Análises celular linhagem e estudos da função de genes utilizando marcm Twin-ponto

Resumo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para uma técnica de marcação de mosaico que permite a visualização dos neurónios derivados de uma célula progenitora comum em duas cores distintas. Isso facilita a análise de linhagem neural com a capacidade de neurônios individuais-datando de nascimento e função do gene estudar nos mesmos neurônios de diferentes indivíduos.

Resumo

M osaic uma nálise com um r epressible c ell m arker (marcm) é um sistema de rotulagem mosaico positivo que tem sido amplamente aplicado em estudos neurobiológicos Drosophila para descrever morfologias intrincadas e de manipular a função de genes em subconjuntos de neurônios dentro de outra forma não marcado e imperturbável organismos. mosaicos genéticos gerados no sistema marcm são mediadas através de recombinação específica do local entre os cromossomas homólogos dentro de divisão de células precursoras para produzir ambos os clones (marcm) marcados e não marcados células filhas durante a mitose. Uma extensão do método marcm, chamado duplo-spot marcm (tsMARCM), etiquetas, tanto das células individuais derivadas de um antepassado comum com duas cores distintas. Esta técnica foi desenvolvida para permitir a recuperação da informação útil a partir de ambos os hemi-linhagens. Por abrangente análise de diferentes pares de clones tsMARCM, o sistema permite tsMARCM de alta resolução mappin linhagem neuralg para revelar o nascimento-ordem exacta dos neurónios marcados produzidos a partir de células progenitoras comuns. Além disso, o sistema também se estende tsMARCM estudos de função do gene, permitindo a análise fenotípica de neurónios idênticas de diferentes animais. Aqui, descrevemos como aplicar o sistema tsMARCM para facilitar estudos sobre o desenvolvimento neural em Drosophila.

Introdução

O cérebro, composta por um vasto número e diversos tipos de neurônios, dota animais com a capacidade de perceber, processar e responder aos desafios do mundo externo. Os neurónios do adulto de Drosophila cérebro central são derivados a partir de um número limitado de células estaminais neurais, chamados neuroblastos (RN), durante o desenvolvimento ^{1, 2.} A maioria dos RN participando de neurogênese cerebral em Drosophila sofrem divisão assimétrica para gerar RN auto-renovação e células-mãe gânglio (GMCS), e os GMCs seguida, passar por outra rodada de divisão para produzir duas células-filhas que se diferenciam em neurónios ³ (Figura 1A ). Devido à complexidade da morfologia neuronal e os desafios associados com a identificação de neurônios específicos, uma tecnologia positiva rotulagem mosaico, análise de mosaico com um marcador de células reprimível (marcm), foi inventada para permitir que o visualizatião de um único neurónio, ou um pequeno subconjunto de neurónios para fora da população de neurónios não marcados circundantes, ^4.

Marcm utiliza o sistema / alvo de reconhecimento da FLP (FRT) para mediar a recombinação específica do local entre os cromossomas homólogos dentro de uma célula precursora divisória transportando um alelo heterozigoto de um gene repressor, cuja expressão normalmente inibe a expressão de um gene repórter ⁴ flipase (FLP). Após a divisão mitótica, os cromossomas recombinantes são segregadas em células individuais, de modo a que uma célula contenha alelos homozigóticos do gene repressor e a outra célula não tem gene do repressor de expressão do repórter em que a célula (e seus descendentes) não é mais bloqueadas ^4. Três padrões clonais são normalmente encontrados em um experimento marcm quando FLP é estocasticamente induzida em RNs ou GMCs: clones de uma única célula e dois de células-GMC, que retratam a morfologia neuronal na Resolução de uma única célulan, e multi-celular-NB clones, que revelam padrões morfológicos inteiras de neurônios derivados de um NB comum (Figura 1B). A técnica marcm tem sido amplamente aplicado em estudos neurobiológicos Drosophila, inclusive na identificação do tipo neuronal para reconstruir redes de fiação em todo o cérebro, a linhagem neural análises para revelar a história do desenvolvimento dos neurônios, caracterização fenotípica das funções dos genes envolvidos na especificação do destino celular e morfogênese neuronal e diferenciação estuda ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Porque marcm convencional única de etiquetas uma das duas células filhas (e linhagens) após o evento mitótico recombinação induzida, informações potencialmente úteis a partir do lado não marcado está perdido. Esta limitação se opõe à aplicação do M básicaSistema ARCM a de alta resolução análises de muitas linhagens neuronais que mudar destinos celulares em tempo rápido ou precisão análises de funções de genes em neurônios idênticas de diferentes animais ^{11, 12.}

Cama local marcm (tsMARCM) é um sistema avançado que rotula neurónios derivados a partir de um antepassado comum com duas cores distintas, o que permite a recuperação de informação útil a partir de ambos os lados das células individuais, superando assim a limitação do sistema marcm inicial ¹¹ ( Figura 2A - 2C). No sistema tsMARCM, dois interferência de RNA (RNAi) -based eliminadores estão situados em locais de trans-cromossomas homólogos dentro de uma célula precursora, e a expressão dessas supressores independentemente inibir a expressão dos respectivos repórteres (Figura 2B). Na sequência específica do local recombinações mitóticas mediada através do sistema FLP / FRT, a twsupressores S baseado em RNAi ser segregados em células individuais para permitir a expressão dos repórteres distintos (Figura 2B). Dois padrões clonais, de uma única célula associada a clones de uma única célula e de duas células-GMC associados com clones multi-celular-NB, são tipicamente vistos em um experimento tsMARCM (Figura 2C). Informação derivada a partir de um lado das células individuais podem ser utilizados como a referência para o outro lado, permitindo-alta resolução analisa linhagem neural, tais como-datado de nascimento os neurónios marcados, e analisa fenotípica de neurónios idênticas em diferentes animais para a investigação exacta da função do gene neural ^{11, 12.} Aqui, nós apresentamos um protocolo passo-a-passo que descreve como realizar uma experiência tsMARCM, que pode ser utilizado por outros laboratórios para alargar os seus estudos de desenvolvimento neural (bem como o desenvolvimento de outros tecidos, se aplicável) em Drosophila.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Construir tsMARCM pronto Flies Usando o Requerido transgenes ^{11, 13}

1. Gerar a versão original de moscas tsMARCM-prontos de transgenes que são transportadas por moscas individuais ¹¹ (ver Tabela 1). Realizar esquemas de passagem padrão mosca genéticos, que foram descritas anteriormente, colocando vários transgenes nas mesmas populações de moscas ^13.
   1. Em uma linha progenitora, montar os transgenes de FRT ^40A, UAS-mCD8 :: GFP (o primeiro repórter, mCD8 :: GFP; a expressão do transgene está sob o controlo do promotor da sequência de activação a montante, que produz um repórter membrana-tethered aglomerado de diferenciação de rato 8 proteína de fusão com a proteína verde fluorescente), e UAS-rCD2RNAi (o supressor que inibe a expressão do segundo repórter; o ARNi contra a expressão do cluster do rato of diferenciação 2, rcd2) no braço esquerdo do cromossoma 2 ^nd. Lugar, colocar -GAL4 condutor no X ou 3 ^rd cromossoma, se possível, específico do tecido.
   2. No outro lado da linha parental, montar os transgenes de FRT ^40A, UAS-rCD2 :: RFP (o segundo repórter, rCD2 :: RFP, o outro repórter membrana-tethered consistindo de proteína rCD2 fundida com a proteína fluorescente vermelha) e UAS-GFPRNAi (o supressor que inibe a expressão de GFP mCD8 ::; a de ARNi contra a expressão de GFP) no braço esquerdo do cromossoma 2 ^nd. Coloque-choque térmico (hs) -FLP ou FLP tecido especificidade no X ou 3 ^rd cromossomo, se possível.
2. Gerar a nova versão de moscas tsMARCM-prontos de transgenes que são transportadas por moscas individuais ¹⁴ (ver Tabela 1). Realizar genética da mosca esquemas de passagem de padrão, que foram descritos Previously, colocando vários transgenes nas mesmas populações de moscas ^13.
   1. Em uma linha progenitora, montar os transgenes de um local DRF e UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (um transgene combinada de mCD8 :: GFP e o supressor que inibe a expressão de rCD2 :: RFP) juntos no mesmo braço de ^2º ou ^3º cromossoma (pares apropriados de transgenes de FRT e UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i são indicados na Tabela 1). Coloque condutor tecido-específicos por GAL4 em outras do que o cromossoma do local DRF escolhido, se possível cromossomas.
   2. No outro lado da linha parental, montar os transgenes de um local DRF e UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (o outro transgene combinada de rCD2 :: RFP e o supressor que inibe a expressão de mCD8 :: GFP) no mesmo braço do ^2º ou ^3º cromossómicas (pares apropriados de transgenes de FRT e UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi são indicados na Tabela 1). Coloque HS-FLP ou tecido-específicos de FLP em diferentes do cromossoma do local DRF escolhido, se possível cromossomas.

2. Cruz tsMARCM pronto voa para gerar tsMARCM Clones na sua descendência

1. Moscas Cruz tsMARCM-prontos juntos (por exemplo, colocar 10-15 moscas macho do passo 1.1.1 ou 1.2.1 e 20-30 fêmea virgem voa a partir do passo 1.1.2 ou 1.2.2 juntos) num frasco de fly-food com fresco pasta de levedura-made na parede do frasco.
2. Manter as moscas tsMARCM-prontos cruzadas a 25 ° C durante 2 dias para aumentar a probabilidade de acoplamento, antes de recolher ovos fertilizados.
3. transferir frequentes as moscas tsMARCM-prontos cruzados em frascos recém-Yeasted para evitar aglomeração (toque para baixo as moscas ou usar o dióxido de carbono para anestesiar as moscas para facilitar a transferência, manter não mais do que 80-100 ovos fertilizados em 10 mL fly-food vial para evitar demasiadas larvas eclodidas).
4. Culturas os animais tsMARCM (isto é, ovos fertilizados; um exemplo do genótipo de animais tsMARCM, como utilizados na Figura 3, é Hs-FLP ^[22], W / W; UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT ^40A , GAL4-GH146 / UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A; +; +) que foram colocados em frascos transferidos em série a 25 ° C até que elas se desenvolvem para a fase desejada (por exemplo, embriões, larvas, ou pupas).
5. Colocar os tubos transferidos que contêm animais tsMARCM no mesmo estágio de desenvolvimento para uma temperatura de 37 ° de banho C água para 10, 20, 30, 40, e 50 minutos para determinar o tempo óptimo de choque térmico que induz a expressão de FLP para gerar o clones tsMARCM de interesse. Pule esta etapa se FLP tecido especificidade está sendo usado no experimento tsMARCM (é preferível hs-FLP para a linhagem neural analisa; as razões para esta preferência foram previamente descritos ¹⁵).
   NOTA: Repita o passo 2,5 utilizando o tempo ideal de choque térmico em futuras experiências tsMARCM se mais clones tsMARCM de interesse são procurados; Geralmente, mais de expressão de FLP é induzida em HS-FLP ^[22] em comparação com HS-FLP ^[1] com o mesmo tempo de choque de calor.
6. Cultura dos animais chocados ao calor tsMARCM a 25 ° C até que tenham atingido o estágio de desenvolvimento apropriado e, em seguida, vá para a etapa 3.

3. Prepare-se, Stain, e cérebros Mount Fly Contendo tsMARCM Clones

1. Preparar pratos forceps de proteção. Misture parte A (30 g) e a parte B (3 g) do Kit de Elastómero de Silicone com carvão activado (0,25 g). Despeje a mistura em pratos adequados.
2. Dissecar larvas, pupas, ou cérebros adultos fora dos animais tsMARCM em 1X solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizando uma pinça sobre um prato de pinças-protecção visto através de um microscópio de dissecção. NOTA: Um protocolo para dissecção mosca cérebro tem sido descRiBED anteriormente ^16.
3. Fixar os cérebros voar em uma placa de ponto de vidro com 1x de PBS contendo 4% de formaldeído à temperatura ambiente durante 20 min. Processar os cérebros voar neste placa de ponto de vidro para o restante das etapas.
4. Lavar os cérebros mosca três vezes com 1% de PBT (1x PBS contendo 1% de Triton X-100) e lava-se três vezes durante 30 minutos cada um em 1% de PBT (enxaguar: remover PBT e adicionar novo PBT rapidamente; lavar: remover PBT, adicionar novos PBT, e incubar os cérebros da mosca no novo PBT utilizando um agitador orbital).
5. Incubar os cérebros voar com a mistura de anticorpos primários durante a noite a 4 ° C ou durante 4 h à temperatura ambiente. Um exemplo da mistura dos anticorpos primários é o anticorpo de rato anti-CD8 (1: 100), anticorpo de coelho anti-DsRed (1: 800), e o anti-anticorpo de ratinho Bruchpilot (Brp) (01:50) em 1% de PBT contendo soro de cabra normal a 5% (NGS).
6. Lavar os cérebros mosca três vezes com 1% de PBT e, em seguida lavar três vezes durante 30 minutos cada um com 1% de PBT.
7. Incubar os cérebros voar com a mistura de anticorpos secundários durante a noite a 4 ° C ou durante 4 h à temperatura ambiente. Um exemplo da mistura de anticorpos secundários é o anticorpo IgG de cabra anti-rato conjugado com corante fluorescente verde (1: 800), anticorpo anti-IgG de coelho de cabra conjugado com corante amarelo-fluorescentes (1: 800), e de cabra anti-ratinho anticorpos IgG conjugado com corante vermelho-distante-fluorescente (1: 800) em PBT 1% contendo 5% de NGS.
8. Lavar os cérebros mosca três vezes com 1% de PBT e, em seguida lavar três vezes durante 30 minutos cada um com 1% de PBT. Montá-los em um micro de slides com um reagente anti-têmpera. Coloque uma tampa de vidro micro no micro slide para cobrir e proteger o cérebro da mosca. Selar as bordas da lâmina de vidro tampa e micro micro usando unha polonês claro. Armazená-los montados e selados voar espécimes cerebrais a 4 ° C.

4. Tome-se, processar e analisar imagens fluorescentes de tsMARCM Clones

1. Capturar imagens fluorescentes de tsMARCM clones from as amostras criada no passo 3.8 utilizando o sistema de microscopia confocal de escolha.
2. Pilhas projeto de tsMARCM imagens fluorescentes confocal em bidimensional, achatada imagens usando o software de processamento de imagem fornecido com o sistema de microscopia confocal de escolha (ver Figura 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O e 3T - 3T para exemplos de achatada imagens fluorescentes confocal).
3. Contar o número de células dos lados multicelular-NB dos clones tsMARCM utilizando um software de processamento de imagem apropriado (por exemplo, a função "celular counter" no ImageJ ^17; ver Figura 3E, 3J, 3O, e 3T para exemplos da célula corpos de neurônios).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

O sistema tsMARCM tem sido usado para facilitar a linhagem neural análises e estudos da função gênica por recuperar informações importantes sobre os neurônios derivados do RN comuns. O sistema tem sido utilizado para identificar a maioria (se não todos) os tipos neuronais, determinar o número de células de cada tipo neuronal, e determinar a ordem de nascimento desses neurônios ^{11, 12, 18}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Passos críticos dentro do Protocolo

Passos 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5, e 3.2 são críticos para a obtenção de bons resultados tsMARCM. Condutores -GAL4 específicos de tecidos que não expressam GAL4 em progenitores neurais são preferidos para os passos 1.1.1 e 1.2.1. Evitar o excesso de aglomeração dos animais cultivadas em frascos fly-alimentares no passo 2.3. Porque a latência de indução, o nível de expressão de FLP após a choque térmico, e o tempo médio de divisão de pr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No. 1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25 °C
(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37 °C
(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., ImageJ)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones