Mesclando Ion polarização de concentração entre justapostos Troca Iônica Membranas para bloquear a propagação da Zona Polarização

Resumo

O protocolo para uma plataforma nova polarização da concentração de iões (ICP) que pode parar a propagação da zona de ICP, independentemente das condições de funcionamento é descrito. Esta capacidade única da plataforma encontra-se na utilização de fusão depleção de iões e de enriquecimento, que são duas polaridades do fenómeno ICP.

Resumo

O fenômeno de polarização concentração de íons (ICP) é um dos métodos mais prevalentes para pr�concentrado amostras biológicas baixa abundância. O ICP induz uma região não-invasivo para biomoléculas carregadas (isto é, a zona de depleção de íons), e as metas podem ser preconcentrados nesta limite da região. Apesar das elevadas performances de pré-concentração com ICP, é difícil encontrar as condições de funcionamento de zonas não-propagação de depleção de íons. Para superar esta janela operacional estreita, que recentemente desenvolveu uma nova plataforma para pré-concentração espaço-temporalmente fixo. Ao contrário dos anteriores métodos que utilizam apenas o esgotamento de iões, esta plataforma também utiliza a polaridade oposta da ICP (ou seja, o enriquecimento de iões) para parar a propagação da zona de depleção de iões. Ao confrontar a zona de enriquecimento com a zona de depleção, as duas zonas se fundem e parar. Neste trabalho, nós descrevemos um protocolo detalhado experimental para construir este platf ICP espaço-temporalmente definidaORM e caracterizar a dinâmica pré-concentração da nova plataforma, comparando-os com os do dispositivo convencional. perfis de concentração de iões qualitativos e respostas em tempo atual capturar com sucesso as diferentes dinâmicas entre o ICP resultante da concentração e do ICP stand-alone. Em contraste com o convencional que pode fixar a localização pré-concentração em apenas ~ 5 V, a nova plataforma pode produzir um plug-condensado alvo num local específico nas amplas gamas de condições de operação: tensão (0,5-100 V), a força iónica (1-100 mM) e pH (3,7-10,3).

Introdução

Ion concentração polarização (ICP) refere-se a um fenómeno que ocorre durante o enriquecimento de iões e depleção iónica numa membrana de permeabilidade selectiva, o que resulta numa queda de potencial adicional com gradientes de concentração de iões de ^{1, 2.} Este gradiente de concentração é linear, e torna-se mais acentuada como uma tensão mais alta é aplicada (regime óhmica) até que a concentração de iões na membrana se aproxima de zero (regime limitante). Neste estado limitada pela difusão, o gradiente (e correspondente fluxo de iões) tem sido conhecido por ser maximizada / ¹ saturado. Para além deste entendimento convencional, quando a tensão (ou corrente) é aumentada ainda mais, uma corrente overlimiting é observado, com zonas de depleção planas e gradientes de concentração muito afiadas no limite da zona ^{1, 3.} A zona plana tem uma concentração muito baixa de iões, mas condução de superfície, electro-osmoti C fluxo (EOF), e / ou instabilidade electro-osmótico promover o fluxo de iões e induzir uma corrente overlimiting ^{3, 4, 5.} Curiosamente, a zona de depleção plana serve como uma barreira electrostática, que filtra ^{6, 7, 8, 9} e / ou pré-concentrados de alvo ^{10, 11.} Uma vez que há uma quantidade insuficiente de íons para examinar as cargas de superfície de partículas carregadas (por eletroneutralidade satisfatória), as partículas não podem passar por esta zona de depleção e, portanto, alinhar a sua fronteira. Este efeito não-linear ICP é um fenômeno genérico em vários tipos de membranas ^{10, 11, 12, 13,}> 14 e geometrias ^{6, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21;} é por isso que os pesquisadores foram capazes de desenvolver vários tipos de filtração ^{6, 7, 8, 9} e pré-concentração ^{10, 11} dispositivos usando o ICP não-linear.

Mesmo com essa alta flexibilidade e robustez, ainda é um desafio prático para esclarecer as condições de funcionamento dos dispositivos ICP não-lineares. O regime não-linear do ICP rapidamente remove catiões através de uma membrana de permuta de catiões, o que faz com que o deslocamento dos aniões que se deslocam em direcção ao ânodo. Como umresultado, a zona de depleção plana se propaga rapidamente, o que é uma reminiscência de propagação de choque ^22. Mani et al. chamado esta dinâmica da deionização (ou esgotamento) chocar ^23. Para pré-concentrado para alvos a uma posição de detecção designado, evitando a expansão da zona de depleção de ião é necessária, por exemplo, através da aplicação de EOF ou fluxo orientado a pressão contra a zona de expansão ^24. Zangle et ai. ²² clarificados os critérios para propagação ICP num modelo unidimensional, e é altamente dependente da mobilidade electroforética ^{17, 18} a força iónica, pH ^25, e assim por diante. Isto indica que as condições de funcionamento apropriadas serão alterados de acordo com as condições da amostra.

Aqui, apresentamos o projeto detalhado e protocolos experimentais para uma plataforma nova ICP que pr�concentrados alvos dentro de um spatiotemporalmente posição ²⁶ definida. A expansão da zona de depleção de iões é bloqueada pela zona de enriquecimento de iões, deixando um tampão de pré-concentração estacionária numa posição atribuído, independentemente do tempo de funcionamento, a tensão aplicada, a força iónica e pH. Este protocolo de vídeo detalhada destina-se a mostrar o método mais simples para integrar membranas de permuta catiónica em dispositivos de microfluidos e para demonstrar o desempenho de pré-concentração da nova plataforma ICP em comparação com o convencional.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Fabricação de troca catiônica chips microfluídicos de membrana integrada

1. Preparação de mestres de silício
   1. Design de dois tipos de mestres de silício: um para padronização uma resina de troca catiônica e outro para a construção de um microcanal com polidimetilsiloxano (PDMS).
      NOTA: A geometria detalhe será descrito nos passos 1.3.1 e 1.4.1.
   2. Fabricar os mestres de silício usando um fotolitografia convencional ou de iões reactivos profunda gravura ^27.
   3. Silanizar os mestres de silício micropatterned com trichlorosilane (~ 30 mL) em um frasco de vácuo durante 30 minutos.
      CUIDADO: Triclorosilano é um líquido pirofórico que é inflamável e tem uma toxicidade aguda (inalação, ingestão oral).
2. Preparação de moldes PDMS
   1. Misture uma base de elastômero de silicone com um agente de cura em uma proporção de 10: 1 e coloque o copo com este PDMS não curado(30-40 mL para a replicação de microestruturas em um 4-silício em bolacha) em um frasco de vácuo durante 30 min para remover as bolhas.
      NOTA: A base de silicone contém oligómeros de siloxano que terminam com grupos de vinilo e de um catalisador à base de platina. O agente de cura contém reticulação oligômeros que têm três ligações silício-hidreto ^28.
   2. Verter o PDMS não curado dos modelos de silício, remover as bolhas com um ventilador, e curar o PDMS a 80 ° C durante 2 h num forno de convecção.
   3. Separar os PDMS curados dos mestres de silício e moldar correctamente o PDMS com uma faca (formas quadradas, como se mostra na Figura 2a-b, IV).
3. Padronização das membranas de permuta catiónica
   1. Cortar a metade do molde PDMS perpendicularmente aos dois microcanais paralelos e perfurar orifícios nas extremidades dos canais de PDMS com um perfurador de biópsia de 2,0 mm.
      NOTA: O molde PDMS para padronização da membrana seletiva cação tem dois parmicrocanais ALLEL (largura: 100 mm; altura: 50 mm; Interchannel distância: 100 um; Figura 1A). A forma original do molde pode ser imaginado por espelhamento do molde cortado ao longo da linha de corte. microcanais em forma de L são recomendados para perfurar os dois buracos sem sobreposição.
   2. Limpar uma lâmina de vidro e o molde PDMS com fita adesiva e um ventilador e colocar o molde sobre a lâmina de vidro para criar fixação reversível entre eles.
   3. De acordo com a técnica de modelação ²⁹ microfluxo, libertação ~ 10 mL de uma resina de permuta catiónica na extremidade aberta do canal que foi cortado no passo 1.3.1 (Figura 1B). Coloque a cabeça de seringa sobre os furos e puxar o êmbolo (setas pretas na figura 1b); uma suave pressão negativa vai puxar a resina de permuta de catiões, e a resina vai encher os dois canais.
      NOTA: Recomenda-se que a altura do microcanal é maior do que 1581; m, por causa da alta viscosidade da resina exige alta pressão para encher os canais. Por outro lado, é melhor do que a altura não exceda 100 um, porque a membrana selectiva de iões modelado irá tornar-se mais espessa do que 1 uM; uma membrana tal espessura pode criar um intervalo entre a membrana e o canal ¹³ de PDMS.
   4. Separe o molde PDMS sem tocar na resina modelado e colocar a lâmina de vidro sobre o aquecedor, a 95 ° C durante 5 minutos para evaporar o solvente na resina.
      NOTA: A espessura da membrana modelado é geralmente inferior a <1 uM. O molde é suavemente destacada pelo que articula-se o molde para o lado aberto (linha pontilhada e seta na Figura 1b). É melhor separar o molde inferior a 1 min após o enchimento da resina. Se o molde é separado de alguns minutos mais tarde, pode ser obtido membranas mais espessas, mas teriam uma forma côncava, devido ao efeito capilar.
   5. Retire o desnecessárioparte da membrana modelado com uma lâmina de barbear, fazendo duas separadas linha-padrões (Figura 1C).
      NOTA: O material de permuta de catião utilizada aqui tem grupos perfluorados, o que significa que o padrão não está fortemente ligado ao vidro. Portanto, o método de patins em linha simples pode facilmente remover a parte desnecessária da membrana.
4. Integração do microcanal e o substrato-padrão membrana
   1. Perfurar dois buracos nas extremidades dos microcanais e mais dois furos, onde os padrões de membrana vai ser localizadas após a colagem, o canal de PDMS ao substrato modelado-membrana fabricada no passo 1.3.
      Nota: O microcanal o PDMS tem um canal (largura: 50-100 uM; altura: 10 mm), mas está ligado às extremidades do canal vizinho (Figura 1D).
   2. Vínculo do microcanal PDMS ao substrato-padrão membrana imediatamente após o tratamento de plasma de oxigênio durante 40 s em 100 W e 50 mTorr.
      NOTA: Colocar a membrana modelado de modo perpendicular no meio do microcanal.

2. ICP pré-concentração

1. Preparação para o experimento
   1. Preparar várias soluções de teste, incluindo KCl 1-100 mM, NaCl a 1 mM (pH ~ 7), a mistura de NaCl a 1 mM e 0,2 mM HCl (pH ~ 3,7), a mistura de NaCl e 1 mM de NaOH a 0,2 mM (pH ~ 10.3), e 1 x solução salina tamponada com fosfato.
   2. Adicionar um corante fluorescente com carga negativa (~ 1,55 mM) às soluções de teste.
      NOTA: A concentração do corante adicionado deve ser muito menor do que os iões de sal (<10 um), de modo que os corantes carregadas não contribuem para uma corrente eléctrica ^{30, 31.}
   3. Carregar a solução amostra em um reservatório do canal e aplicar pressão negativa para o outro reservatório para encher o canal com a solução. Ligue os dois reservatórios hydrodynamically por releasing uma grande gota para eliminar o gradiente de pressão ao longo do canal (Figura 2a).
   4. Encher os dois reservatórios, que são ligados aos padrões de permuta catiónica, com soluções tampão (1 M de KCl ou de NaCl 1 M) utilizando uma seringa ou uma pipeta para compensar o efeito ICP nos reservatórios.
   5. Colocar os fios nos reservatórios, através das duas membranas estampados (ânodo sobre o reservatório de cátodo esquerda e à direita), e ligá-los com uma unidade de medição de fonte (Figura 2a).
2. A visualização do fenômeno ICP e ICP pré-concentração
   1. Carregar o dispositivo ICP num microscópio de epifluorescência invertida. Aplicar uma tensão (0,5100 V) e medir a resposta atual com uma unidade de medida de origem.
   2. Capturar imagens fluorescentes com uma câmara de dispositivo de carga acoplada e analisar a intensidade de fluorescência utilizando software de imagem ^32.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

As etapas de fabrico esquemático de um preconcentrator microfluidos integrado à membrana são mostrados na Figura 1. Uma descrição detalhada da invenção é dada no protocolo. Os desenhos e imagens de dispositivos do preconcentrator espaço-temporalmente definido ²⁶ são contrastados com os de um convencional preconcentrator ¹¹ (Figura 2). O fenómeno ICP na preconcentrator espaço-temporalmente defini...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Nós descrevemos o protocolo de fabricação e o desempenho de um preconcentrator espaço-temporalmente definida numa gama de tensão aplicada (0,5-100 V), a força iónica (1-100 mM) e pH (3,7-10,3), conseguindo um 10.000 vezes pré-concentração de corantes e proteínas dentro de 10 min. Como tal como dispositivos ICP anteriores, o desempenho pré-concentração torna-se melhor em maior tensão e na força iónica inferior. Um parâmetro adicional que pode considerar aqui é a distância entre duas membranas de permu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit	Dow Corning
Trichlorosilane	Sigma Aldrich	175552	Highly toxic
Nafion perfluorinated resin, 20 wt%	Sigma Aldrich	527122
Sodium chloride	Sigma Aldrich	71394
Potassium chloride	Sigma Aldrich	60121
Alexa Fluor 488 carboxylic acid, succinimidyl ester	Invitrogen	A20000
Isothiocyanate-conjugated albumin	Sigma Aldrich	A9771
Phosphate buffer saline, 1x	Wengene	LB004-02
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379
Epifluorescence microscope	Olympus	IX-71
Charged-coupled device camera	Hamamtsu Co.	ImageEM X2
Source measurement unit	Keithley Instruments	2635A
Covance-MP	Femto Science