A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

Resumo

Apresenta-se no presente estudo, um ensaio baseado em fluorescência de novo utilizando linfócitos derivados de um ratinho transgénico. Este ensaio é adequado para rastreio de alto rendimento (HTS) de pequenas moléculas dotadas com a capacidade de qualquer inibição ou promoção da activação dos linfócitos.

Resumo

rastreio de alto rendimento (HTS) está actualmente a base para a identificação de entidades químicas capazes de modular as reacções bioquímicas ou processos celulares. Com o avanço das biotecnologias e o elevado potencial translacional de moléculas pequenas, uma série de abordagens inovadoras na descoberta de medicamentos têm evoluído, o que explica o interesse ressurgente no uso de HTS. O campo de oncologia é atualmente a área de pesquisa mais ativa para a triagem de drogas, sem grande avanço feito para a identificação de novos compostos imunomoduladores segmentação complicações relacionadas ao transplante ou doenças auto-imunes. Aqui, nós apresentamos um romance no ensaio linfócito fluorescente à base de murino in vitro facilmente adaptado para a identificação de novos compostos imunomoduladores. Este ensaio utiliza células T ou B derivados de um ratinho transgénico, em que o promotor conduz a expressão da GFP Nur77 mediante T ou a estimulação do receptor de células-B. À medida que a intensidade de GFP reflecte oactivação / actividade de transcrição da célula-alvo, o nosso ensaio define uma nova ferramenta para estudar o efeito de um dado composto (s) em respostas celulares / biológicas. Por exemplo, um rastreio primário foi realizado usando 4.398 compostos, na ausência de uma "hipótese de alvo", o que conduziu à identificação de potenciais sucessos 160 que exibem actividades imunomoduladoras. Assim, a utilização deste ensaio é adequado para programas de descoberta de drogas que exploram grandes bibliotecas químicas antes de serem in vitro / in vivo, os estudos de validação.

Introdução

High Throughput Screening (HTS) é uma estratégia comprovada amplamente adoptada para a identificação de novas moléculas terapêuticas ou para o reposicionamento de drogas aprovadas pela FDA em novas indicações médicas. ¹ Até agora, o sucesso conseguido HTS pode ser medido pela pletora de drogas anteriormente descobertos. Por exemplo, a lapatinib inibidor de tirosina cinase utilizado para o tratamento de cancro da mama, sitagliptina; uma dipeptidil-peptidase-4 (DPP-4) inibidor utilizado como uma droga anti-hiperglicémicos, e o dasatinib inibidor de tirosina quinase Bcr-Abl oral utilizado para o tratamento de leucemia mielóide crónica representam alguns exemplos de uma longa lista de drogas aprovadas originalmente descobertas pela HTS. ² Embora a produtividade da indústria farmacêutica ultimamente tem sofrido com a falta na descoberta de novas entidades químicas, a probabilidade de sucesso da descoberta de drogas podem ser melhorados através de um aumento no número de Candida pré-clínicates que apresentam propriedades biológicas / bioquímicas moduladores. Por conseguinte, o desenvolvimento de novos ensaios HTS adaptados para o rastreio fenotípica pode oferecer o potencial para proporcionar ferramentas farmacológicas importantes para a descoberta de novas drogas visitas. ^{3, 4, 5, 6} Além disso, HTS agora podem ser realizadas em um ritmo mais rápido devido às transformações tecnológicas significativas nos últimos anos, incluindo instalações de design personalizado flexíveis de robótica, novas tecnologias de leitura e do extenso miniaturização. ^{2, 7} Entre os fatores que contribuem para o crescente interesse no uso de triagem fenotípica (aka frente farmacologia) é a percepção de que o foco em efeitos funcionais, em vez de pressupostos reducionistas simplistas sobre alvos moleculares (/ reações bioquímicas de triagem por objectivo) é mais provável ao sho W eficácia clínica. Assim, a seleção fenotípica mantém a promessa de descobrir novos compostos potencialmente terapêuticos e vias moleculares de doenças atualmente incuráveis. ²

Para identificar correctamente inibidores ou activadores para um determinado alvo molecular ou função celular, um ensaio altamente sensível e fiável é necessária, a fim de diferenciar entre visitas de bona fide e falsos positivos. Então, o que faz um bom ensaio? A qualidade de um dado ensaio deve ser primeiro julgado por a relação sinal-ruído (reflectida por meio de um factor de Z). ⁸ Em segundo lugar, o efeito alvejado ou a meta da tela deve ser claramente estabelecida. Por exemplo, as abordagens baseadas em células funcionais podem oferecer vantagens significativas para o rastreio do receptor, em oposição a um ensaio especificamente concebido para avaliar o ligando-receptor de ligação. A razão para isto é que a última abordagem não é possível diferenciar entre ligandos agonistas e antagonistas.SS = "refex"> 9 Em contraste, uma abordagem baseada na célula é provável que seja mais eficaz como função do receptor pode ser avaliada directamente num fenótipo biológico (proliferação, a paragem do ciclo celular, apoptose, e / ou diferenciação). No entanto, deve notar-se que os ensaios bioquímicos pode proporcionar vantagens significativas sobre ensaios fenotípicos como eles infringir um alvo intracelular específico. Um ensaio bioquímico bem otimizado geralmente têm menos dispersão de dados do que uma triagem fenotípica, simplificando posteriormente investigações relacionadas com o mecanismo molecular de drogas de ação. No entanto, o grande inconveniente de ensaios baseados em alvo ou bioquímicos, é a possibilidade de amplificar a taxa de visitas de falsos positivos que possam afectar alvos não-específicas, quando testado num sistema biológico (perda da especificidade originalmente estudada no ensaio bioquímico). ¹⁰ Apesar de um ponto de corte bem estabelecida entre hits negativos e positivos podem minimizar o número de falsos positivos in a despistagem primária, a utilização de um sistema fisiologicamente relevante imitando o ambiente celular nativo, tais como células intactas, tecido ou animal inteiro todo permanece o núcleo do pêndulo desenhos de ensaios. Portanto, a seleção fenotípica permite a descoberta liderança com efeitos fenotípicos biológicas / desejáveis ​​para doenças sem drogas metas identificados sem ter conhecimento prévio da actividade do composto ou modo de ação. ¹¹

O presente estudo refere-se ao desenvolvimento e teste de uma seleção fenotípica optimizada e reprodutível com base em dois componentes importantes: um modelo de rato disponível no mercado e uma sub-família agrupado de compostos químicos. No que diz respeito ao modelo animal, o ensaio baseia-se na utilização de linfócitos derivados de uma estirpe de ratinho (Nur77 ^GFP) que alberga um cromossoma artificial bacteriano que contém uma cassete em que a expressão da proteína fluorescente verde (GFP) é accionado por Thpromotor e Nur77. ¹² A principal característica de esta estimulação é baseado no facto de que Nur77 é um gene precoce imediato sobre-regulada na sequência do receptor de células T (TCR) ou a estimulação do receptor de células B (BCR). ¹² Como para o próprio método de rastreio, uma abordagem foi utilizada para ajudar a evitar o rastreio de análogos de triviais, minimizando o tempo necessário para avaliar uma biblioteca de química (> 10 ⁵ compostos). Para isso, um banco de dados de compostos químicos selecionados por medicamentos químicos usando ferramentas Virtual foi explorada para identificar compostos topologicamente semelhantes usando estruturas de sementes ativos conhecidos como referências. Esta abordagem permitiu-nos para a tela 4.398 compostos representam uma biblioteca global de mais de 136.000 entidades químicas.

Protocolo

Todos os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animais da Universidade de Montreal. Os ratinhos foram sujeitos a eutanásia por inalação de CO ₂ gradual até que não há sinais vitais foram observadas seguido por deslocamento cervical. O procedimento foi realizado por uma pessoa certificada para garantir que os animais foram sacrificados de forma humana e de acordo com as recomendações do Canadian Council on Animal Care.

1. Preparação de esplenócitos de médio e citometria de fluxo Tampão

1. Executar todas as etapas sob um capuz biológica de 70% de etanol limpos.
2. Remover 70 mL de pré-aquecido do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x (comercialmente disponível e fornecido em filtradas frascos estéreis de 500 ml de volume) e colocar num tubo estéril. O meio removido será utilizado mais tarde no protocolo.
3. Suplemento os restantes 430 mL de RPMI 1640 com soro 1x 50 ml inactivado fetal de bovino (FBS), 5 mL de penicilina / estreptomicina, 5ml de HEPES, 5 ml de aminoácidos não essenciais, piruvato de sódio a 5 mL, e 0,05 mL de filtrado (1M) de 2-mercaptoetanol.
   NOTA: medium esplen�ito Pré-quente usando um banho de água regulado a 37 ºC para evitar células de calor chocante. Isto é importante para evitar a indução da apoptose celular.
4. Para preparar o tampão de citometria de fluxo, adicionar 2 ml de FBS a 98 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e manter refrigerado até à sua utilização (de um modo preferido dentro de três dias).

2. Geração de células em suspensão de esplenócitos de rato Nur77 ^GFP baços

1. A septically isolar o baço de um rato fêmea 6-8 semanas de idade Nur77 ^GFP.
   1. Para conseguir isso, trabalhar sob o capô estéril. Mergulhe as sacrificaram rato pele, tesouras e pinças em 70% de etanol.
   2. Coloque o mouse sobre o lado direito, cortou a pele e os músculos no quadrante abdominal superior esquerdo. Inspecione a área da incisão para localizar visivelmente o baço, em seguida, cortá-lo. Mantenha o baçoem meio de esplenócitos em gelo até estar pronto para executar o próximo passo.
2. Colocar o baço (s) numa célula de 10 ^cm2 placa de cultura de petri contendo 5 ml de meio de esplenócitos pré-aquecido.
3. Amasse o baço usando um êmbolo da seringa estéril até que a solução é turva. Uma matriz de colagénio do baço devem permanecer até ao final do processo.
4. Depois da extensa esmagou em meio esplen�ito, recolher a suspensão de células e passá-lo através de um filtro de células 70 mm colocado em um tubo de 50 mL para filtrar-out quaisquer detritos ou coágulos.
5. Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Depois de descartar o sobrenadante, re-suspender o sedimento de células em 2-3 mL de tampão de lise in-house ou produzido comercial de células vermelhas do sangue. Na sequência de pipetagem (2-3 vezes) deixar o resto suspensão por 20-30 s.
6. Adicionar 5 ml de PBS ou um tampão adequado de escolha depois centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 500 x g.
7. Remover o sobrenadante (deve ser de cor vermelha, pois contém lisadas vermelho bcélulas Lood) e re-suspender o sedimento celular em 2 ml de meio de esplenócitos.
8. Usando um hemocitômetro, contar o número de células coradas com azul de tripano para diferenciar entre células vivas e mortas (necróticas).

3. Isolamento de células T a partir de células em suspensão de esplenócitos

1. Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 500 x g. Re-suspender as células em meio RPMI isento de soro (50 ml a partir do passo 1.3) para se obter uma concentração celular de 10 x 10 ⁶ células / ml.
2. Transferir as células para um tubo de poliestireno de 5 ml e reservar uma alíquota de 100 uL de esplenócitos para avaliação da pureza / comparação no final da etapa de purificação.
3. Adicionar soro de rato normal a suspensão de células a 50 uL / ​​mL seguido de cocktail de anticorpos de isolamento de células T (50 ul / ml).
4. Misture a suspensão de células e deixe descansar por 10 min. Este passo permite que a mistura de anticorpos que ligam todas as células não desejadas.
5. Adicione as esferas rápidas estreptavidina (ímangrânulos Ic) de 2,5 min, em seguida, levar o volume a 2,5 ml, utilizando o meio isento de soro.
6. Colocar o tubo em um ímã de isolamento de células por 3 min.
7. Transferir a suspensão de células T em um novo tubo de poliestireno, segurando o imã e derrama para fora a solução em um movimento.
   NOTA: A suspensão isolado contém as células T purificadas. Todas as células indesejadas são realizadas no lado do tubo ligada às pérolas magnéticas de estreptavidina.
8. Contar as células isoladas T utilizando azul de tripano e um hemocitómetro.
   NOTA: Nesta etapa a pureza das células T isoladas podem ser verificados (opcional) através da análise da percentagem de eventos CD3 ^+, antes e após o isolamento das células T por citometria de fluxo. ¹³
   1. Resumidamente, centrifugação de 1 ml de suspensão de células de esplenócitos a 500 x g. Descartar o sobrenadante e suspender as células em tampão de citometria de fluxo a uma concentração de 1 x 10 ⁶ células / ml.
   2. Adicionar fluorescente marcada com anti-mouse CD3 anticorpo numa concentração de 1: 100. Incubar a 4 ° C durante 30 min. Lavar uma vez, de centrifugação e re-suspensão em tampão de citometria de fluxo (400 ul) para análise por citometria de fluxo.

4. Isolamento de células B a partir de células em suspensão de esplenócitos

1. Seguir o mesmo protocolo que o descrito para as células T (passos 3,1-3,8), mas utilizando um estojo de isolamento de células-B. Para a avaliação da pureza, utilizar o anticorpo de CD19, em vez de o anticorpo CD3. ¹³
   1. Para a avaliação da pureza (opcional), utilizar o anticorpo de CD19, em vez de o anticorpo CD3. Centrifugar 1 ml de suspensão de células de esplenócitos a 500 x g. Descartar o sobrenadante e suspender as células em tampão de citometria de fluxo a uma concentração de 1 x 10 ⁶ células / ml.
   2. Adicionar fluorescente etiquetado anticorpo CD19 anti-ratinho a uma concentração de 1: 100 e incubar a 4 ° C durante 30 min. Lavar uma vez, de centrifugação e re-suspensão em tampão de citometria de fluxo (400 mL) foR análise por citometria de fluxo.

5. A activação de células T e a indução da expressão de GFP

1. Semear as células T, em suspensão, em uma placa de 96 poços de fundo redondo numa concentração de 2,5 x 10 ⁵ células / poço.
2. Adicionar interleucina recombinante (IL) -7 em 2 ng / mL e CD3 / CD28 esferas magnéticas (25? L / 10 ⁶ células). Manter uma porção das células T não tratados com os grânulos para servir como um controlo negativo para as medições posteriores, que representam as células T não activadas.
3. Doze horas mais tarde, a colheita das células T a partir da placa de 96 cavidades por pipetagem suave da suspensão celular em cada cavidade para cima e para baixo para quebrar quaisquer complexos de células do grânulo / agregados. Recolha a suspensão de todos os poços para um tubo de poliestireno de 5 ml.
4. Colocar o tubo contendo a suspensão no interior do mesmo íman isolamento de células utilizado anteriormente para a purificação de células T ou B e permitir que ele descansar durante 5 min.
5. Transferir a suspensão de células T intoa novo tubo de poliestireno, segurando o imã e derrama para fora a solução em um movimento.
6. Centrifugar as células a 500 xg durante 5 min. Re-suspender as células em meio fresco de esplenócitos para obter uma concentração de 2 X 10 ⁶ células / ml.
7. Avaliar GFP intensidade de expressão por citometria de fluxo (opcional para o controlo de qualidade), às 12 a 24 horas pós-estimulação em comparação com células não-T activadas. ¹²
   NOTA: A fluorescência da GFP é intrínseco às células T Nur77 ^GFP e manifesta-se após a activação bem sucedida do TCR. ¹²
8. Para avaliação da viabilidade e activação (opcional) por microscopia, corar as células activadas com Hoechst 30 min antes da análise a uma concentração de 0,2 ug / ml. Adicionar um volume adequado da suspensão de células para uma lâmina de cobertura ou a um poço de uma placa de 384 poços preta faces de fundo plano e examinar ao microscópio de fluorescência para avaliar as células vivas. As células mortas não reterá nuclearcoloração. ¹⁴

6. Activação de células B e a indução da expressão de GFP

1. Utilizando um balão de cultura T-25, re-suspender as células B isoladas a 1 x 10 ⁶ células / ml.
2. Adicionar anti-rato IgG / IgM (H + L) a 10 uL / ​​mL e CD40L recombinante a uma concentração de 200 ng / mL. Manter uma parte das células B não tratadas para servir como um controlo negativo para as medições posteriores (representando as células B não activados).
3. Avaliar GFP intensidade de expressão por citometria de fluxo às 12 ou 24 h após a estimulação, em comparação com células não-B activadas.
   NOTA: A fluorescência da GFP é intrínseco às células B Nur77 ^GFP e manifesta-se após a activação bem sucedida do BCR. ¹²
4. Para avaliação da viabilidade e activação (opcional) por microscopia, corar as células activadas com Hoechst 30 min antes da análise a uma concentração de 0,2 ug / mL. Adicionar um volume adequado da suspensão de células auma cobertura deslizante ou a um poço de uma placa de 384 poços preta faces de fundo plano e examinar ao microscópio de fluorescência para avaliar as células vivas. As células mortas não irá reter a coloração nuclear. ¹⁴

Screening 7. High Throughput de pequenas moléculas

1. Prepara-se uma suspensão de células a 2 x 10 ⁶ células / ml de células T ou B activadas (grânulos magnéticos ou anticorpos / CD40L) ou grupos não-activado.
2. Placa de 75.000 células / poço numa placa de 384 poços (volume de 40 uL). Use uma placa de 384 poços black-sided de fundo chato ou uma tampa de lâmina de microscópio para a viabilidade e ativação de avaliação por microscopia de fluorescência (passo de controle de qualidade opcionais antes da HTS) através da coloração Hoechst (consulte os passos 5.8 e 6.4 para mais detalhes). ¹⁴
3. Manualmente ou utilizando um sistema automatizado, adicionar as drogas de escolha (dissolvido em DMSO a 0,5%) a cada poço.
4. Adicionar o veículo (DMSO) para positiva (activado) e negativo (não-ACTIvado) poços de controlo. Ajustar a concentração de DMSO para um máximo de 0,5%.
5. Incubar as placas durante 24 h (ou tempo de incubação de escolha) a 37 ºC e 5% de CO _2.
6. No dia da análise, dilui-se a solução de corante Hoechst 33342 (1:. 3333; por exemplo, adicionar 10 ul às células em placas de 384 pos para gerar um volume total de 50 uL). Manchar 30 minutos antes da análise por adição de solução de GFP Hoechst para alcançar uma concentração de 0,2 ug / mL.
7. Pipeta suavemente as células para cima e para baixo para obter uma distribuição homogênea em cada poço.
   NOTA: Este passo é importante no caso de distribuição dos medicamentos (passo 7.3), utilizando um sistema automatizado como as células tendem a acumular-se num lado do poço, oposto ao sentido do fluxo.
8. Rodar as placas a 45 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente.
9. Deixar as placas em repouso durante 15 min à temperatura ambiente.
10. Execute placa (s) read-outs, utilizando as scre alto teor confocal automatizadosening sistema (HCS). ¹⁵ Carregue a placa para a máquina. Estabeleceu o objectivo de 40X ou superior ampliação. Usar a câmera # 4 por Hoechst (lâmpada UV) e câmera # 1 para GFP (laser 488). Configure o aparelho para ler 6-10 campos por poço. Ajustar a máquina para fazer duas leituras sequenciais por campo a 488 nm (para ler GFP) e luz UV (para ler Hoechst). Estabeleceu o objectivo de 40X ou superior ampliação.
    NOTA: O sistema é um microscópio computadorizado que não necessita de quaisquer ajustes. A distância focal, a intensidade da luz incidente e o tempo de exposição são todos de configuração automaticamente pela máquina.

Resultados

Projeto do ensaio HTS

Dois fatores importantes foram tomadas em consideração na concepção do ensaio aqui fluorescente. Em primeiro lugar, o que for necessário para replicar uma condição fisiológica em que a activação das células T ou B representaria uma doença (por exemplo, doença enxerto-versus-hospedeiro). Em segundo lugar, a avaliação da activação celular deve ser efectuada utilizando um método sens?...

Discussão

Vários métodos read-out foram explorada para o desenvolvimento de ensaios de HTS sensíveis e fiáveis. Estes incluem colorimétrico, luminescentes ou fluorescentes métodos. Embora os métodos colorimétricos são simples de set-up, eles exigem várias adições de produtos químicos, que podem interferir ou perturbar as células que está sendo testado. ²³ Além disso, eles não permitem a avaliação dinâmica de uma resposta biológica como o efeito farmacológico é considerada como sendo ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nur77GFP mice	The Jackson Laboratory	Mouse strain No. 016617	An in house colony was established at our animal facility
96 wells-U culture plates, sterile	VWR International	10062-902	T-cell activation using the magnetic beads
70 µm cell strainer, sterile	Corning Inc.	352350	Generation of splenocytes cell suspension
5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile	Corning Inc.	352058	Generation of splenocytes cell suspension
50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile	VWR International	89039-656	Generation of splenocytes cell suspension
10 ml syringe without needle, sterile	Becton, Dickinson and Company	305482	To mash the spleen
T-25 culture flask	Greiner Bio-One	690 175	To incudabte B cells during activation
5 ml cell culture dish, sterile	Greiner Bio-One	627 160	To mash the spleen
Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL)	WISENT Inc.	450-200-EL	Component of the splenocyte media
RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine	WISENT Inc.	350-002-CL	Component of the splenocyte media
MEM non-essential amino acids	WISENT Inc.	321-010-EL	Component of the splenocyte media
HEPES free acid 1 M	WISENT Inc.	330-050-EL	Component of the splenocyte media
Sodium pyruvate solution (100mM)	WISENT Inc.	600-110-EL	Component of the splenocyte media
Fetal Bovine Serum (FBS)	WISENT Inc.	080-910	Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer
Phosphate buffered saline (PBS)	WISENT Inc.	311-010-CL	Component of flow-cytometry buffer
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Thermo Fisher Scientific	21985-023	Component of the splenocyte media
T-Cells isolation kit	Stemcell Technologies	19851	To isolate T cells
B-Cells isolation kit	Stemcell Technologies	19854	To isolate B cells
Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads	Thermo Fisher Scientific	11452D	To activate T cells
Cell isolation magnet	Stemcell Technologies	18000	To isolate T cells and remove the magnetic beads
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.	115-006-068	To stimulate B cells
Recombinant Murine IL-7	Peprotech	217-17	To support T-cell survival during activation
Recombinant CD40L	R&D Systems	8230-CL/CF	To stimulate B cells
Anti-mouse CD3 antibody	BD Pharmingen	561799	To stain T cells for flow-cytometry
Anti-mouse CD19 antibody	BD Pharmingen	553786	To stain B cells for flow-cytometry
Biomek FXp	PerkinElmer Inc.	A31842	To re-suspend cells after 24 h incubation
Opera Phenix High Content Screening System	PerkinElmer Inc.	HH14000000	To analyze GFP/Hoechst signal