Intracelular Coloração e Citometria de Fluxo para identificar linfócitos subconjuntos dentro Murino Aorta, rim e linfonodos em um modelo de hipertensão

Resumo

Este artigo fornece metodologia detalhada para identificar e quantificar os subconjuntos de linfócitos T funcionais presentes dentro de rim murino, aorta e linfonodos por coloração intracelular e citometria de fluxo. O modelo de hipertensão induzida por angiotensina II foi escolhido para explicar, passo-a-passo, os procedimentos e os princípios fundamentais da citometria de fluxo e coloração intracelular.

Resumo

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases^1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension⁶. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention^1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

Introdução

Evidências recentes demonstram que o sistema imunitário adaptativo, em particular linfócitos T, desempenham um papel crítico no desenvolvimento de várias doenças cardiovasculares ^1,2,3,4,5. Por exemplo, no modelo de hipertensão induzida por angiotensina II, uma acumulação de células T nos vasos e nos rins de ratinhos foi descrito ^6. A acumulação vascular é predominantemente na adventícia ea gordura perivascular. No rim, as células T acumular tanto na medula e no córtex renal. Dependendo de qual subconjunto está envolvida, estas células T dar origem a diferentes citocinas que podem afectar a função renal e vascular e conduzem ao desenvolvimento da patologia (revisto por McMaster e col. ^6).

Linfócitos auxiliares T CD4 ⁺ pode ser dividido em vários sub-grupos: as células T auxiliares 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, células T reguladoras (Treg), e T auxiliares folicular (TFH) com base nas suas funções e cito assinaturakines ^7. Da mesma forma, as células T CD8 ⁺ citotóxicas podem ser classificados como Tc1, Tc2, Tc17 ou TC9 ^8. Existem também células T negativos duplos (isto é, células que não expressam o CD4 ou marcadores de células T CD8 +). Um subconjunto destas células possuem um receptor alternativo gama delta de células T (em vez de os receptores alfa e beta clássicos) e, portanto, são referidas como células T gama delta. A análise de múltiplos parâmetros por citometria de fluxo de marcadores de superfície, citocina e factor de transcrição constitui a melhor abordagem para identificar essas células. Embora este método é amplamente utilizado no campo da imunologia, que é menos bem descritas em órgãos sólidos e na configuração de doenças cardiovasculares.

Historicamente, a identificação de linfócitos nos tecidos foi limitado a imuno-histoquímica ou abordagens de RT-PCR. Apesar de imuno-histoquímica e imunofluorescência são poderosos métodos para determinar a distribuição nos tecidos de um antigénio de interest, eles são inadequados para identificar os subconjuntos fenotipicamente envolvidos. Além disso, enquanto que a análise de RT-PCR é útil para detectar a expressão de ARNm de antigénios, citoquinas ou factores de transcrição, que não permite a detecção de proteínas múltiplas simultaneamente ao nível de células individuais.

O advento de citometria de fluxo, especialmente quando combinado com a coloração intracelular para detectar citoquinas e factores de transcrição, fornece investigadores com uma técnica poderosa que permite a identificação e quantificação ao nível da célula individual de subconjuntos de células imunitárias em órgãos sólidos. Temos optimizado um ensaio de coloração intracelular para identificar por citometria de fluxo as principais subpopulações de células T presentes no interior do rim murino, da aorta e da aorta nódulos linfáticos de drenagem num modelo de hipertensão induzida por angiotensina II. A optimização de cada passo: digestão do tecido, a activação ex vivo, a permeabilização, e a superfície e os resultados da coloração intracelular em uma altamente reproduzível ensaio que pode ser aplicado a outros modelos de doenças cardiovasculares e renais.

Protocolo

Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Vanderbilt, aprovou os procedimentos aqui descritos. Os ratos são alojados e tratados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Academies Press. Revised 2010).

1. Isolamento da aorta Drenagem Linfática Nodes, rim e aorta de ratos

1. Eutanásia dos ratinhos por inalação de _CO2. Pulveriza-se a caixa com 70% de etanol e abrir cuidadosamente a pele e a parede do tórax com uma tesoura para expor o coração.
2. Para perfundir a vasculatura, executar uma pequena incisão no átrio direito e constante injectar, pelo menos, 10 ml de PBS frio (cerca de 1 ml / seg) na ponta do ventrículo esquerdo usando uma agulha G 21 ou 23. Perfundir até que todos os órgãos têm empalideceu. O coração empalidece em primeiro lugar. Descascamento do fígado indica que a perfusão foi bem realizada.
3. Usando pequenos pinça e tesouras finas, gentilmente cortar e retirar os intestinos,estômago, baço, pâncreas, fígado e para melhor visualizar a aorta.
   NOTA: Este passo tem de ser feito muito precisamente como lesão do tracto gastrointestinal pode provocar a contaminação.
4. Cortar e remover cada pulmão com uma tesoura. Lavar a cavidade torácica com salina tamponada com fosfato (PBS) utilizando uma seringa sem agulha. Retire o excesso de sangue e líquido com gaze estéril.
5. Retire os aorta abdominal linfonodos drenam usando uma pinça de dissecação finas. Certifique-se de não romper a cápsula. Remover a gordura restante sobre a superfície de cada nó de linfa com a pinça de dissecação. Cortar os dois rins com uma tesoura fina.
6. Dissecar toda a aorta (aorta torácica e abdominal) com finas tesouras, curvas. Comece a nível do coração e cuidadosamente dissecar longe do esófago e das vértebras para baixo para o nível da bifurcação ilíaca certificando-se de manter a gordura perivascular circundante ligada à aorta.
   NOTA: Além disso dissecção da aorta para remove estruturas circundantes pode ser feito sob um microscópio. Especificamente, remover ramos arteriais (artérias carótidas, artérias subclávia, celíaco, mesentérica, e artérias renais) e gânglios linfáticos. Do manter uma camada consistente de gordura perivascular ao redor de cada aorta uma vez que este é um local onde muitas células inflamatórias residem na configuração da hipertensão. Coloque cada tecido em tubos separados contendo frio PBS.

2. Produção de suspensões de células individuais a partir de cada tecido

1. os rins
   NOTA: O rim pode ser dissociadas numa suspensão de células individuais através da combinação de dissociação mecânica além de digestão enzimática.
   1. Preparar a solução de digestão rim, adicionando colagenase D (2 mg / ml) e DNase I (100 ug / ml) para meio RPMI 1640 (suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS)). Prepare 10 ml por amostra de rim.
   2. Utilize uma pinça para transferir os dois rins para um tubo contendo 10 ml de dissociação de rim digerirsolução de iões.
   3. Realizar a dissociação mecânica usando um dispositivo Dissociator semi-automática de acordo com as instruções do fabricante.
   4. Após dissociação mecânica, retire o tubo do dispositivo e realizar a digestão enzimática. Incubar as amostras durante 20 min a 37 ° C sob rotação constante. Imediatamente parar a digestão enzimática por adição de frio meio RPMI 1640 suplementado com 5% de FBS.
   5. Transferir a solução pipetando para um tubo de 50 ml, após filtração através de um filtro de 40 um. Provocar o tecido restante para além pressionando com o êmbolo de uma seringa de 1 ml. Agregar as células (500 x g, 8 min, 4 ° C).
   6. Ressuspender o sedimento em 3 ml de 36% de meio de centrifugação em gradiente de densidade. Transferir a suspensão para um tubo cónico de 15 ml. Com cuidado, adicionar 3 ml de 72% de meio de centrifugação de gradiente de densidade por baixo da suspensão de células de 3 ml de 36%, sem qualquer interrupção. Centrífuga (1000 xg sem travão, 20 min, 4 ° C).
   7. As células do sistema imunológico será localizada na interface. Retirar a camada amarelada de nível superior que contém os restos celulares e, em seguida, levar o volume até 15 ml usando frio PBS. Agite bem ao colapso do gradiente. Rodar as células (300 x g, 8 minutos, 4 ° C) e ressuspender o sedimento em 3 ml de meio RPMI com 5% de FBS. Contar o número de células vivas em um hemocitómetro utilizando exclusão com azul de tripano.
2. a aorta
   1. Preparar a solução de digestão aorta através da adição de colagenase A (1 mg / ml), colagenase B (1 mg / ml) e DNase I (100 ug / ml) para meio RPMI 1640 (suplementado com 5% de FBS).
   2. Utilizando finos fórceps, transferir a aorta para um tubo de 2 ml contendo 1 ml de solução de digestão aorta. Picar toda a aorta em pequenos pedaços com tesouras finas em solução de digestão de 1 ml. Manter em gelo. Incubar as amostras durante 30 min a 37 ° C sob rotação constante.
   3. Transferir a solução para um prato de cultura de tecido e interromper a enzymaTic digestão através da adição de 5 vezes o volume de RPMI frio com 5% de FBS.
   4. Transferir a solução pipetando para um tubo de 50 ml, após filtração através de um filtro de 40 um. Provocar o tecido restante à parte, a uma suspensão de célula única, pressionando com o êmbolo de uma seringa de 1 ml. Lave o filtro e agregar as células (300 x g, 8 minutos, 4 ºC).
   5. Lava-se a pelete por adição de 10 ml de RPMI com 5% de FBS. Rodar as células (300 x g, 8 minutos, 4 ° C) e ressuspender o sedimento em 3 ml de meio RPMI com 5% de FBS. Contar o número de células vivas em um hemocitómetro utilizando exclusão com azul de tripano.
3. Os linfonodos da aorta drenagem
   1. Coloque um filtro de 40 um num prato de cultura de tecidos (60 mm x 15 mm). Coloque os gânglios linfáticos na peneira e provocá-los à parte, a uma suspensão única célula, pressionando com o êmbolo de uma seringa de 1 ml. Lavar o filtro com 2 ml de RPMI com 5% de FBS. Recolher as células do prato.
   2. Transferiras células em um tubo falcon 15 ml e sedimentar as células (300 x g, 8 minutos, 4 ºC). Ressuspender o sedimento em 500 ul de meio RPMI com 5% de FBS. Contar o número de células vivas em um hemocitómetro utilizando exclusão com azul de tripano.

3. Ex Vivo Estimulação para Detecção de citocinas por citometria de fluxo

1. Prepara-se o meio de cultura celular: RPMI com FBS a 5%, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 50 uM β-mercaptoetanol e 1% de penicilina / estreptomicina.
2. Centrifugar cada suspensão de células obtida a partir dos nós renais, da aorta e da linfa (300 x g, 8 minutos, 4 ºC). Ressuspender cada pellet com o meio de cultura celular a uma concentração de 1 x 10 ⁶ culas por ml.
3. Estimular as células pela adição de 2 ul do cocktail de activação das células (contendo de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), ionomicina o ionóforo de cálcio, e o inibidor de Golgi Brefeldina A) por cada 1 ml de cultura de células.
   NOTA: A concentração finalS de cada um dos componentes são os seguintes: 81 nM de PMA, 1,33? M de ionomicina e 5 ug / ml de brefeldina A. O tratamento com PMA e ionomicina activa as células a produzir citocinas. As citocinas são proteínas secretadas que devem ser presos nas células a ser detectado. Brefeldina A faz com que a acumulação de proteínas secretadas normalmente no aparelho de Golgi e do retículo endoplasmático. Assim, a técnica aqui descrita reforça a detectabilidade de linfócitos produtoras de citocinas por citometria de fluxo.
4. Placa de 1 a 2 milhões de células em um de 12 poços (aorta ou rins) ou de 24 poços (linfonodo) placas de baixa aderência. Colocar a placa num incubador humidificado _{de CO2} a 37 ° C durante 3 h.
   NOTA: O número de células plaqueadas pode ser inferior em nódulos linfáticos de ratinhos de controlo. Além disso, o tempo de estimulação tem de ser determinado empiricamente para cada população de células e produção de citocinas em estudo. No caso de células T isoladas de nódulos da aorta, rim ou linfáticos, recomendamos estimulante durante 3 a 4 horas. A maior estimulação wdoente não aumentar a secreção de citocinas e vai induzir uma regulação negativa mais de vários marcadores de superfície de células T tais como CD3, CD4 e CD8. (Note-se que mesmo uma estimulação de 3-4 h irá induzir alguma regulação baixa destes marcadores.)

Coloração 4. Superfície

1. Transferir as células para um tubo de poliestireno de FACS e de centrifugação (300 x g, 8 minutos, 4 ° C). Lavar as células duas vezes com tampão de SCAF (Ca ²⁺ e Mg ⁺ livre de PBS contendo 4% de FBS e 2 mM de EDTA) e a suspensão de células dividir igualmente em diferentes tubos de FACS com base no número de painéis de anticorpos desejados e o número de tubos de controlo necessários ( ver abaixo).
2. Para efetuar a compensação para cada painel, preparar tubos de controlo não coradas e tubos manchadas individuais para cada tipo de tecido e painel de anticorpos. Além disso, preparar tubos de fluorescência menos um controlo (FMO) para cada painel de anticorpos por adição de todos menos um dos anticorpos.
3. Ajustar o volume de cada tubo a 2 ml com FACSAmortecedor. Centrifugar a suspensão de células (300 x g, 8 minutos, 4 ° C), remover o sobrenadante e receptores Fc bloco através da incubação das células com 0,5 ug de anticorpos anti-CD16 / CD32 por milhão de células durante 10 min em gelo.
   NOTA: CD16 é baixa afinidade do receptor IgG Fc III (FcR III) e CD32 é FcR II. CD16 / CD32 são expressos em granulócitos, mastócitos, monócitos / macrófagos, células assassinas naturais, células B, células dendríticas e algumas células maduras T activadas.
4. Realizar a coloração de viabilidade: Lavam-se as células com PBS 1x, de centrifugação (300 x g, 8 minutos, 4 ° C) e ressuspender em 1000 ul de 1x PBS. Adicionar 1 ml de um corante (mancha de viabilidade) amino-reactivo célula-impermeabilizante. Incubar durante 15 min a 4 ° C protegidos da luz.
5. Durante a incubação, preparar o cocktail de anticorpos (por coloração da superfície) num volume apropriado de tampão de FACS. Lavar as células duas vezes com 1-2 ml de tampão de FACS, de centrifugação (300 x g, 8 minutos, 4 ° C) e ressuspender cada sedimento com 100 ulda mistura de anticorpo. Incubar durante 30 min a 4 ° C protegidos da luz.
   NOTA: Para cada anticorpo citometria de fluxo, que é útil para determinar a quantidade óptima de anticorpo necessário, efectuando uma curva de titulação da dose.
6. Lavar as células duas vezes com 2 ml de tampão de FACS e sedimentar as células (300 x g, 8 minutos, 4 ° C).

5. Fixação, permeabilização e intracelulares Coloração

1. Realizar a coloração intracelular com um kit de fixação e permeabilização contendo tampões apropriados, seguindo as instruções do fabricante. Fix e permeabilizar as células por ressuspensão no tampão apropriado. Incubar as amostras durante 40 min a 4 ° C protegidos da luz.
2. Adicionar 1 ml de 1x permeabilização e de tampão de lavagem directamente para as células fixadas e permeabilizadas. Centrífuga (500 x g, 8 minutos, 4 ° C) e remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento com 2 ml de 1x tampão de lavagem.
3. Preparar as misturas de ANTIBodies (apenas para coloração intracelular) num volume apropriado de tampão de lavagem 1x (geralmente 100 uL por tubo).
   NOTA: Como descrito acima, a concentração óptima de anticorpo tem de ser determinado para cada anticorpo no painel. Por exemplo, para anticorpos para IL-17A ou IL-17F, usamos um factor de diluição de 1:30, mas para anticorpos anti-IFN-y e de T-bet, usamos um factor de diluição de 1: 100.
4. Centrifugar as células (500 x g, 8 minutos, 4 ° C) e ressuspender cada sedimento com 100 ul da mistura de anticorpo. Incubar durante 40 min a 4 ° C protegidos da luz.
5. Lavar as células duas vezes com 2 ml de tampão de lavagem 1x e sedimentar as células (500 x g, 8 minutos, 4 ° C). Ressuspender o sedimento com 300 ul de 1x tampão de lavagem e analisar num citómetro de fluxo com filtros adequados.
6. Para a quantificação do número total de células por amostra de tecido, utilizar pérolas de contagem. Antes da aquisição, adicione o volume / número recomendado de contagem contas para cada tubo.

6. Remuneração, Gating, Normalização e Dicas

1. Remuneração e gating
   1. Executar tubos de controlo coradas não coradas e individuais de compensação para ajustar a sobreposição espectral.
      NOTA: O uso de esferas de compensação ao invés de controles de compensação baseados em células é necessária nos casos em que o antigénio de interesse ou população de células em uma amostra está presente em níveis tão baixos que a compensação usando células será difícil. Também digno de nota, ao usar corantes em tandem, é aconselhável preparar compensações para cada experimento desde corantes em tandem variam muito-se muito e com cada dia.
   2. Execute fluorescência menos um controles (QOM) para todos os fluoróforos no painel quando se inicia um novo experimento multicolor.
      NOTA: Os controles FMO são amostras que contêm todos os anticorpos no painel com exceção de um. Estes controles permitem a discriminação precisa da positiva contra sinais negativos para o anticorpo omitiu Adjus adequadamentet dos portões. Estes controlos são particularmente importantes quando os níveis de expressão seja baixo ou quando a separação da população alvo é pobre (por exemplo, quando o alvo é uma citocina ou factor de transcrição). Apesar de não ser sempre necessário, em alguns casos, os controlos de isotipo podem ser preferidos em lugar de FMO controla uma vez que proporcionam compensação apropriada para o isotipo do anticorpo e conjugado de fluoróforo sem a especificidade do antigénio.
   3. Configurar o portão principal: ajuste Atacante Área Scatter (FSC-A) e Side Area Scatter (SSC-A) tensão, a fim de detectar a população de leucócitos.
   4. Excluir as células mortas.
      NOTA: A mancha de viabilidade reage com aminas livres presentes em ambas a superfície e o interior das células. Em contraste com células vivas, células mortas (com membranas comprometidas) permitir que o corante entrar no citoplasma, aumentando a quantidade de marcação de proteínas. Assim, as células mortas será mais brilhante do que as células vivas, permitindo a discriminação fácil. Porta nas vivocélulas.
      NOTA: A viabilidade das suspensões de células a partir da aorta e do rim pode ser menor do que a viabilidade das suspensões de células dos nódulos linfáticos, devido à etapa de digestão adicional.
   5. Lote Área Scatter (FSC-A) [eixo y] e Forward Scatter Altura (FSC-H) [eixo x]. Singlets aparecer como uma diagonal sobre este gráfico de pontos. Portão nesta diagonal para excluir dupletos. Em seguida, traçar SSC-A [eixo y] e CD45 [eixo-x].
   6. A população CD45 ⁺ de leucócitos pode ser facilmente identificado. Portão sobre esta população. populações subsequentes pode ser identificada a partir desta população.
2. A normalização da contagem de células
   1. colares de contas têm características que resultam em baixo SSC FSC e alta. Por exemplo, se 50.000 grânulos são adicionados a 300 ul da suspensão de células individuais, a equação para o cálculo do número absoluto de qualquer tipo de célula dar por tubo é como se segue:
      Número de células ptubo er = (50.000 / número de contas contados pelo citômetro de fluxo) x número de células contadas.
      Usando este cálculo, pode ser determinado o número absoluto de um determinado tipo de célula por tubo. Com base em quantas tubos foram gerados a partir de cada órgão, pode ser calculado o número de células por órgão.
      NOTA: Mantenha todas as células e reagentes a 4 ° C durante o protocolo. Evite vórtice vigoroso, pois pode danificar as células. Use forças mínimas para sedimentar as células. Evite fazer bolhas no tubo FACS, uma vez que podem precipitar a morte celular. Não deixe que as pastilhas de secar a qualquer momento.

Resultados

O protocolo descrito permite a identificação de marcadores de superfície e intracelulares em células T isoladas a partir de rim de murino, da aorta e da aorta nódulos linfáticos de drenagem num modelo de hipertensão induzida por angiotensina II. Os resultados representativos são apresentados abaixo.

A Figura 1 mostra a estratégia de propagação usados para identificar a população de células T numa...

Discussão

The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue⁹. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similar...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase D	ROCHE	11088882001
Collagenase A	ROCHE	10103586001
Collagenase B	ROCHE	11088815001
Dnase	ROCHE	10104159001
1x Red blood cell lysis buffer	eBioscience	00-4333-57
RPMI Medium 1614 1x	Gibco	11835-030
DPBS without calcium and magnesium	Gibco	14190-144
Percoll	GE Healthcare	17-5445-02	For density gradient centrifugation
GentleMACS™ C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS dissociator device	Miltenyi Biotec	130-093-235	Use the program SPLEEN_04
Cell activation cocktail (with Brefeldin A)	Biolegend	423303
anti-CD16/32	eBioscience	14-0161-81	dilute 1:100
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit	Life Technologies	L34955
Transcription factor buffer set	BD Pharmingen	562725
OneComp eBeads	eBioscience	01-1111-42
123 count eBeads	eBioscience	01-1234-42
CD45 AmCyan (clone 30-F11)	BioLegend	103138
CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2)	BioLegend	100218
IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1)	BioLegend	506910
IL-17F APC (clone 9D3.1C8)	BioLegend	517004
CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5)	BD Biosciences	560181
CD8 APC (clone 53-67)	eBioscience	17-0081-82
T-bet PE-Cy7 (clone 4B10)	BioLegend	644823
IFNγ FITC (clone XMG1.2)	BD Biosciences	557724