma de ^{12, 13, 14;} 2) A morfologia complexa e movimentos morfogenéticos em vertebrados muitas vezes tornam mais difíceis de interpretar as interações funcionais em e entre vias de transdução de sinal; 3) As análises na maioria dos não-equinodermos espécie modelo de invertebrados deuterostomia são limitados por janelas curtas de gravidity com exceção de algumas espécies de tunicados ^{15, 16.}

oouriço-do-mar embrião tem algumas das limitações acima mencionadas e oferece muitas qualidades únicas para a realização de uma análise detalhada das vias de transdução de sinal in vivo. Estes incluem o seguinte: 1) A relativa simplicidade do genoma do ouriço-do-mar reduz significativamente o número de possíveis do ligando, do receptor / co-receptor e molécula de transdução intracelular interacções ^17; 2) Os GRNs que controlam a memória descritiva e modelação das camadas germinativas e grandes eixos embrionários são bem estabelecida em embriões de ouriço-do-mar, auxiliando na compreensão do contexto regulamentar da célula / território receber os sinais ^{18, 19;} 3) Muitas vias de transdução de sinal podem ser estudadas entre as fases de clivagem e de gástrula inicial quando embriões consistem de um único epitélio em camadas cuja morfologia é mais fácil de analisar; 4) As moléculas envolvemd nas vias de sinalização nas ouriços do mar são facilmente manipulados; 5) Muitas ouriços do mar estão grávidas de 10 a 11 meses por ano (por exemplo, Strongylocentrotus purpuratus e Lytechinus variegatus).

Aqui, apresentamos um método para caracterizar de forma sistemática e eficiente componentes das vias de sinalização que especificam e territórios padrão em embriões de ouriço-do-mar para ilustrar as vantagens que vários sistemas modelo de invertebrados oferecem no estudo dos mecanismos moleculares complexas.

Protocolo

1. Rendimento Morpholino Estratégia de alto design

1. Identificar um gene (s) de interesse (por exemplo, abordagem do gene candidato, análise de cis-regulatórias, RNA-Seq e ou telas diferenciais / proteômica).
2. Use genômica, transcriptomic, e dados de expressão de genes disponíveis em sites atualizados com freqüência (por exemplo SpBase http://www.echinobase.org ²⁰ e S. purpuratus Genome Pesquisa http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) para determinar se o perfil de expressão espaço-temporal sobrepõe-se com o mecanismo de desenvolvimento em questão. Se não houver dados disponíveis expressão é, em seguida, gerar iniciadores qPCR e / ou um anti-sentido na sonda in situ para avaliar o padrão de expressão do gene.
3. Depois de determinar o padrão de expressão espacial e temporal, obter a sequência de DNA a partir dos sites genômicos.
   1. Para a geração de oligonucleótidos morfolino-tradução de bloqueio, obter sequência óf a "região não-traduzida (5 '5 UTR) directamente a montante do codão de iniciação de expresso Sequence Tag (EST) bases de dados disponíveis no SpBase ou S. purpuratus Genoma sites de busca. Se esta informação não está disponível para o gene de interesse, em seguida, executar 5 'RACE.
   2. Para projetar um morfolino-blocking emenda, procure a seqüência genômica incluindo os exons e introns usando a ferramenta de andaime BLASTN em SpBase ou S. purpuratus Genome ferramenta de busca.
4. Use o site oligonucleotídeo concepção http://oligodesign.gene-tools.com a fim de projetar a sequência par morfolino 25 base desejada.
   1. Para um bloqueio de morfolino-translacional, utilizar a sequência de ARNm a partir de 5 'para 3' como a fonte da sequência alvo de translação. Incluir sequência a 5 'UTR (cerca de 70 nucleótidos a montante do sítio do início da transcrição), mais 25 bases da região de codificação (a jusante do local de início) com o codão de iniciação Wi acentuadath parênteses (ATG).
   2. Para um bloqueio de morfolino-splicing, seleccionar intrão-exão ou uma sequência de fronteira exão-intrão e incluem 50 bases (25 bases da sequência de exão e 25 bases da sequência do intrão) em torno das regiões de fronteira. Digitalizar o genoma com a sequência morfolino para verificar que a sequência é única.

2. A microinjecção de morfolino oligonucleótidos

1. Prepare 3 soluções de mM dos oligonucle�idos morfolino pela adição de 100 mL de água livre de nuclease para dentro do frasco morfolino 300 nmol.
   NOTA: Não use DEPC água tratada para a re-suspensão porque dietilpirocarbonato pode danificar o morfolino.
2. Para a primeira rotação reconstituição sobre o frasco contendo a solução de oligonucleótido durante 30 s à velocidade máxima (14000 - 16000 xg), vortex brevemente, aquece-se a 65 ° C durante 5 a 10 min, vortex brevemente, e manter o estoque morfolino no quarto temperatura durante pelo menos 1 h. solução de morfolino s são armazenados de -20 ° C a 4 ° C.
3. Preparar a solução de injecção contendo oligonucleótidos morfolino na concentração desejada. Esta solução normalmente contém 20% de glicerol ou KCl 125 mM como um transportador e 15% de FITC-Dextrano (isotiocianato de f luoresceina de dextrano 10.000 MW de 2,5 mg Solução de estoque / mL). outros conjugados de dextrano fluorescente FITC-Dextrano e são rotineiramente usadas para identificar embriões injectados por microscopia de epifluorescência. soluções para injecção armazenar a -20 ° C.
4. Aquece-se a solução de morfolino a 65 ° C num bloco de aquecimento ou banho de água, durante pelo menos 2-5 minutos.
5. Resumidamente girar a solução de morfolino por 30 s em velocidade máxima (14000 - 16000 xg), vortex durante 1 min e centrifuga-se a toda a velocidade (14.000 - 16.000 xg) durante pelo menos 10 min.
6. Coloque as agulhas de injecção com a solução morfolino. Para um protocolo de microinjeção detalhadas, por favor consulte Stepicheva e Song, 2014 ²¹ e Felicidades e Ettensohn de 2004"> 22.

3. Fixação e in situ Protocolo às 24 horas pós-fertilização (hpf) em S. purpuratus Embriões

NOTA: Este protocolo é modificado a partir Arenas-Mena et al. , 2000 ²³ e Sethi et ai. De 2014 ^24.

1. Fixação
   1. Adicione algumas gotas de fixador (veja abaixo) para poços contendo embriões, misture delicadamente por pipetagem, e permitir-lhes para resolver. Remover a solução fixadora, e, em seguida, misturar embriões com duas lavagens de 180 ul adicionais de fixador.
      NOTA: É importante para misturar completamente os embriões durante as lavagens por pipetagem suave para cima e para baixo várias vezes. Não fazer isso pode reduzir a relação sinal-ruído.
   2. Deixar os embriões para fixar na segunda lavagem fixador durante 50 min a 1 h à temperatura ambiente (TA) em paraformaldeído grau de microscopia electrónica de 4% que consiste em MOPS 10 mM, pH 7,0, 0,1% de Tween-20, e artificial seawateR (ASW). Faça esta solução fresca de cada vez para obter melhores resultados. Além disso, para facilidade e praticidade embriões foram fixados em placas de 96 poços.
      1. Para 20 mL de utilização fixador 5 mL de 16% de paraformaldeído, 15 mL ASW, 200 mL 1 M de MOPS pH 7,0, e 20 uL de Tween-20.
   3. Lavar 5 vezes à temperatura ambiente com 180 ul de MOPS tampão de lavagem consistindo em MOPS 0,1 M pH 7,0, NaCl 0,5 M e 0,1% de Tween-20 durante pelo menos 5 min ou até que os embriões cair para o fundo do poço. Mais uma vez, é importante para misturar bem os embriões para o tampão de lavagem cuidado pipetando para cima e para baixo várias vezes. MOPS tampão de lavagem pode ser utilizado para 2 dias se armazenado a 4 ° C.
      1. Para 40 mL de MOPS lavar utilização tampão 4 ml de MOPS 1 M pH 7,0, 4 mL de 5 M de NaCl, 32 mL _{de dH2O} e 40 ul de Tween-20.
      2. Embriões fixos pode ser armazenado a 4 ^° C durante 2 dias.
         NOTA: Se o armazenamento de embriões fixos mais, em seguida, adicionar 0,2% de azida de sódio em MOPS tampão de lavagem para impedir o crescimento bacteriano.
2. Pré-hibridação
   1. Aspirar as MOPS tampão de lavagem e adicionar 180 uL de uma proporção de 2: 1 de tampão de lavagem para MOPS tampão de hibridação, mistura embriões para dentro da solução por pipetagem suave várias vezes, e incuba-se durante pelo menos 20 min à temperatura ambiente. tampão de hibridação constituída por formamida a 70%, MOPS 0,1 M pH 7,0, NaCl 0,5 M, 1 mg / mL de BSA e 0,1% de Tween-20.
      1. Para 40 mL de tampão de hibridação utilização 4 ml de MOPS 1 M pH 7,0, 4 mL de NaCl 5 M, 4 mL de dH ₂ O, 0,04 g de BSA, e 40 uL de Tween-20. Misture bem num vórtice, e adicionar 28 ml de formamida, e novamente vórtice.
   2. Remover a relação de 2: 1 de MOPS lavar e tampões de hibridação e adicionar 180 uL de uma proporção de 1: 2 de MOPS tampão de lavagem de tampão de hibridação, mistura embriões para dentro da solução, e incuba-se durante pelo menos 20 min à temperatura ambiente.
   3. Antes de hibridação com sonda de misturar suavemente embriões em 100 - 150 ul de tampão de hibridação. Incubar os embriões a 50 ° C durante pelo menos 1h.
      NOTA: A incubação de embriões durante a noite é aceitável. Antes da incubação, os poços de selar com uma folha adesiva, a fim de evitar a evaporação.
3. hibridização
   1. Num tubo separado adicionar 0,1-0,3 ng / mL de sonda e 500 ug / mL de ARNt de levedura em tampão de hibridação, seguida de vórtice suavemente para criar solução de sonda. ARNt de levedura é adicionada à solução de sonda para diminuir a ligação não específica da sonda anti-sentido. Pré-aqueça esta solução a 50 ° C e tampão de hibridação aspirado.
   2. Misture embriões pré-hibridados em 100 mL da solução de sonda, selar com uma folha adesiva, e hibridar a 50 ° C durante 2 a 7 dias dependendo da sonda (sonda foxq2 podem ser incubadas durante 2 dias).
      NOTA: Os tempos de incubação varia com base fora da sonda. Alguns genes expressos em níveis baixos requerer até um período de incubação de 7 dias. placas de 96 poços pode ser colocado em uma caixa de umidade como um seguro contra a evaporação se os ADHESfolha ive não selar corretamente.
   3. Lavagem de 5 vezes a 50 ° C com 180 ul de MOPS recém-preparadas tampão de lavagem para um total de 3 h. Em seguida, lavar 3 vezes (15 min) com 180 uL de tampão de MOPS lavar à TA. Lembre-se de misturar os embriões para o tampão de lavagem a cada vez com cuidado pipetando várias vezes.
4. incubação de anticorpos
   1. Aspirar as MOPS tampão de lavagem e misturar embriões em 180 uL de tampão de bloqueio que consiste em 10% soro de ovelha normal e 5 mg / mL de BSA em MOPS tampão de lavagem e incubar durante pelo menos 45 min à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite.
   2. Remover o tampão de bloqueio e, em seguida, misturar embriões em tampão contendo um bloqueio 1: 1500 de diluição de anticorpo anti-digoxigenina conjugado com fosfatase alcalina diluído em tampão de bloqueio. Incubar durante a noite à temperatura ambiente numa placa selada para evitar a evaporação. NOTA: Não deixe de anticorpos em mais do que durante a noite.
   3. Lavar embriões 6 vezes (5 min ou até que os embriões gota) em MOPS tampão de lavagem à temperatura ambiente. embriões podemser armazenado durante a noite a 4 ° C.
5. No desenvolvimento in situ
   1. Lavar os embriões 3 vezes (10 min) à temperatura ambiente com tampão acabado de fazer pH 9,5 constituído por Tris 0,1 M pH 9,5, NaCl 100 mM, _MgCl2 50 mM, Levamisol 1 mM e 0,1% de Tween-20.
      1. Para 20 mL de tampão de pH 9,5 utilização 2 mL de 1 M de Tris pH 9,5, 400 ul de NaCl 5 M, 1 mL de 1 M _{de MgCl2,} 20 uL de Tween-20, 16,6 ml _{de dH2O,} e 0,0048 g Levamisol.
   2. Incubar os embriões a 37 ° C em tampão de coloração protegida da luz. Tampão de Coloração consiste de 10% de dimetil formamida, 4,5 mL / mL de 4-nitro cloreto de azul de tetrazólio (NBT) e 3,5 uL / ​​mL de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) em recém-feitos tampão de pH 9,5 .
      1. Para 1 mL de tampão de coloração utilizar 100 mL de dimetilformamida, 4,5 mL de NBT e BCIP 3,5 mL.
   3. Parar a reacção com fosfatase alcalina de lavagem de 3 a 5 vezes em tampão MOPS lavar. O wi reaçãoth da sonda foxq2 tipicamente leva cerca de 30 min a 1 h. Algumas sondas podem necessitar de incubação durante a noite a RT, quer ou 4 ° C.
   4. Misture embriões em uma solução de lavagem de MOPS 70% e 30% de glicerol. O glicerol proporciona um índice de refracção necessárias para microscopia. Os embriões podem ser armazenados nesta solução por várias semanas. Selar as placas com parafina de plástico para evitar a evaporação.
6. Preparação da lâmina e captura de imagem
   1. Prepare um slide, organizando três pequenas tiras de fita dupla face em um triângulo com pequenos intervalos entre as tiras numa lâmina.
   2. Transferir os embriões na lavagem MOPS 70% e solução de glicerol a 30% para o centro do triângulo e cobrir com uma lamela.
   3. Selar a lamela por aplicação de uma camada de unha polonês em torno das arestas da lamela.
   4. Capturar imagens usando um microscópio composto luz com um objetivo 20X e uma câmera acoplada.

Resultados

No embrião ouriço-do-mar temos demonstrado que 3 diferentes sinalização Wnt ramos (Wnt / β-catenina, Wnt / JNK, e Wnt / PKC) ^{4, 25} interagem de modo a formar uma rede de sinalização de Wnt que governa ântero-posterior padronização (AP). Uma das consequências mais importantes destes eventos de sinalização é que a GRN inicial amplamente expressa neuroectoderma anterior (ANE) torna-se restrita a um pequeno território ...

Discussão

A metodologia aqui apresentada é um exemplo que ilustra o poder de usar embriões com menos complexidade genômica e morfológica de vertebrados para compreender as vias de transdução de sinalização e GRNs regem mecanismos de desenvolvimento fundamentais .. Muitos laboratórios estão usando ensaios semelhantes durante o desenvolvimento do ouriço-do-mar cedo para dissecar o vias envolvidas em outros eventos de especificação destino de sinalização celular (por exemplo, Notch, Hedgehog, TGF-β, e FGF si...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino	Gene Tools LLC	Customized	More information at www.gene-tools.com
Glycerol	Invitrogen	15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)	Invitrogen, Life Technologies	D1821	Make 25 mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
MOPS	Sigma Aldrich	M1254-250G
Tween-20	Sigma Aldrich	23336-0010
Formamide	Sigma Aldrich	47671-1L-F
Yeast tRNA	Invitrogen	15401-029
Normal Goat Serum	Sigma Aldrich	G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody	Roche	11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole)	Sigma Aldrich	L9756-5G
Tris Base UltraPure	Research Products Internationall Corp	56-40-6
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate	Roche	11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)	Roche	11 383 213 001
Dimethyl Formamide	Sigma Aldrich	D4551-500mL
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541-5KG
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761-500G
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	M7506-2KG
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C1016-500G