Quantificação do comportamento de higienização da Drosophila

Resumo

Este protocolo descreve uma técnica de ensaio de higiene pessoal escalável em Drosophila que produz dados robustos e quantitativos para medir o comportamento de limpeza. O método baseia-se na comparação da diferença na acumulação de corantes nos corpos de animais não preparados versus groomed durante um período de tempo definido.

Resumo

O comportamento de limpeza de Drosophila é um programa complexo de locomotores multi-passo que requer movimento coordenado de ambas as pernas dianteiras e as patas traseiras. Aqui apresentamos um protocolo de ensaio de grooming e um novo design de câmara que é econômico e escalável para estudos de pequena ou grande escala de grooming de Drosophila . As moscas são espalhadas por todo o corpo com corante Amarelo Brilhante e tem tempo para remover o corante dos seus corpos dentro da câmara. As moscas são então depositadas em um volume definido de etanol para solubilizar o corante. A absorvância espectral relativa de amostras de colorante e etanol para animais preparados e não untados é medida e registrada. O protocolo produz dados quantitativos de acumulação de corantes para moscas individuais, que podem ser facilmente calculados em média e comparados em amostras. Isso permite que os projetos experimentais avaliem facilmente a habilidade de preparação para estudos de animais mutantes ou manipulações de circuitos. Este procedimento eficiente é versátil e escalável. Mostramos wFluxo de ork do protocolo e dados comparativos entre animais WT e animais mutantes para o Receptor de Dopamina Drosophila tipo I ( DopR ).

Introdução

Grooming em Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) é um comportamento inata robusto que envolve a coordenação de múltiplos programas motorizados independentes ¹ . As moscas da fruta limpam seus corpos de poeira, micróbios e outros agentes patogênicos que podem inibir a função fisiológica normal, como visão e vôo, ou levam a desafios imunes significativos. Na detecção e resposta a ambos mecânico ² e activação imunitária ^3, moscas repetitivamente esfregar as pernas em conjunto ou numa região do corpo alvo até que esteja suficientemente limpo e aparência progride para uma outra parte do corpo. As moscas realizam movimentos de limpeza em episódios distintos que ocorrem em grande parte nos padrões estereotipados ^{1 , 4} . Uma hierarquia comportamental torna-se aparente à medida que os sinais de grooming são priorizados. Circuitos e padrões de atividade foram identificados em suporte oModelo Fa que programas de limpeza na parte superior da hierarquia ocorrem primeiro e suprime sinais paralelos de áreas do corpo que são preparadas posteriormente ⁵ . A maior prioridade é dada à cabeça, depois ao abdômen, às asas e finalmente ao tórax ⁵ .

O programa de preparação em D. melanogaster é um sistema ideal para estudar circuitos neurais, sinais moleculares moduladores e neurotransmissores. Por exemplo, o comprometimento da função de neurofibromina ⁶ , a perda da proteína de retardamento mental frágil X de Drosophila ( dfmr1 ) ⁷ e a exposição ao bisfenol A (BPA) ⁸ causam grooming excessivo e outros comportamentos que são análogos aos sintomas humanos discretos de neurofibromatose, X frágil Síndrome e aspectos dos distúrbios do espectro do autismo e Transtorno de hiperatividade com déficit de atenção (TDAH), respectivamente. O comportamento de higienização também pode ser habituaDiferencialmente através de cepas mutantes ² , emprestando este programa motor a estudos de plasticidade comportamental. A amplitude dos fenômenos neurológicos que podem ser modelados pela Drosophila requer uma abordagem comparativa inovadora para medir a habilidade das moscas de se prepararem.

A ação combinada de transportadores de monoaminas vesiculares e a abundância relativa de dopamina e outras aminas biogênicas no corpo demonstraram mediar o comportamento de grooming da mosca da fruta ^{9 , 10} . A octopamina e a dopamina estimulam a atividade comparável de higienização na pastura traseira em moscas decapitadas, enquanto a tiramina, o precursor da octopamina, também desencadeia grooming em menor extensão ⁷ . Foram identificados quatro receptores de dopamina em D. melanogaster ^{11 , 12 , 13 , 14} . Ao usar o método de análise de grooming descrito neste protocolo, determinamos um papel para o DopR de Receptor de Dopamina da Família Tipo I ( DopR, dDA1, idiota ) no comportamento de grooming nas costas ¹⁵ .

O grooming pode ser indiretamente quantificado observando a extensão da limpeza pela qual um animal pode preparar-se completamente após o pó de todo o corpo com um tinte marcador ou pó fluorescente ^{5 , 16} . O restante de poeira deixada no corpo pode ser usado como marcador relativo para o comportamento geral. As moscas empoeiradas depois de terem dado tempo suficiente para o noivo podem estar manifestando um déficit específico no comportamento de preparação. À medida que as pesquisas de grooming se tornaram mais extensas, os protocolos incorporaram práticas como a decapitação para adicionar tratamentos farmacológicos aos nervos conectivos do pescoço ¹⁰ , estimulação tátil de cerdas para provocar a resposta de grooming ² ,E gravação de vídeo de comportamento ¹⁵ . A observação direta de grooming pode ser facilmente estudada usando observação visual e gravação manual da freqüência e duração de eventos específicos de grooming ⁴ .

Projetamos uma câmara de preparação de quinze poços que pode ser construída com uma impressora 3D ou cortador a laser, e os projetos de planos estão disponíveis para reprodução ¹⁵ . O design usa duas placas centrais juntas com aberturas combinadas e separadas por malhas e duas placas deslizantes superiores e inferiores, das quais moscas e / ou corantes são carregadas, respectivamente. Depois de permitir o tempo de moscas espumadas para o noivo, depositamos-os em etanol para solubilizar o corante e medimos a absorvância desta solução no comprimento de onda do corante. Um leitor de placas pode ser usado para múltiplas amostras paralelas ou um espectrofotômetro de leitura única pode ser usado para amostras individuais. Este método minimiza o erro induzido pelo manuseio e alBaixa para que os ensaios de limpeza sejam executados em uma escala menor e econômica. Este método é derivado e modificado a partir dos métodos iniciados por Julie Simpson e Andrew Seeds, que usam câmaras de grooming maiores com elementos de aquecimento para manipulações de circuitos sensíveis à temperatura ⁵ . O protocolo a seguir mostra a quantificação de grooming de todo o corpo, bem como mostrando métodos alternativos para a quantificação da acumulação de corantes em partes individuais do corpo. Também apresentamos dados de comparação de amostras entre mutantes WT e DopR , bem como métodos para calcular um índice de desempenho simples para o comportamento de higiene pessoal.

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Protocolo

1. Preparação

1. Prepare um aspirador para mover Drosophila ao vivo de um frasco de cultura para a câmara de preparação. Aspiradores permitem a transferência de animais conscientes para as câmaras comportamentais para garantir que a anestesia não afete a observação comportamental subsequente.
   1. Usando tesouras cortar 1,5 pés de ID de tubo de tygon ⅛ ", OD ¼". Cortar pelo menos 1 polegada fora da ponta de uma ponta de micropipeta descartable de 1 mL. Segure um pedaço de malha quadrada de 1 cm (abertura 0,196 polegada) sobre a ponta cortada.
      NOTA: A maioria das dicas de 1 mL possuem uma linha de gradação onde a ponta fica na caixa do pacote, tipicamente cortada naquela linha.
   2. Coloque uma ponta de micropipetas fresca de 1 mL sobre a ponta de malha / corte. Observe a malha de uma barreira apertada entre as duas pontas. O interior da nova dica cria uma câmara de espera para moscas.
   3. Corte a ponta extrema da nova ponta da micropipeta para ampliar a abertura o suficiente para permitir a passagem de uma única mosca. O holE combinará aproximadamente a abertura da câmara de preparação (aproximadamente 1,5-2 mm de diâmetro).
   4. Encaixe confortavelmente as dicas aninhadas no final da tubulação do tygon. Empurre as pontas no tubo para garantir um ajuste apertado para permitir a pressão de vácuo.
   5. Na outra extremidade da tubulação, corte a ponta de uma ponta de micropipeta de 200 μL e encaixe na extremidade cortada na tubulação. Este é o lado "boca" do aspirador.
2. Prepare tubos de alíquotas de pó. Pesar aproximadamente 5 mg de corante Amarelo Brilhante em papel de pesagem tarado. Despeje a poeira em um tubo de microcentrífuga de 0,6 mL e feche firmemente a tampa.
   NOTA: Recomendamos o uso de luvas de nitrilo durante a preparação de alíquotas, uma vez que algumas luvas de látex são permeáveis ​​ao corante.
3. Repita a etapa 1.2) para todas as amostras no experimento (uma para cada mosca em cada câmara).
4. Preparar tubos de etanol (EtOH): Pipetar 1 mL de EtOH 100% em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Rotule os tubos para genótipos ou condições.
5. Repita o passo 1.4) para todas as amostras no experimento (uma para cada mosca em cada câmara). Capa e salve os tubos de EtOH para completar o ensaio de limpeza. Inclua também pelo menos uma amostra "em branco", que será apenas 1 mL de EtOH sem mosca para controles negativos.
6. Montar cada câmara de limpeza, aparafusando a placa superior deslizante (com os orifícios menores), mas deixando a placa inferior (com os orifícios maiores) para a adição de poeira.
7. Coloque cada câmara de preparação necessária em uma mesa com a parte superior virada para baixo. O lado da entrada da mosca está virado para baixo.
8. Coloque 5 partes de alíquota de corante amarelo brilhante em cada câmara tocando o tubo contra a superfície da câmara acima do poço desejado. Toque na câmara contra a mesa para garantir que toda a poeira caia através da malha na placa superior.
9. Aperte a placa inferior em cada câmara, de modo que as extremidades mais largas das aberturas cônicas voltem para fora e os orifícios não descansem sobre os poços. Proteja o botTom prenda firmemente para que não deslize e solte o tinte.
10. Deslize a câmara e bata-a plana contra uma mesa algumas vezes para que a poeira caia através da malha para descansar na placa inferior.
11. Deslize a placa superior da câmara para a "posição aberta" para que os pequenos orifícios alinhem com os quinze poços, permitindo a introdução de moscas em poços individuais.

2. Fly-dusting e Grooming

1. Carregue uma mosca no aspirador da boca sugando suavemente uma extremidade do aspirador como se estivesse usando uma palha. Depure as moscas soprando levemente e direcionando a abertura em direção ao alvo.
2. Aspire uma mosca em cada poço usado para a experiência. Depois de carregar um poço, deslize a placa superior para que a mosca seja presa na câmara e coloque a fita sobre a abertura desse poço durante o carregamento de toda a câmara para evitar a fuga da mosca enquanto carrega outros poços. Se moscas múltiplas são aspiradas para um únicoBem, deixe essa abertura descoberta até que apenas uma mosca permaneça.
3. Depois de todos os poços necessários serem preenchidos com moscas, vire a câmara de modo que a placa inferior esteja para cima, de modo que a poeira tenha o potencial de revestir as moscas ao cair através da malha.
4. Fixe firmemente as placas superior e inferior apertando os parafusos e vorteie a câmara para esfolar as moscas por 4 s.
5. Bata a câmara (placa superior com a face voltada para baixo) contra uma mesa duas vezes para que o tinte caia para o outro lado. Em seguida, puxe a câmara para cima (placa superior virada para cima) e bata a câmara duas vezes para garantir que o corante se aplique no chão da câmara inferior longe da mosca na câmara superior.
6. Para o controle de moscas que não são permitidas para o noivo, avance imediatamente para a Etapa 3 do protocolo. Para as moscas que completarão o ensaio, vá para o Passo 2.7.
7. Descansa a câmara plana sobre uma mesa ou uma bancada com a placa superior para cima por trinta minutos para permitir que as moscas se preparem. Coloque o chambEm um espaço livre de vibração e ruído para manter seu ambiente constante para todos os experimentos de preparação (níveis de iluminação, umidade e temperatura). Uma incubadora de mesa à RT ou 25 ° C com controles de umidade é ideal.

3. Preparação de Amostras e Análise de Absorção

1. Mantendo o nível da câmara com a placa superior para cima, desenrosque suavemente a placa inferior e remova-a da câmara, tomando cuidado para não perder corante.
2. Coloque a câmara em uma almofada Fly CO ₂ com baixo fluxo de ar até que as moscas sejam anestesiadas.
3. Desaparafusar a placa superior da câmara. Use cuidadosamente fórceps para agarrar uma perna e mova uma mosca salpicada de cada câmara e deposite-a em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo EtOH. O tempo de transferência para 15 câmaras cada uma contendo uma mosca é de aproximadamente 3-5 min. Os experimentadores devem influenciar os tempos de transferência se / quando experimentos surpreendentes com múltiplas câmaras para assegurar o encaminhamento eficiente dos experimentos.
4. Uma vez que cada tubo de microcentrífuga contém 1 mosca, feche a tampa e inverta o tubo três vezes para agitar e misture a solução de corante e etanol.
5. Incubar tubos que contenham etanol e moscas durante 5 h à RT para garantir a remoção completa do corante da mosca em solução. Após as 5 h, vorteie brevemente cada tubo (2 s) para garantir a folga do corante das moscas.
6. Alíquota de 50 μL do tubo experimental de 1,5 mL em um poço de uma placa de 96 poços, se disponível, tomando nota da localização de cada amostra na placa. Adicionar 200 μL de EtOH para diluir a amostra 5x. A diluição evita os efeitos do teto das moscas muito espolvoreadas ou grandes defeitos de grooming.
7. Use um leitor de placas para analisar cada amostra a 397 nm. Alternativamente, mede a absorvância para amostras individuais e espaços em branco em um espectrofotômetro padrão no espectro visível se um leitor de placas não estiver disponível.
8. Leia e grave a amostra através do leitor de placas e salve a planilha com o recordeD amostras na placa.

4. Quantificação de Resultados

1. Compile resultados para todas as amostras e mede a variância para cada genótipo ou condição.
   NOTA: A acumulação de tintas no tempo 0 min e no tempo 30 min são consideradas como condições separadas usando análise estatística por ANOVA unidirecional e correção Bonferroni ou outras correções para comparações paralelas múltiplas.
2. Calcule a diferença de porcentagem de preparação para cada genótipo / condição usando a seguinte equação: [(valor médio de acumulação de corante no tempo 0 '- valor médio de acumulação de corante no tempo 30') / valor médio de acumulação de corante no tempo 0] x 100.
3. Expresse a porcentagem para cada genótipo e condição em parcelas de barras e compare em genótipos e condições.

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Resultados

O ensaio de limpeza produz dados quantitativos para avaliar o desempenho comportamental com base no restante relativo do corante acumulado deixado nos cadáveres das moscas após um tempo de medição para grooming (30 min). As imagens de amostra do design da câmara de limpeza deslizante e as principais etapas do ensaio são destacadas na Figura 1 . As moscas agregam uma quantidade significativa de corante do pó imediato por vortex na presença de corante ( Fig...

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Discussão

O ensaio de preparação é relativamente simples, mas advertimos os experimentadores a prestarem atenção especial às seguintes questões. Manter uma vedação apertada apertando os parafusos nas placas superior e inferior após a introdução de moscas e corantes é essencial para resultados reprodutíveis. O corante amarelo brilhante é muito fino e as juntas soltas permitirão perdas de corante das bordas da câmara. A irregularidade no teor de corante para cada poço poderia facilmente eliminar a quantificação ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
High-Flex Tygon PVC Clear Tubing	McMaster-Carr	5229K54	ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators
Micropipette tips (1 mL and 200 μL)	Genesee Scientific	24-165, 24-150R
Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6"	McMaster-Carr	9318T44	Used to construct grooming chamber and mouth aspirators
Dumont #5 Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-5050
Brilliant Yellow Dye	Sigma-Aldrich	201375-25G	we recommend use of nitrile gloves while handling this product
Vortexer	Fisher Scientific	12-812	set to "touch"
Ethanol	Carolina Biological Supply	86-1282
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR International	10025-726
0.65 mL microcentrifuge tubes	VWR International	20170-293	tubes can be reused with successive assays
UV 96-well plate	Corning	26014017
BioTek Synergy HTX Platereader	BioTek	need to download catalog to access product number	http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview
Gen5 Microplate Reader and Imager Software	BioTek
Microsoft Excel	Microsoft		https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)()
Drosophila Incubator	Tritech	DT2-CIRC-TK
1/4" acrylic plastic	McMaster-Carr	8473K341
8 - 32 nuts	McMaster-Carr	90257A009
8 - 32 x 1" hex cap screws	McMaster-Carr	92185A199	the bottom plate needs to be tapped for this size screw
8 - 32 x 1/2" hex cap screws	McMaster-Carr	92185A194	the second plate from the top needs to be tapped
2 - 56 3/8" flat head phillips machine screws	McMaster-Carr	91500A088	these hold the two middle plates together
0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe	McMaster-Carr	92510A044	Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws.  These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate