A indução de uma resposta inflamatória em culturas primárias de hepatócitos de ratinhos

Resumo

Aqui, mostramos uma abordagem enzimática para isolar hepatócitos primários a partir de ratos adultos, e descreve-se a quantificação de uma resposta inflamatória por meio de ELISA e PCR em tempo real.

Resumo

O fígado desempenha um papel decisivo na regulação da inflamação sistêmica. Na doença renal crónica, em particular, o fígado reage em resposta ao meio urémico, o stress oxidativo, endotoxemia e a diminuição da depuração da circulando citocinas pró-inflamatórias através da produção de um grande número de reagentes de fase aguda. ferramentas experimentais para estudar a inflamação eo papel subjacente dos hepatócitos são cruciais para compreender a regulação ea contribuição de citocinas hepáticas a uma resposta de fase aguda sistêmica e um cenário pró-inflamatória prolongada, especialmente em um ambiente complexo, tais como doença renal crónica. Uma vez que o estudo dos mecanismos complexos de inflamação in vivo permanece um desafio, uso intensivo de recursos e geralmente requer a utilização de animais transgénicos, hepatócitos isolados primários fornecer uma ferramenta robusta para obter insights mecanísticos para a resposta de fase aguda hepática. Desde esta técnica in vitro apresenta custos moderados, alta reprodutibilidade e conhecimento técnico comum, hepatócitos isolados primários podem também ser facilmente usados ​​como uma abordagem de triagem. Aqui, nós descrevemos um método baseado em enzimática para isolar os hepatócitos primários de murino, e que descrevem a avaliação de uma resposta inflamatória nestas células usando ELISA e quantitativa PCR em tempo real.

Introdução

Doença renal crónica (IRC) pode ser definida como um estado de inflamação aguda e crónica ^1. Em pacientes com DRC, os níveis séricos do fator fosfatúrico hormona de crescimento de fibroblastos 23 (FGF23) aumentará progressivamente, a fim de manter a homeostase do fosfato sérico ^2. Níveis FGF23 soro aumentados estão independentemente associadas com morbidade e mortalidade cardiovascular entre os pacientes que estão começando o tratamento de hemodiálise ^{3, 4.} Além disso, vários estudos clínicos demonstraram uma correlação entre os níveis elevados e FGF23 níveis séricos de proteína C-reactiva (CRP), interleucina-6 (IL-6) e Tumor Necrosis Factor de α (TNFa) ^{5, 6.} Além disso, em um estudo experimental, que demonstraram recentemente que FGF23 pode ter como alvo directamente hepatócitos e causa uma resposta inflamatória, aumentando PCR e IL-6 Produção no fígado ^7. Assim, FGF23 pode atuar como um fator circulante que contribui para a inflamação sistêmica em CKD.

No início dos anos 70, os hepatócitos primários foram isolados e estudados pela primeira vez ^8. Desde então, as células hepáticas cultivadas primárias têm sido amplamente utilizados para examinar transformação metabólica, função hormonal, o metabolismo de drogas e toxicidade, bem como a imunidade e respostas inflamatórias ^{9, 10.} Protocolos anteriores descreveram-se principalmente o isolamento enzimático de hepatócitos primários a partir de tecido de figado humano ^{11, 12.} Enquanto um excelente modelo, este deixa de fora a possibilidade de estudar como a manipulação genética afeta os mecanismos de sinalização hepática complexos, bem como consequências funcionais sobre diferentes tipos de estímulos. No que se segue, descreve-se o isolamento de hepatócitos primários de murino. Notavelmente, o efeito de vários mediadores da resposta de fase aguda hepática, tais como lipopolissacáridos (LPS), IL-6 e FGF23 podem ser analisadas de uma forma fácil, rápida e reprodutível ^13.

Este trabalho apresenta um protocolo para o isolamento enzimático de hepatocitos de ratos adultos, e que demonstram que os indutores estabelecidos de inflamação, tais como LPS e IL-6, bem como novos mediadores inflamatórios, tais como FGF23, pode estimular directamente a expressão e secreção de citoquinas inflamatórias, tais como PCR e IL-6 em hepatócitos em cultura.

Protocolo

Todos os protocolos de animais e procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Miami Miller School of Medicine.

1. Preparação

1. Pré-aqueça meios de perfusão hepática e fígado digerir mídia em um banho de água a 37 ° C.
2. Configurar uma bomba de perfusão (30 mL / min). Cuidadosamente prefill o sistema de tubulação da bomba com a mídia perfusão hepática. Evitar as bolhas de ar no sistema e preparar o microscópio estereotáxica.
3. placas de cultura de células de revestimento usando colágeno tipo I, de acordo com o protocolo do fabricante.

2. A recuperação do fígado

1. Anestesiar o rato doador uso de oxigênio / inalação de isoflurano (isoflurano 4% / 2 L / min de oxigênio).
   1. Manter a anestesia de isoflurano, diminuindo a 2-2,5% ou por injecção de cetamina (100 mg / kg de peso corporal por via intraperitoneal) e xilazina (10 mg / kg de peso corporal intraperitoneally). anestesia isoflurano contínua é preferido, uma vez cetamina diminui a pressão sanguínea e pode causar hepatotoxicidade.
2. Coloque o rato anestesiado numa almofada absorvente. Fix extremidades do rato com fita adesiva.
3. Raspar e desinfectar o abdome do mouse e realizar uma laparotomia ventral do púbis até a fronteira cranial do fígado usando uma tesoura cirúrgica com pontas afiadas / contundentes. Faça uma incisão na parede abdominal para ambos os lados, caudal do diafragma.
4. Expor a veia cava inferior (IVC), movendo cuidadosamente o intestino para o lado direito. Dissecar cuidadosamente tecido adiposo em torno do IVC usando cotonetes de ponta de algodão estéreis e uma pinça de ponta em ângulo.
5. Faça uma incisão na membrana suprahepática e abrir a cavidade torácica por duas incisões laterais usando finas tesouras cirúrgicas com pontas afiadas / afiadas. Ligadura da VCI torácica usando seda cirúrgica (5/0).
6. Canular da VCI infra usando um cateter iv blindado, retire cuidadosamente a agulha,ligar a bomba de perfusão e começar a perfusão do fígado. Se realizada corretamente, o fígado deve começar imediatamente a branquear e swell.
7. Transecto da veia porta permitindo a drenagem adequada dos meios de comunicação de sangue e de perfusão usando finas tesouras cirúrgicas.
8. Perfundir fígado, com aproximadamente 30 ml de fígado meios de perfusão, e depois mudar para o fígado digerir media (30 mL). Desligue a bomba de perfusão e retire a cânula, uma vez perfusão for concluída.
9. Com cuidado, expor a região central do fígado e localizar o tecido de ligação que liga os lobos hepáticos. Agarrar as fibras de conexão central e dissecar cuidadosamente todos os tecidos que prendem o fígado no lugar e retire cuidadosamente o fígado.
10. Imediatamente transferir o fígado para um tubo cónico de polipropileno de 50 ml contendo 15 ml de meios de fígado digerir.
    NOTA: Não há nenhuma linha de tempo específico para esta etapa. Após a perfusão, o fígado continua em media Digest para o transporte de uma capa de cultura de células estéril. tudo éubsequent passos devem ser realizados num ambiente estéril.

3. Isolamento e tratamento de células

1. Num capuz de cultura de células, transferir o fígado a partir do tubo de polipropileno de 50 mL cónico contendo meio de digestão em uma placa de cultura de tecido estéril.
2. Utilizando fórceps estéreis, gentilmente rasgar as quatro lóbulos do fígado. Se realizada corretamente, médio digestão deve tornar-se turva devido ao isolamento de hepatócitos do fígado.
3. Utilizando um ponta de pipeta 25 mL estéril, filtrar o meio de digestão turva através de um coador de células de nylon de 70? M para um novo tubo cónico de polipropileno de 50 ml para remover as partículas de tecido não digerido e os detritos celulares.
4. Repita os passos 3.2 e 3.3 com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Isto auxilia na remoção de quaisquer residuais hepatócitos do fígado.
5. Centrifugar a 50 xg durante 2 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante contendo excesso de detritos celulares e as células suavemente em 25 mL de 1x frio re-suspenderWilliams 'Medium E.
6. Utilizando um ponta de pipeta 25 mL estéril, filtrar a re-suspensão através de um novo filtro de células de nylon de 70? M para um tubo de 50 mL de polipropileno cónico para alcançar uma suspensão mais limpo.
7. Repita os passos 3.5 e 3.6 para três lavagens adicionais usando fria Williams 'Medium E 1x para obter uma suspensão de células claras.
8. Após o passo de lavagem final, o sobrenadante aspirado para remover o excesso de restos de células. Re-suspender e células de filtro em 25 mL Williams quente "Mídia E 1x que contém o descongelamento de hepatócitos primários e suplementos chapeamento através de um novo filtro de células de nylon de 70 mm em um tubo de 50 mL de polipropileno cónico.
9. Contagem de células no seio da suspensão de células de 25 ml, utilizando um hemocitómetro. Em média esperar 15 - 20 milhões de células por fígado adulto. Determinar a viabilidade celular utilizando coloração com azul de tripano.
10. células da placa em 2 mL de Williams do meio E 1x que contém o descongelamento de hepatócitos primários e suplementos um plaqueamento em colagénio revestido ce 6 poçoscluster de cultura LL (9 x 10 ⁵ células por poço).
11. Após 4 h, alterar mídia para Williams 'Mídia E 1x que contém suplementos de manutenção de hepatócitos primários.
12. Após 24 h, soro privar as células com meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) meios 1x durante 6 h.
13. Tratar as células com PBS como veículo, FGF23 (25 ng / mL), LPS (100 ug / ml) ou IL-6 (50 ng / mL) em meio isento de soro e incubar durante 24 h.

4. Isolamento de ARN

1. Prepare ARN utilizando um kit comercial coluna de centrifugação de acordo com as instruções do fabricante.

5. cDNA Geração de RNA isolado por transcrição reversa

1. Adicionou-se 200 ng de ARN isolado da amostra a um tubo de PCR.
2. Adicionar 14 mL de livre-endonuclease _H2O a PCR tubo a partir do passo 5.1.
3. Adicionar 4 uL de transcriptase reversa para o tubo de PCR a partir do passo 5.1.
4. Re-suspender conteúdos delicadamente para fazer mistura homogénea; centrifugar suavemente.
5. Coloque tubo de PCR contendo a mistura em um termociclador. termociclador correr para a transcrição reversa: 1 ciclo de 25 ° C (5 min), 42 ° C (30 min), 85 ° C (5 min) e, em seguida, manter a 4 ° C. O produto final será o ADNc desejado.

6. A análise das células por Quantitative PCR em tempo real (qPCR)

1. Preparar a placa de 96 poços.
   1. Coloque todos os componentes de reacção em gelo qPCR: 1 uL de ADNc, 0,25 uM iniciador directo, iniciador reverso 0,25? M, 5 uL SYBR Green, 3,5 pL de PCR água grau de pureza para um volume total de 10 ul. Usando SYBR Green, preparar mistura principal para executar todas as amostras em triplicado.
   2. Uma vez que a mistura principal está completo, vortex para fazer homogênea. Aliquota 9 mL de qPCR mistura principal em cada poço de uma placa de 96 WLL. Depois, adicionar cuidadosamente 1 mL de ADNc em cada poço. o volume total da reacção irá tornar-se 10 ul.
   3. Após o carregamento está completo, selar placa de 96 poços com ópticopelícula adesiva e placa de 96 poços brevemente centrifugação (50 x g durante 1 min).
2. As amostras são executados em um instrumento Real-Time PCR. Coloque selado placa de 96 poços em instrumento Time-PCR real e as amostras são executados conforme as recomendações do fabricante do instrumento. Exemplos de ciclos normais e rápidos estão incluídas abaixo.
   1. Para os parâmetros de ciclagem padrão, utilizar o seguinte: desnaturação inicial a 94 ° C durante 120 s, depois 40 ciclos de 94 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 60 s, e em seguida, opcionalmente segurar a 4 ° C.
   2. Para os parâmetros de ciclagem rápidas: usar o seguinte: desnaturação inicial a 94 ° C durante 30 s, depois 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s, 58 ° C durante 15 s, e em seguida 72 ° C durante 10 s.
3. Consulte o manual do instrumento para obter orientação sobre como analisar dados.

7. Análise de sobrenadantes celulares por ELISA

NOTA: Todos os passos são realizados de acordo com o protocolo do fabricante.

1. Preparação de amostra
   1. Dispensar 398 ul de diluente em tubos separados. Pipeta 2 mL da amostra de sobrenadante celular para dentro do tubo 398 ul de diluente. Isto irá proporcionar uma dobra de diluição de 200.
   2. Repetir o passo 7.1.1 para cada amostra a ser testada.
2. Procedimento
   1. Pipetar 100 L de 200 vezes da amostra diluída e um padrão para as cavidades de uma placa de 96 poços.
   2. Incubar a placa de 96 poços a 25 ° C durante 45 min num agitador de microplacas a 150 rpm.
   3. Lavar os poços 5 vezes com solução tampão de lavagem 1x. Uma vez que a última lavagem é concluída, remover qualquer Solução de Lavagem residual com papel absorvente.
   4. Adicionar 500 uL de reagente HRP-conjugado em cada poço.
   5. Repita os passos 7.2.2 - 7.2.3.
   6. Pipetar 100 L de tetrametilbenzidina (TMB) do reagente em cada poço de placa de 96 poços.
   7. Misturar suavemente placa de 96 poços, a 25 ° C durante 20 min numa microplacaagitador a 150 rpm. Parar a reacção por adição directa de 100 ul de solução de paragem a cada poço e agitar suavemente. Uma vez que a solução de paragem é adicionado a cor deve virar amarelo. Este informa que a solução de parada foi correctamente misturados.
   8. Utilizando um leitor de placa de microtitulação, determinar a densidade óptica a 450 nm, dentro dos primeiros 5 min.
3. Cálculo dos resultados
   1. Calcular uma tabela de valores de absorvância média (A ₄₅₀₎ para cada amostra e cada padrão.
   2. Montar uma curva padrão representando graficamente a _A450 média de cada padrão contra a sua concentração padrão em ng / mL num gráfico linear. Permitir que o eixo-x para representar a concentração e o eixo-y para representar um ₄₅₀ valores.
   3. Utilizando a média ± ₄₅₀ de cada amostra diluída para determinar a concentração da proteína desejada em ng / ml a partir da curva padrão.
   4. Multiplicar a concentração da amostra pelo facto de diluiçãor. Isto irá permitir a determinação da concentração real da proteína desejada na amostra de sobrenadante celular.
   5. Traçar a tabela construída a partir de amostras em um gráfico de linha. Se os valores de _DO450 cair fora da curva padrão, as amostras devem ser adequadamente diluídas e re-testado.
   6. Normalizar os resultados para 500.000 células.

Resultados

Histologia

As imagens de microscopia de luz representativas de células isoladas e cultivadas primárias estão representados na Figura 1A. Análise imunocitoquímica demonstra que hepatócitos isolados altamente expressar albumina (vermelho), bem como do receptor de factor de crescimento de fibroblastos 4 (FGFR4) (verde). Os núcleos são corados com 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (azul). (Fi...

Discussão

Isolamento de hepatócitos primários a partir de ratinhos é uma ferramenta rápido, barato e fiável para estudar as respostas inflamatórias ex vivo. Se realizado corretamente, os resultados podem ser facilmente gerada e reproduzida de forma atempada e eficiente. Os seguintes pontos devem ser cuidadosamente avaliada, a fim de garantir um isolamento bem sucedido.

A incisão cirúrgica ea canulação da VCI deve ser realizada sob anestesia geral e não após a eutanásia. Um invest...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer	Falcon	352350
BD Insyte Autoguard	BD	381412
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352098
100 6-inch Cotton Tipped Applicators	Puritan	806-WC
1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2	Becton Dickinson	329420
Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style	Corning	353003
6 well Cell Culture Cluster	Costar	3516
5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards)	LOOK	SP115
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Minipuls 3 Perfusion Pump	Gilson	F155007
Hemacytometer Kits, Propper	VWR	48300-474
Hemacytometer Cover Glasses, Propper	VWR	48300-470
Surgical Scissers - Sharp/Blunt	F.S.T.	14001-12
Iris Scissors-ToughCut Straight	F.S.T.	14058-11
Dumont SS-45 Forceps	F.S.T.	11203-25
Student Tissue Forceps	F.S.T.	991121-12
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetic acid solution, 2.0 N	Sigma	A8976-100ML
Isoflurane, USP 250 mL	Piramal Healthcare	66794-013-25
KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL)	VEDCO	50989-161-06
Xylazine 100 mg/mL	AnaSed Injection	139-236
Willams' Medium E (1x)	gibco	12551-032
Liver Perfusion Medium (1x)	gibco	17701-038
Liver Digest Medium (1x)	Life Technologies	17703034
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements	Life Technologies	CM3000
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements	Life Technologies	CM4000
Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4	ThermoFisher scientific	10010031
Collagen Type 1	Corning	354236
Trypan Blue Solution	VWR	45000-717