Determinando Glucose Metabolismo Kinetics Usando<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG Micro-PET / CT

Resumo

This study describes a protocol that uses ¹⁸F-FDG and positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) imaging, together with kinetic modelling, to quantify the in vivo, real-time uptake of ¹⁸F-FDG into tissues.

Resumo

This paper describes the use of ¹⁸F-FDG and micro-PET/CT imaging to determine in vivo glucose metabolism kinetics in mice (and is transferable to rats). Impaired uptake and metabolism of glucose in multiple organ systems due to insulin resistance is a hallmark of type 2 diabetes. The ability of this technique to extract an image-derived input function from the vena cava using an iterative deconvolution method eliminates the requirement of the collection of arterial blood samples. Fitting of tissue and vena cava time activity curves to a two-tissue, three compartment model permits the estimation of kinetic micro-parameters related to the ¹⁸F-FDG uptake from the plasma to the intracellular space, the rate of transport from intracellular space to plasma and the rate of ¹⁸F-FDG phosphorylation. This methodology allows for multiple measures of glucose uptake and metabolism kinetics in the context of longitudinal studies and also provides insights into the efficacy of therapeutic interventions.

Introdução

O objectivo deste estudo foi desenvolver uma tomografia de emissão de positrões / tomografia computadorizada (PET / CT) metodologia base para quantificar o, in vivo, a absorção em tempo real de glucose a partir do fluxo de sangue para os tecidos específicos em ratos. Isto foi conseguido usando fluorodesoxiglucose ¹⁸ F-rotulado (FDG) para medir a absorção de glicose e de modelagem cinética para estimar as taxas de ¹⁸ captação F-FDG do plasma para o espaço intracelular, a taxa de transporte do espaço intracelular para o plasma e a taxa de ¹⁸ F-fosforilação de FDG.

Em roedores, ^18F-FDG foi usado na avaliação pré-clínica de numerosos tratamentos contra o cancro ^1, estudos de progressão do tumor e ² metabolismo do tumor ^3, bem como de imagem de depósitos de gordura marrom ^{4, 5} e neuroinflamation cérebro metabolismo ⁶ .

Os métodos tradicionais utilizados para examinar a absorção específica de tecido de glucose em ratinhos e ratos () geralmente envolvem o tratamento com 2-desoxiglucose marcada radioactivamente com qualquer ³ H ou ¹⁴ C, seguido por eutanásia, recolha de tecido e medição de radioactividade em cada tecido ^7. O uso de PET / CT permite a determinação não invasiva da captação de glicose e do metabolismo em múltiplos órgãos e regiões simultaneamente em animais vivos. Além disso, como a eutanásia não é um requisito, esta técnica é adequado para utilização em estudos longitudinais.

Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é caracterizado por um metabolismo perturbado glicose e hiperglicemia secundária a capacidade de resposta dos tecidos reduzida à insulina (resistência à insulina) e a incapacidade de -cells pancreáticas para produzir quantidades adequadas de insulina ^8. análise cinética de absorção de glicose e do metabolismo pode fornecer importantes insights sobreo mecanismo de acção e eficácia de intervenções terapêuticas, bem como permitir a monitorização da progressão da doença avançada.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos neste estudo foram aprovados pelo Distrito de Saúde Sydney Local e Universidade de Comitês de Ética Animais Sydney e seguiu o Guia do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório, oitava edição (2011).

1. Preparação de animais

NOTA: Nesta db macho protocolo / db (BKS.Cg- Dock7 ^m + / + ^Leprdb / J) foram mantidas em habitação grupo com acesso ad libitum à comida e água até 6 semanas de idade. No momento da imagiologia, os ratinhos pesavam 30 g ~. Todos os ratos utilizados neste protocolo tinham jejum níveis de glicose no sangue entre 10 e 14 mmol / L.

1. Se necessário, jejuar ratos. No presente exemplo, os ratos jejuar durante 5 h antes do procedimento experimental.
2. Tratar os ratos com o agente desejado (por exemplo, droga, proteína, péptido) antes do início da imagiologia. Neste exemplo, administrar uma injecção subcutânea de insulina (3U / kg de insulina humana) ou o volume equivalente de PBS 30 min antes do início da imagiologia.

2. Defina o fluxo de trabalho

NOTA: Este protocolo foi implementado em um scanner PET / CT. Adquirir dados de PET primeiro, seguido por aquisição de dados CT.

1. Configurações de estimação:
   1. Seleccionar isótopo como ¹⁸ F, definido de duração do varrimento a 3600 s, e discriminação do nível de energia superior e inferior a 350 keV - 650 keV (padrão) com uma janela de temporização coincidência de 3.432 ns (por defeito). dados de lista de modo histograma em 16 quadros (6 × 10 × 4 s, 60 s, 1 × 300 s, 5 × 600 s) para o período de 0-60 minutos após a injecção do marcador. Reconstruir emissão sinograms usando 2D-FBP com um zoom de 1,5.
      NOTA: As imagens reconstruídas consistiu de 16 quadros dinâmicos, cada um com 128 × 128 × 159 voxels e um tamanho de voxel de 0,52 x 0,52 x 0,796 milímetros ^3.
2. Configurações CT:
   1. Paraum varrimento CT todo o corpo, ajustar a corrente de 500 A, a tensão de 50 kV, tempo de exposição de 500 ms e 200 projecções mais de uma rotação de 360. Definir o campo de detector de visão (FOV) para 30722048, número de cama posições para três (para cobrir completa gama FoV PET), a sobreposição entre as posições de cama = 30,234713% e detector de arrumação de a 4.
      NOTA: reconstrução CT foi realizada utilizando cone beam tomografia software de reconstrução de imagem com calibração HU, interpolação bilinear e filtro Shepp-Logan.
3. ^18F-FDG:
   1. Ordem suficiente ^18F-FDG (por exemplo 450 MBq em 0,5 mL) a partir de um fornecedor local para chegar ~ 30 minutos antes da primeira injecção. Alíquotas e diluir a ^18F-FDG de modo que os animais recebem ~ 10 MBq de ^18F-FDG em um volume final de 0,1 mL.

3. Protocolo de imagem

1. Limpar abaixo câmara de indução e cama de imagem com 80% (v / v) de etanol para manter condições assépticas. Place o rato numa câmara de indução e anestesiar com 5% de isoflurano em oxigio.
2. Colocar o rato sobre uma cama de imagens equipado com uma almofada de aquecimento eléctrico para manter a temperatura do corpo e uma precisão vaporizador cone de nariz para entregar isoflurano (manutenção, 1,5 - 2%) a um caudal de 1 L / min. Aplicar pomada oftálmica para os olhos para evitar a secura, enquanto sob anestesia.
3. Posicionar o rato em uma posição de bruços sobre uma almofada sensor para monitorizar a respiração e garantir uma adequada plano de anestesia é mantida.
4. Aquece-se a cauda usando um aparelho de calor para 1 - 2 minutos para dilatar a veia lateral da cauda. Cateterize da veia lateral da cauda através da inserção de uma agulha de calibre 30 na veia lateral da cauda. Fixar a agulha no lugar com cola cirúrgica e fixar o cateter.
5. imagiologia carga do leito no scanner e mover o leito através da máquina de forma que o cateter pode ser acedida a partir da parte traseira da máquina.
6. Anexar o cateter para a seringa ¹⁸ F-FDG em um syrmotorista Inge. Calcular a exacta dose de ¹⁸ M-FDG (10 MBq) com base na actividade na seringa antes da injecção e o volume a ser administrado (<100? L, injectados ao longo de 10 s).
7. Para minimizar o impacto da anestesia sobre a variabilidade da absorção de glicose, garantir uma constante de tempo entre a indução de anestesia e injecção de ^18F-FDG (por exemplo, 30 minutos).
8. Iniciar o PET scan imediatamente antes da injecção de ^18F-FDG. Depois de terminar o varrimento de PET (3,600 s), executar um varrimento da TC (~ 10 min) para permitir que o co-registo de captação do radiofármaco com tecidos.
9. Mover a cama de imagem para a posição de partida, remover o animal a partir do leito.
10. Neste ponto eutanásia do animal ou permitir que ele se recuperar:
    1. Para a eutanásia, execute deslocamento cervical, embora ainda sob anestesia e recolher órgãos de interesse para análise posterior.
    2. Se permitir que o mouse para se recuperar, coloque o mouse na caixa de uma em uma almofada de aquecimento ouna frente de uma lâmpada de aquecimento. Monitore o rato até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Permitir que o mouse para se recuperar para 1 h antes de retornar ao alojamento em grupo.

4. Processamento de Imagem PET

NOTA: reconstrução imagem foi realizada utilizando aquisição local de trabalho v1.5.0.28 software e análise em v4.2 software trabalho de pesquisa.

1. Co-registar imagens de CT e de PET e assegurar que o alinhamento está correcto em 3 dimensões.
   1. No menu 'File', selecione 'Pasta de Pesquisa / Import' e selecione a pasta que contém os dados. Selecione os dados PET e CT desejados e clique no separador 'Análise Geral.
   2. Classificar os dados para que o CR é designado 'Fonte' e PET é designado 'Target'. No menu 'Fluxo de Trabalho', selecione 'Registro'. Se as imagens exigir a regularização corretamente co-registrada, use as ferramentas no thMenu e 'Registro'.
2. No menu 'Fluxo de Trabalho', selecione 'ROI Quantificação'.
   1. Use as funções 'Pan' e 'Zoom' no separador 'Imagem' para localizar a região desejada. No menu 'Ferramentas', selecione a guia 'Criar' e clique no ícone de pincel. Desenhe o ROI na imagem
3. Extrair curvas de tempo-actividade, selecionando 'Salvar ROI Quantificação' no menu 'Save'. Salvar os dados como um arquivo CSV.
4. Quantificar a captação de radioactividade como Bq por cm ³ de tecido. Converter os valores em percentagem de dose injectada por cm ³ (% ID / cm ^3), carregando o ficheiro CSV para uma folha de cálculo.

Função 5. Input

1. Para corrigir para a função de propagação ponto sistema, deconvoluir PSF sistema estimado para 5 iterações usando o método de desconvolução reblurred Van Cittert como anteriormente descrito ^9.
   NOTA: Isto é necessário devido ao pequeno tamanho da veia cava em um mouse.
2. Use imagens pós desconvolução para gerar uma curva de função de tempo-actividade de entrada de sangue como descrito acima.

6. Modelagem Kinetic

NOTA: O-dois tecido FDG modelo de compartimento (Figura 1) requer a função de entrada de plasma.

1. Converter a função de entrada de sangue no CSV para a função de entrada de plasma utilizando a seguinte equação ^10: Input_plasma = × Input_blood (0,386 e ^{- 0.191t} + 1,165).
2. Na ferramenta de modelagem cinética clique no botão 'Kinetic'. Importar o tecido e atividade plasmática total contar arquivos CSV para a ferramenta de modelagem cinética, selecionando 'Load Tempo Actividade Curve' do 'Menu'.
3. No menu 'Model' selecionar 2 compartimentos de tecido. Certifique-se de que a caixa ao lado de k4 é desmarcadae introduzir um valor de 0. Para a montagem inicial, desligue a caixa para VB (fracção de volume de sangue) e introduzir um valor de 2%.
4. Clique no 'região atual Fit'. Corrigir a região extraída de interesse para dispersão ^{11, 12.} Atingir este, minimizando o valor do qui-quadrado para o modelo de FDG para diferentes tempos de dispersão.
5. Executar um segundo ajuste usando o valor vB flutuante (veja o quadro ao lado da caixa para VB) e o valor de dispersão optimizada para calcular as constantes da taxa de regionais (k -k _{1 3).} Calcular o influxo regionais constante como _Ki = (k ₁ × ₃ k) / (k ₂ + k _3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Nós já usou o modelo do rato db / db para investigar o impacto do aumento dos níveis plasmáticos apoA-I sobre a cinética de absorção de glicose e metabolismo ^13. Neste estudo utilizou-se ratos db / db tratados com insulina para demonstrar a utilidade de imagiologia de PET / TC para monitorar a absorção de ^18F-FDG do plasma para o músculo do gastrocnémio em tempo real.

Anestesiaram-...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

O protocolo aqui descrito representa uma metodologia sólida, não invasivo para determinar a cinética da captação de glicose da corrente sanguínea para o tecido e subsequente metabolismo em ratinhos.

O murganho db / db é um é um modelo animal bem estabelecido para a diabetes Tipo 2 ¹⁴ que tem sido usado extensivamente para examinar a resistência à insulina e intervenções relevantes. No entanto, estudos anteriores têm apenas quantificado captação endpoint...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PET/CT Scanner	Siemens	Inveon
18F-FDG	PETNET Solutions
Isoflurane	Pharmachem
30 guage needle	BD	305106
PMOD modelling software	PMOD Technologies
BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J mice	Jackson Laboratory	000642
Human insulin	Sigma-Aldrich